CN114836440B - 水稻叶色调控基因af1及其应用 - Google Patents

水稻叶色调控基因af1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻叶色调控基因AF1及其应用。本发明提供了一种水稻叶色的调控基因AF1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该基因编码蛋白位于叶绿体中，通过和PYG7互作调控PSI组装实现水稻叶色的调控，可以作为标记用于水稻分子育种，对于水稻分子育种有着重要的意义。

Description

水稻叶色调控基因AF1及其应用
技术领域
本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻叶色调控基因AF1及其应用。
背景技术
叶片是绿色植物光合作用的重要场所，叶色突变通常会改变叶绿素含量，影响光合速率，改变植物产量，甚至会导致植株死亡。目前，研究表明水稻叶色的发育受到不同通路的调控。首先，叶绿素合成与降解途径受阻会影响水稻叶色发育。OsCAO1和OsCAO2编码叶绿素a加氧酶，OsCAO1基因突变会使叶绿素b合成受阻，导致叶色变浅；YGL1编码叶绿素合成酶，该基因突变造成叶绿体发育不全和类囊体膜形成延迟，导致叶色异常呈黄绿色。Mg螯合酶是叶绿素合成过程中的一个关键酶，OsCHLH是水稻中第一个克隆的基因，它编码了Mg螯合酶的H亚基，该基因突变后引起植株白化；LYL1编码牻牛儿基还原酶，参与水稻叶绿素合成的最后一步，其突变体的表型为黄叶。NYC1基因是叶绿素降解必须的基因，它编码一个叶绿素b还原酶，该基因突变使得nyc1突变体在衰老期仍然保持绿色。其次，叶绿体分化和发育受阻也会影响水稻叶色发育。V4基因编码一个位于叶绿体的PPR蛋白，V4基因受低温胁迫发生变异，导致叶绿体发育受损，使得v4突变体植株呈黄色。YSA基因编码一个位于叶绿体的PPR蛋白，含有16个串联的PPR基序，对调控叶绿体发育有重要作用，其突变会导致水稻幼苗白化。Kusumi等鉴定了水稻早期白化突变体v1，该基因编码叶绿体定位蛋白NUS1，NUS1参与叶绿体RNA的代谢调控过程，在核糖体RNA转录调控过程起重要作用。第三，叶绿体蛋白转运受阻也与水稻叶色发育相关。OsABCI7基因编码一个叶绿体定位的ABC转运蛋白，由于该基因发生突变，水稻cnl1突变体植株主要呈现出叶片萎黄的性状。此外，质核信号传导途径受阻往往也会影响叶色发育。Kong等鉴定了一个黄绿叶突变体ygl8，YGL8基因编码一个镁原卟啉IX单酯环化酶的催化亚基，镁原卟啉IX是四吡咯合成的中间产物，而四吡咯生物合成是反馈核基因表达的途径之一。Rey(k2)编码一个磷酸果糖激酶B型叶绿体蛋白，参与核质信号的传递，其突变导致水稻叶片黄化。
尽管已有众多水稻叶色调控基因被克隆，但叶绿素代谢、光合作用、光形态建成以及细胞衰老和死亡是一个及其复杂的过程，受到核基因和自身质体基因组的共同调控。因此挖掘新水稻叶色突变体，克隆其调控基因对揭示叶绿素代谢、光合作用、光形态建成以及细胞衰老和死亡等方面的分子机理具有重要的意义；同时可作为优良的种质资源和筛选标记，在育种中发挥重要作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻叶色调控基因AF1及其应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种水稻叶色调控基因AF1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还涉及一种水稻叶色调控基因AF1构建的重组表达载体。
本发明还涉及水稻叶色调控基因AF1的反向序列和互补序列。
本发明还涉及水稻叶色调控基因AF1、AF1构建的重组表达载体、AF1反向序列、以及AF1互补序列在水稻分子育种中的应用。
本申请的发明过程为：本申请发明人，从EMS诱导的籼稻西农1B突变体库中筛选出一个叶色发育突变体af1，表现为整个生育期叶色变淡的表型，且叶绿素含量极显著低于野生型。不同温度实验处理结果表明af1是一个低温敏感型突变体。透射电镜观察发现af1叶片叶绿体内类囊体结构与野生型不同。图位克隆和互补验证结果表明LOC_Os05g45030为AF1的目的基因，且定位于叶绿体中，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其3’UTR区域上有一个C碱基到T碱基的替换，导致降低了其mRNA的稳定性。通过氨基酸序列分析，表明AF1编码一个PSI(光***I)组装蛋白。通过膜***酵母双杂、双分子荧光互补实验以及Pull-down实验发现AF1和PYG7互作，从而对PSI的组装起到重要作用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种水稻叶色的调控基因AF1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白如SEQ ID No.2所示。该基因位于叶绿体中，通过和PYG7互作调控PSI组装实现水稻叶色的调控，可以作为标记用于水稻分子育种，对于水稻分子育种有着重要的意义。
附图说明
图1为野生型与af1在不同时期的表型和叶绿素含量；其中，A-C为野生型和af1在苗期、分蘖期和成熟期的表型；D-F为野生型与af1在三个时期的叶绿素含量测定；
图2为不同温度下野生型与af1的表型和叶绿素测定；其中，A为不同温度处理下野生型和af1表型比较；B-E为不同温度下的叶绿素含量测定；
图3为苗期突变体af1和野生型(WT)的叶肉细胞结构；
图4为AF1基因的图位克隆；A为AF1基因的精细定位；B为互补转基因植株表型及叶片透射电镜观察；C为互补转基因植株包含突变位点部分序列；D为叶绿体含量测定；
图5为3’UTR突变导致AF1 mRNA稳定性下降；其中，A为野生型和突变体叶片中AF1的表达量；B为野生型和突变体中PSA3蛋白含量；C、D为荧光素酶实验验证检测野生型和突变体3’UTR的转录活性；E、F为正常的AF1 cDNA超表达载体分别转入野生型和突变体的转基因植株及其对应的叶绿素含量；
图6为AF1基因的表达模式分析；其中，A为AF1在不同组织中的表达；B-C为AF1在叶片中的表达；D为AF1在4℃低温下不同时间的表达；E为AF1在叶片中的原位杂交分析；SB表示茎尖基部；L4表示第四片叶；L2表示第二片叶；L3L表示第三片叶二分之一处下基部；L3U表示第三片叶上半部；
图7为AF1编码蛋白分析；其中，A为AF1进化树分析；B为不同长度的AF1融合蛋白构建在水稻原生质体中的GFP信号；AF1全长包括271个氨基酸；
图8为AF1和PYG7互作；其中，A为膜***酵母双杂验证AF1和PYG7互作；pBT3-STE-AF1和pOst1-NubI作为阳性对照，pBT3-STE-AF1和pPR3-N作为阴性对照；B为双分子荧光互补实验(BiFC)验证AF1和PYG7互作；C为Pull-down实验验证AF1和PYG7互作；D为PYG7组织特异性表达分析；
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
一、突变体的发现和表型鉴定
(1)突变体的发现
申请人从EMS诱导的籼稻西农1B突变体库中筛选出一个叶色发育突变体af1。野生型植株在正常生长发育过程中表现为绿叶，与野生型相比，突变体表现出全生育期叶色变淡，呈黄绿色。
(2)叶绿素含量研究分析
光合色素含量可直接或间接影响植株叶片的颜色，因af1突变体在整个生育期呈黄绿色，所以在苗期、分蘖期和抽穗期分别对野生型和af1突变体的叶片进行叶绿素含量测定。结果显示，在测定的各个时期突变体af1叶片的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量和类胡萝卜素含量较野生型均极显著降低(P<0.01),表明af1突变体黄绿表型叶是由其叶片光合色素含量降低引起(图1)。
(3)表型表达和叶绿素含量与温度的关系研究
进一步在20℃、25℃、30℃的条件下，研究表型表达和叶绿素含量与温度的关系。结果显示，30℃条件下，突变体与野生型叶色相差不大，但随着温度降低，突变体表型转变为更加明显的浅绿叶。此外，测定了叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及总叶绿素含量。结果表明随着温度下降，突变体叶绿素含量均低于野生型。由此，推断af1受低温的诱导，为低温敏感型叶色突变体(图2)。
(4)透射电镜观察研究
为进一步分析AF1缺失而导致的叶片黄化现象是否因为叶片叶绿体发育受阻引起的，通过透射电镜分别观察了苗期突变体和对应野生型之间相同叶龄和叶位的叶片超薄切片(图3)。结果发现突变体和野生型之间的叶片叶绿体数目无明显差别。然而，相比野生型叶片叶绿体内结构清晰、紧密垛叠的类囊体基粒片层结构，突变体叶片叶绿体内的类囊体基粒结构松散且垛叠的基粒片层数量明显减少，基粒片层结构变得模糊不清。此外，相较于野生型，突变体叶片叶绿体的嗜锇小体显著增多。表明AF1在调控叶绿体类囊体膜的生物合成和基粒片层建构起重要作用。AF1缺失导致叶绿体类囊体基粒片层膜结构缺陷，进而导致其叶片黄化现象。
二、AF1图位克隆
利用缙恢10号与af1作为亲本构建的F2群体，共1200株突变表型植株，用于基因定位。在F2群体中分别选取10株正常株和10株黄绿叶突变株，用于构建正常基因池和突变基因池，选用本实验室保存的400对均匀分布于水稻全基因组的SSR引物对缙恢10号和af1进行多态性分析，相关引物信息如表1所示。结果显示，位于第5染色体上的两个引物ZTQ48和RM3664在基因池间存在多态性，进一步利用F2群体中的70株隐性单株验证，发现两个标记与突变位点连锁，因此初步将目的基因定位在ZTQ48和RM3664之间，目标基因与这两标记的遗传距离分别为23.86cM和21.59cM。在初步定位的区间内，进一步开发具有多态性的SSR和InDel引物，最终将AF1定位在标记InDel4和InDel5之间，物理距离为40kb(图4A)。根据国家水稻数据中心(https://www.ricedata.cn/gene)提供的基因注释信息，该区间共有16个注释基因。
表1引物对信息
Figure BDA0003679171080000041
Figure BDA0003679171080000051
测序分析显示，在af1突变体中LOC_Os05g45030基因的3’UTR区域上有一个C碱基到T碱基的替换(图4A)，该基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白氨基酸序列如SEQID No.2所示，通过编码蛋白氨基酸序列分析，该编码蛋白为一个PSI组装因子蛋白。
构建互补载体，转化af1突变体愈伤组织，获得阳性转基因植株，与突变体比较，阳性转基因植株的叶片颜色恢复为正常绿色，与野生型叶色相同；透射电镜结果显示，与突变体比较，阳性转基因植株叶绿体发育正常，与野生型类似(图4B，C)。通过对野生型、af1突变体以及阳性转基因植株进行叶绿素含量测定，结果显示，与突变体相比，阳性转基因植株的叶片各叶绿素含量均恢复为野生型水平(图4D)。以上实验确定LOC_Os05g45030为AF1目的基因。
三、3’UTR的突变减弱了mRNA的稳定性
检测AF1在野生型和突变体叶片中的表达水平，发现AF1在突变体叶片中的表达量显著低于野生型(图5A)。进一步采用免疫印迹法分析野生型和突变体中AF1蛋白的含量，结果显示与野生型相比，突变体中AF1蛋白含量显著下降(图5B)。
将野生型和突变体的3’UTR转录融合至荧光素酶(LUC)的3’端进行了荧光素酶实验。结果发现，野生型3’UTR转化的水稻原生质体荧光素酶活性明显低于对照，而突变体3’-UTR转录活性极显著低于野生型(图5C、D)。进一步，构建正常的AF1 cDNA超表达载体，并分别转入野生型和突变体植株。结果发现，相较于野生型，转入正常的AF1 cDNA阳性转基因植株(AF1OE-WT-1)叶色略微加深，叶绿素含量增加(图5E)；相较于af1突变体，转入正常的AF1cDNA阳性转基因植株(AF1OE-af1-1)叶色恢复正常野生型绿色表型，叶绿素含量与野生型类似(图5F)，这说明正常的AF1 cDNA能使突变体恢复表型。综上，突变体中AF1基因3’-UTR的突变降低了其mRNA的稳定性。
四、AF1的表达模式分析
通过qRT-PCR分析来确定AF1的表达模式。AF1在根、茎、叶、叶鞘和穗中均有表达，但在叶片中表达量最高(图6A)。有研究发现，当第三片叶片完全从鞘中出现时，该芽含有第四至第七未成熟叶。第三叶上半叶(L3U)和第三叶下半叶(L3L)的叶片细胞均含有成熟叶绿体，而茎基部(SB)和第四叶下半部分(L4)含有成熟叶绿体。进一步通过qRT-PCR分析确定AF1在茎基部(SB)、第四叶(L4)、第二叶(L2)、第三叶下半叶(L3L)和第三叶上半叶(L3U)中的表达量，结果显示在这些部位普遍表达，但在L3L中检测到的含量最高(图6B，C)。因为af1是一个低温敏感型突变体，将突变体置于4℃的低温条件下进行处理，之后检测AF1在不同时间的表达，发现处理6h后表达量最高(图6D)。
为了更详细的分析AF1的表达模式，通过原位杂交技术检测茎尖分生组织(SAM)纵向和横向的AF1信号表达(图6E)。首先，在SAM中观察到强信号(图6E1)。接下来，在P2原基中检测到均匀分布的信号(图6E2)。在P3原基中，AF1信号集中分布在维管束原形成层和叶原基的边缘部分(图6E2)。在P4原基中，AF1信号主要分布在维管束(图6E3)，且木质部和韧皮部都有表达(图6E4)。因此，AF1在叶片中的表达模式说明了，AF1可能参与叶片的发育。
五、AF1蛋白功能分析
在Phytozome中选择了玉米(Zea mays)、番茄(Solanum lycopersicum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、杨树(Populus trichocarpa)、高粱(Sorghum bicolor)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)等物种与AF1蛋白序列进行blast比对，利用MEGA构建***发育树(图7A)。***发育树结果表明，AF1基因广泛存在于双子叶植物、单子叶植物、藓类植物以及藻类植物中，并且表现出高度的同源性，这表明水稻中的AF1基因可能是由藻类进化而来。
为了验证AF1是否定位于叶绿体，在CaMV35S启动子的驱动下，将AF1的完整CDS融合到GFP的N端，在水稻原生质体中瞬时表达了结构体(图7B)。OsAF1-GFP融合蛋白确实定位于叶绿体。并且，通过ChloroP预测得出AF1含有叶绿体转运肽。因此，通过截短结构物来分析叶绿体转运肽，OsAF11-38aa和OsAF139-271aa。亚细胞定位结果显示，OsAF11-38aa定位于叶绿体中。
六、AF1编码蛋白与PSI组装蛋白互作研究
图位克隆预测显示AF1编码蛋白为PSI组装蛋白。为了分析AF1与其他PSI组装蛋白的作用，通过TMpred网站(https://ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)对水稻AF1蛋白进行跨膜结构域分析，结果显示AF1蛋白可能镶嵌在膜上。因此，利用膜***酵母双杂实验对AF1与其它PSI组装相关蛋白进行互作分析。结果表明AF1与PYG7互作(图8A)。此外，通过双分子荧光互补实验(BiFC)结果进一步验证了AF1与PYG7互作(图8B)。最后利用Pull-down互作实验再次验证了AF1与PYG7互作这一事实(图8C)。此外，qRT-PCR分析发现，PYG7在所有组织中均有表达，但在叶片中表达量最高，该表达模式与AF1的表达模式类似(图8D)。上述实验结果说明了AF1可能通过和PYG7互作在PSI的组装中发挥作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西南大学
<120> 水稻叶色调控基因AF1及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1541
<212> DNA/RNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
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agatgtgcta ggaaggtcag ctatcgtagg gaaatagaaa tcagcataga ttgcaagttt 1320
gcgacacagt tgacgcaggc caaacaatgg tctcggttca ttagaattgc aatgtgagtg 1380
agctcagaac cttgtaagat gaagttgtac gttgtgacat gctcagaaaa tgtctactgc 1440
tacagtactt tttaatgcta catgtgttta ctaagaataa aaatgtaaca gacgtggcat 1500
cgtttaagat ggcaaaacca acaggtgcat tactttctac t 1541
<210> 2
<211> 271
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 2
Met Gly Thr Leu Pro Val Ala His Arg Phe Ser Leu Ala Ser Ala Phe
1               5                   10                  15
Leu Pro Arg His Arg Arg Pro Ser Pro Ser Ala Pro Asn Arg Arg Arg
            20                  25                  30
Arg His Gly Thr Val Val Ala Tyr Met Glu Pro Asn Pro Asn Ser Pro
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ala Gly Arg Leu Ile Gly Ala Leu Pro Val Val Gly Leu
    50                  55                  60
Val Ala Arg Ile Leu Ser Asp Glu Gly Gly Val Gly Gly Asp Met Ile
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Glu Phe Arg Arg Arg Val Ser Lys Lys Cys Thr Val Met
                85                  90                  95
Asp Ser Gln Ala Phe Tyr Asp Phe Asn Glu Arg Arg Gly Lys Ala Gly
            100                 105                 110
Asp Pro Phe Tyr Val Leu Leu Cys Cys Trp Leu Ala Ala Val Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Leu Leu Lys Thr Glu Glu Ile Leu Glu Gly Val Ala Arg Leu Arg
    130                 135                 140
Leu Ser Asn Asp Ile Glu Phe Glu Glu Glu Thr Phe Leu Asp Met Met
145                 150                 155                 160
Lys Thr Ala Lys Glu Lys Arg Ala Lys Leu Lys Ala Pro Ala Pro Gln
                165                 170                 175
Ile Pro Met Glu Ala Arg Ala Glu Lys Ala Leu Glu Ala Ile Tyr Val
            180                 185                 190
Cys Cys Phe Gly Gln Asp Met Val Glu Asp Val Asp Val Lys Leu Leu
        195                 200                 205
Cys Lys Met Leu Asn Ala Val Phe Pro Ser Val Gly Arg Gln Ala Val
    210                 215                 220
Glu Arg Ile Val Thr Ser Met Ala Lys Gln Val Ala Ala Gly Glu Arg
225                 230                 235                 240
Lys Gly Pro Gly Val Lys Thr Val Ser Lys Glu Ala Ala Gln Arg Gln
                245                 250                 255
Leu Lys Asp Leu Glu Phe Leu Lys Gln Asn Lys Leu Asp Ser Ala
            260                 265                 270

Claims (5)

1.水稻叶色调控基因AF1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述水稻叶色调控基因AF1构建的重组表达载体。
3.权利要求1所述水稻叶色调控基因AF1的反向序列。
4.权利要求1所述水稻叶色调控基因AF1的互补序列。
5.权利要求1所述水稻叶色调控基因AF1、权利要求2所述重组表达载体、权利要求3所述反向序列、权利要求4所述互补序列在水稻分子育种中的应用。
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