CN114831990A - 青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体公开了本发明所述的青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用，具体是青藤碱通过激活Nrf2/ARE通路，促进抗氧化酶表达发挥抗线粒体损伤，改善帕金森运动功能药物组合物中的应用。本发明实验研究证实，青藤碱能够用于治疗帕金森病，一定浓度的青藤碱能够有效的激活Nrf2/ARE通路，促进抗氧化酶表达发挥抗线粒体损伤，改善帕金森运动功能。

Description

青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用

【技术领域】

本发明属于医药技术领域，具体涉及青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用。

【背景技术】

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经***变性疾病，老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7％。大部分帕金森病患者为散发病例，仅有不到10％的患者有家族史。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。导致这一病理改变的确切病因仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。

帕金森是仅次于阿尔茨海默病的第二大神经退行性疾病，该病以运动功能障碍为主。目前多使用多巴胺制剂进行治疗，但长时间的多巴胺治疗会导致运动并发症如症状波动、异动症等，亟需新的治疗药物。

线粒体损伤被认为是帕金森的主要发病机制之一。Nrf2-ARE信号通路是最重要的抗氧化通路，该通路产生的HO-1等抗氧化酶能够清除线粒体产生的过多活性氧，保护线粒体并维持其功能。

综上，探索疗效好而副作用小的帕金森病的药物是研究的热点。现有技术中未见青藤碱在制备帕金森病药物中的用途或如何治疗帕金森病的相关报道。

【发明内容】

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，本发明提供了青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用，具体是青藤碱通过激活Nrf2/ARE通路，促进抗氧化酶表达发挥抗线粒体损伤，改善帕金森运动功能药物组合物中的应用。本发明实验研究证实，青藤碱能够用于治疗帕金森病，一定浓度的青藤碱能够有效的激活Nrf2/ARE通路，促进抗氧化酶表达发挥抗线粒体损伤，改善帕金森运动功能。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用，具体是青藤碱通过激活Nrf2/ARE通路，促进抗氧化酶表达发挥抗线粒体损伤，改善帕金森运动功能药物组合物中的应用。

在本发明中，进一步说明，所述药物组合物是以青藤碱为主要成分，加上药学中可接受的辅料或辅助性成分制备成临床上可接受的药物制剂。

在本发明中，进一步说明，所述药物制剂包括片剂、胶囊、注射剂或粉剂。

在本发明中，进一步说明，所述青藤碱在药物组合物中的含量为2.5mg/kg～40mg/kg。

在本发明中，进一步说明，当药物组合物应用于人类上时，根据动物与人类的体表面积比，所述青藤碱在药物组合物中的含量为0.6mg/kg～10mg/kg。

在本发明中，进一步说明，所述青藤碱在药物组合物中的含量为5mg/kg～20mg/kg。

在本发明中，进一步说明，当药物组合物应用于人类上时，根据动物与人类的体表面积比，所述青藤碱在药物组合物中的含量为0.8mg/kg～5mg/kg。

通常而言，作为药物，均是在制备成制剂后才临床应用。本发明所述的药物组合物，作为药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明药物组合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。

本发明药物组合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、***、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明药物组合物可以制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药***。为了将本发明药物组合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂可以是水、乙醇、异丙醇等；黏合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、***胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明药物组合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明药物组合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明药物组合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明药物组合物的胶囊剂。

为将本发明药物组合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明所述的青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用，通过实验发现青藤碱能明显降低阿朴***所导致的转圈行为，且能增强6-OHDA处理后SY5Y细胞的活性，与增强纹状体内Nrf2、HO-1转录水平；很明显通过研究可知，青藤碱通过激活Nrf2/ARE通路，促进HO-1等抗氧化酶表达发挥抗线粒体损伤的作用，最终改善帕金森运动功能，具有良好的临床应用前景。

【附图说明】

图1为本发明大鼠阿朴***诱导转圈行为学的影响统计图。N＝6,*与模型组比较，P<0.05；#，与假手术组比较,P<0.05。

图2为本发明的大鼠行为学悬挂试验掉落潜伏期统计图。N＝5,*与模型组比较，P<0.05；#，与假手术组比较,P<0.05。

图3为本发明中不同浓度的青藤碱对SY5Y细胞的活性影响图。*与模型组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.01，N＝2。

图4为本发明Nrf2、HO-1mRNA的PCR定量图。#，与模型组比较，P<0.05；*，与假手术组比较,P<0.05，N＝3。

图5为本发明Nrf2、HO-1Western Blot蛋白定量图。A为代表图，B为定量结果。#，与模型组比较，P<0.05；*，与假手术组比较,P<0.05，N＝3。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例：

青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用：

1.帕金森大鼠模型制作

取出实验大鼠称重，腹腔注射***麻醉后，剪去大鼠头部毛发，将其头部固定在立体定向器上，进行皮肤消毒后，剪开头皮，去除组织膜。定位至右侧纹状体，坐标为相对于前囟AP:-1.0mm,DL:3mm，用电动颅骨钻钻开颅骨，将注射器定位至硬膜下4mm，注射6-OHDA 4μg/μL*2μL，给药速度为1μL/min，注射结束留针5分钟后，缓慢下针至6mm再注射2μL，留针5分钟后，缓慢拔针，进行缝合，用碘酒消毒，注射青霉素防止伤口感染，再将大鼠放回笼内，清醒后继续喂养。

2.实验动物分组

假手术组，

模型组：腹腔注射生理盐水，

低剂量组：腹腔注射青藤碱10mg/kg，

中剂量组：腹腔注射青藤碱20mg/kg，

高剂量组：腹腔注射青藤碱40mg/kg，

提前一周给药，造模后1周进行后续实验，

阳性药组：美多芭，在行为学测试前1周给药。

3.行为学检测

旋转行为学检测，用阿朴***(APO)(0.05mg/kg)皮下注射诱导大鼠发生旋转，记录其30分钟内旋转圈数及旋转方向。

悬挂行为检测，将大鼠依次悬挂于铁丝上，记录大鼠从开始悬挂至掉落的时间，重复3次，取平均值。

4.细胞实验

将SH-SY5Y细胞置于培养板上，24h后更换一次培养液，加入不同浓度的青藤碱，在含5％CO₂的湿润无菌环境下，放于37℃的孵箱中静置培养8h。再加入6-OHDA 100μM刺激SH-SY5Y细胞24h。用CCK8试剂盒检测细胞活力。

5.RT-PCR法mRNA检测

取动物纹状体组织，用TRIZOL提取总RNA，反转录为cDNA后进行RT-PCR设计合成Nrf2，HO-1引物，以β-actin或GADPH作为内参基因，使用ABI-7300仪器进行Realtime-PCR。目标之间的扩增效率和内参基因相比使用ΔΔCT计算，目标基因的平均含量用2^-ΔΔCT表示。

6.Western Blot蛋白含量检测

取实验大鼠纹状体组织，加入蛋白裂解液，充分匀浆后在冰上裂解30min，将裂解混合物转移至1.5ml的EP管中，4℃、12500rpm、离心15min，取上清液保存于冰上。用BCA试剂盒蛋白定量，取相同质量的蛋白上样，SDS-PAGE蛋白分离，PVDF膜转膜，5％脱脂牛奶室温下封闭1h，加入一抗(抗Nrf2，HO-1抗体)，4℃过夜，加入相应二抗室温孵育1h，用ECL试剂显色、拍照。

7.试验结果

7.1青藤碱对大鼠行为学的影响

假手术组、模型组、美多芭组、青藤碱低剂量组、青藤碱中剂量组、青藤碱高剂量组产生的转圈行为中，旋转圈数分别为0、407.8、272.5、219.5、267.2、297.0圈/30分钟，很明显青藤碱给药组与模型组相比，青藤碱低剂量组、青藤碱中剂量组、青藤碱高剂量组均能够显著降低阿朴***所导致的转圈行为。说明了采用青藤碱给药能够显著降低阿朴***所导致的转圈行为，减轻6-OHDA所导致的神经功能损伤。

从图2中的悬挂试验掉落潜伏期看，假手术组、模型组、美多芭组、青藤碱低剂量组、青藤碱中剂量组、青藤碱高剂量组的大鼠悬挂潜伏期分别为10.2、6.6、14.2、16.8、12.8、13.0分钟，很明显，青藤碱低剂量组、青藤碱中剂量组、青藤碱高剂量组相比模型组，悬挂潜伏期显著的提高，有统计学意义(P<0.05)。

7.2细胞活力检测

从图3看，当青藤碱浓度在1μm、2.5μm、5μm时，与模型组比较能显著提高SH-SY5Y细胞活力，有统计学意义(P<0.05)；当青藤碱浓度在10μm、15μm、20μm时，与模型组比较能显著提高SH-SY5Y细胞活力，有统计学意义(P<0.01)。

7.3 Western Blot蛋白含量检测

从图4中看，与模型组相比，给予20mg/kg青藤碱后能增强纹状体内Nrf2、HO-1转录水平，有统计学意义(P<0.05)。

7.4 Western Blot蛋白含量检测。

从图5的A、B图中看，与模型组相比，给予20mg/kg青藤碱后能增强纹状体内Nrf2、HO-1蛋白表达水平，有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，青藤碱能明显降低阿朴***所导致的转圈行为，延长悬挂试验掉落潜伏期，且能增强6-OHDA处理后SY5Y细胞的活性，与增强纹状体内Nrf2、HO-1转录与蛋白水平。通过研究可知，青藤碱通过激活Nrf2/ARE通路，促进HO-1等抗氧化酶表达，从而发挥抗线粒体损伤作用，最终改善帕金森运动功能，具有良好的临床应用前景。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是对于本领域的普通技术人员来说在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干变形和改进这些都属于本发明的保护范围。因此本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用，其特征在于：青藤碱通过激活Nrf2/ARE通路，促进抗氧化酶表达发挥抗线粒体损伤，改善帕金森运动功能药物组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用，其特征在于：所述药物组合物是以青藤碱为主要成分，加上药学中可接受的辅料或辅助性成分制备成临床上可接受的药物制剂。

3.根据权利要求1所述的青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用，其特征在于：所述药物制剂包括片剂、胶囊、注射剂或粉剂。

4.根据权利要求1所述的青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用，其特征在于：所述青藤碱在药物组合物中的含量为2.5mg/kg～40mg/kg。

5.根据权利要求1所述的青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用，其特征在于：当药物组合物应用于人类上时，根据动物与人类的体表面积比，所述青藤碱在药物组合物中的含量为0.6mg/kg～10mg/kg。

6.根据权利要求1所述的青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用，其特征在于：所述青藤碱在药物组合物中的含量为5mg/kg～20mg/kg。

7.根据权利要求1所述的青藤碱在制备治疗帕金森病药物组合物中的应用，其特征在于：当药物组合物应用于人类上时，根据动物与人类的体表面积比，所述青藤碱在药物组合物中的含量为0.8mg/kg～5mg/kg。

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