CN114807210B - 一种基于细胞质线性质粒的t7表达***及其在酵母中表达蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于细胞质线性质粒的T7表达***，所述T7表达***包含T7RNA聚合酶、T7转录单元、细胞质线性质粒，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成，该***可用于酵母中持续、稳定、高效地表达蛋白，所述线性质粒来自真核生物细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于细胞质线性质粒的T7表达***，所述T7表达***包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元、细胞质线性质粒，该***可用于酵母中持续、稳定、高效地表达蛋白。
背景技术
T7***来自于大肠杆菌T7噬菌体，是一套非常强大的转录***，该***主要由T7RNA聚合酶和其特异性识别的由T7启动子启动转录的转录单元构成。目前在原核生物中对T7表达***的应用已经非常成熟，但在真核生物尤其是酿酒酵母中构建能够持续、稳定、高效地表达蛋白的T7表达***仍然受到限制，这主要是因为真核生物核转录的mRNA面临着出核的问题，其mRNA具有结构特殊性。
真核生物mRNA的5′端存在帽子结构(7-甲基鸟核苷三磷酸，m7Gppp)，3′端存在多聚腺苷酸(poly(A))尾巴。5′端帽子结构能够被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合，m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5′末端，以保护mRNA免受5′核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定性，参与mRNA由细胞核向细胞质基质转运的过程。3′多聚腺苷酸尾巴除了在维持mRNA稳定性和翻译起始中发挥一定作用外，也是mRNA由细胞核进入细胞质基质所必需的元件，能够大大提高mRNA在细胞质基质中的稳定性(参见，非专利文献1)。
但是在原核生物细胞中，转录和翻译发生在同一细胞空间内，且转录和翻译过程几乎同步进行，通常并不存在转录后加工的过程。因此，来自于大肠杆菌T7噬菌体的T7表达***，作为原核宿主来源的表达***，其转录产物不存在5′端帽子和3′多聚腺苷酸尾巴结构，在真核细胞中难以由细胞核向细胞质基质转运，进而结合核糖体进行翻译，造成蛋白质合成受到限制。
一些RNA病毒如脑炎心肌炎病毒(EMVC)、猪瘟病毒(CSFV)等，其mRNA缺乏帽子结构，这些病毒的翻译起始依赖于其5′端非翻译区的顺式作用元件——内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)(参见，非专利文献2)，IRES能够在一些反式作用因子的辅助下募集真核生物核糖体到mRNA分子5′非翻译区启动翻译起始。
对于真核生物，有研究者在酿酒酵母中构建了基于核基因组的T7表达***，但由于缺乏5′端帽子结构，细胞核内大量的T7 mRNA无法进入细胞质，结合核糖体被翻译为蛋白质，故该T7表达***并未表达出目标蛋白(参见非专利文献3)。
Gunge等人利用来源于乳酸克鲁维酵母的一对线性高拷贝双链细胞质质粒PGKL1和PGKL2，在酿酒酵母中开发了与宿主复制***正交的核外复制***(参见，非专利文献4)。该核外复制***编码自己的DNA聚合酶，并通过与质粒的末端蛋白(TP蛋白)结合来起始细胞质中的pGKL1和pGKL2质粒的复制。由于细胞质中的pGKL1、pGKL2质粒与核内DNA的复制方式存在差异，细胞质与细胞核之间存在物理隔离，pGKL1、pGKL2质粒的复制不受到宿主基因组复制***的影响。
现有技术文献：
非专利文献1：朱玉贤.现代分子生物学[M].第四版.北京:高等教育出版社,2013:96-101.
非专利文献2：卢杰,张珈敏,林美娟,曹旭,胡远扬.RNA病毒翻译调控元件——内部核糖体进入位点(IRES)[J].中国生物化学与分子生物学报,2007(07):513-518.
非专利文献3：BENTON B M,ENG W K,DUNN J J,et al.Signal-mediated importof bacteriophage T7 RNA polymerase into the Saccharomyces cerevisiae nucleusand specific transcription of target genes[J].Molecular and cellular biology,1990,10(1):353-360.
非专利文献4：GUNGE N,SAKAGUCHI K.Intergeneric transfer ofdeoxyribonucleic acid killer plasmids,pGKl1 and pGKl2,from Kluyveromyceslactis into Saccharomyces cerevisiae by cell fusion[J].Journal ofBacteriology,1981,147(1):155.
发明内容
发明要解决的问题
由上述文献记载可以看出，利用T7表达***较难实现在真核生物中持续、稳定、高效地表达蛋白。
本发明人多年致力于该方面的研究，从促进mRNA由细胞核向细胞质基质转运的角度，分别在T7表达***中引入带有核定位序列的Vpu基因和利用病毒加帽酶为T7 RNAP转录产物添加5′Cap，构建两种不同的T7表达***。前者可以使Vpu蛋白定位在细胞核核膜上，改变核膜的通透性，使T7 RNAP转录的产物通过渗透扩散进入细胞质，后者通过添加5′Cap，将mRNA高效地从细胞核运输到细胞质。这两种T7表达***均成功解决了mRNA的跨膜运输问题，促进了目标蛋白的翻译合成，高效稳定地表达了目标蛋白。
本发明未对mRNA的跨膜运输问题继续进行研究，而是着眼于目标基因的核外复制，利用细胞质线性质粒，针对真核生物中的酵母构建了稳定的T7表达***，实现了持续、稳定、高效地表达蛋白的目的。
用于解决问题的方案
为解决上述问题，本发明提供了具有如下特征的T7表达***以及使用该***在酵母中表达蛋白质的方法。
[1]、一种基于细胞质线性质粒的T7表达***，其特征在于，所述T7表达***包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元、细胞质线性质粒，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成，所述线性质粒来自真核生物细胞。
[2]、根据[1]所述的T7表达***，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶的基因用于构建整合型载体，转化酵母菌株，构建基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌株。
[3]、根据[1]所述的T7表达***，其特征在于，所述T7转录单元及细胞质线性质粒的部分片段用于构建整合型载体，所述细胞质线性质粒的部分片段作为基因整合用线性质粒的同源臂。
[4]、根据[1]所述的T7表达***，其特征在于，将[3]中的含有所述T7转录单元及所述基因整合用线性质粒的同源臂的整合型载体转化到[2]中的所述宿主菌株中，构建细胞质线性质粒整合有T7转录单元的、基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的菌株，由此得到所述T7表达***。
[5]、根据[1]～[4]中任一项所述的T7表达***，其特征在于，选取真核生物的启动子作为表达所述T7 RNA聚合酶的启动子，使用真核生物的终止子作为表达所述T7 RNA聚合酶的终止子。
[6]、根据[1]～[5]中任一项所述的T7表达***，其特征在于，用于构建[3]中所述的整合型载体用线性质粒的同源臂为两个，分别来自T7转录单元待***位置的上游和下游。
[7]、根据[1]～[6]中任一项所述的T7表达***，其特征在于，[3]中的所述整合型载体，用于筛选阳性转化子的标记基因由所述细胞质线性质粒自身启动子启动。
[8]、根据[7]中所述的T7表达***，其特征在于，所述细胞质线性质粒来自酵母。
[9]、根据[8]所述的T7表达***，其特征在于，所述细胞质线性质粒为来自乳酸克鲁维酵母的细胞质线性质粒pGKL1和pGKL2。
[10]、根据[1]～[9]中任一项所述的T7表达***，其特征在于，所述T7转录单元在线性质粒中的***位置为pGKL1质粒的ORF2。
[11]、一种基于细胞质线性质粒的T7表达***在酵母中表达蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括使用包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元、细胞质线性质粒的T7表达***，其中，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成，所述线性质粒来自真核生物细胞。
[12]、根据[11]所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)合成所述T7 RNA聚合酶基因序列，并将其构建到整合型载体中；
2)将1)中所述的整合型载体直接转化或线性化后转化酵母菌株，得到基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌株；
3)合成两段所述细胞质线性质粒的部分序列作为两个基因整合用同源臂，合成用于筛选阳性转化子的标记基因序列，并将所述两个基因整合用同源臂和所述标记基因构建到载体中，所述标记基因位于所述两个基因整合用同源臂之间，以含有目标基因的质粒为模板扩增包含所述T7转录单元的DNA片段，回收所述包含目标基因的T7转录单元片段，将其***带有所述两个基因整合用同源臂、所述标记基因的载体中，得到整合型载体；
4)将3)中所述的整合型载体线性化后转化2)中整合后得到的所述宿主菌株，构建所述基于细胞质线性质粒的T7表达***；
5)使用所述T7表达***，在所述重组酵母菌株中表达所述目标基因的蛋白。
[13]、根据[11]或[12]所述的方法，其特征在于，使用报告基因编码荧光素酶的基因或编码绿色荧光蛋白的基因作为所述目标基因验证所述表达***表达目标基因的蛋白的能力。
[14]、根据[11]～[13]中任一项所述的方法，其特征在于，所述酵母菌株含有细胞质线性质粒pGKL1和pGKL2。
发明的效果
细胞质线性质粒体系是核外复制体系，可以在细胞质中进行自主复制，本发明的基于该细胞质线性质粒的T7表达***属于稳定的T7表达***，不会随着细胞的***而丢失，具有该T7表达***的酵母菌株至少连续转接3次后仍能稳定地表达目标蛋白。与其相对，现有技术中的瞬时T7表达***会随着细胞***而快速丢失，无法实现继代培养中稳定地表达目标蛋白。
此外，由于细胞质与细胞核之间的物理隔离，本发明通过细胞质线性质粒进行核外复制具有特殊的优势，与改善跨膜运输而构建的T7表达***相比，本发明的核外复制体系具有更优异的持续、稳定、高效地表达目标蛋白的效果。
附图说明
图1为p-T7 RNAP整合型质粒示意图。
图2为T7 RNAP基因整合到酵母基因组的验证电泳图。其中，a.引物HO-Up/HO-DownPCR扩增酿酒酵母F102-2基因组(M：1Kb DNA Ladder；1：酿酒酵母F102-2基因组)；b.c.d.引物HO-Up/HO-Down，HO-Up/T7RP-2，HO-Down/T7RP-1分别PCR扩增整合PTEF1-T7 RNAP转录单元后的酿酒酵母F102-2基因组(M：1Kb DNA Ladder；1～8：整合PTEF1-T7 RNAP转录单元后的酿酒酵母F102-2基因组)。
图3为pUC-T7-Nluc整合型质粒示意图。
图4为基于细胞质线性质粒的T7表达***在酵母中表达荧光素酶的效果图。其中，对照组(Control)为F102-2菌株，yNluc1、yNluc2为任意选取的F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-Nluc)两个单菌落。
图5为基于细胞质线性质粒的T7表达***在酵母中表达荧光素酶的稳定性的效果图。其中，对照组(Control)为F102-2菌株，yNluc1、yNluc2为任意选取的F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-Nluc)两个单菌落。
图6为pUC-T7-sfGFP整合型质粒示意图。
图7为基于细胞质线性质粒的T7表达***在酵母中表达绿色荧光蛋白的效果图。其中，对照组(Control)为F102-2菌株，ysf1、ysf2为任意选取的F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-sfGFP)两个单菌落。
图8为基于细胞质线性质粒的T7表达***在酵母中表达绿色荧光蛋白的稳定性的效果图。其中，对照组(Control)为F102-2菌株，ysf1、ysf2为任意选取的F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-sfGFP)的两个单菌落。
图9为不同T7表达***在酿酒酵母中的荧光素酶表达量的差异图。其中，对照组(Control)为F102-2菌株，yNluc1、yNluc2为任意选取的F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-Nluc)的两个单菌落，yVpu-Nluc为BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Vpu/Nluc)，yf-NP868R为BY4741(HO::T7RNAP-NLS,pS-NP-IntN-Nano)，yF-NP868R为BY4741(HO::IntC-T7RNAP-NLS，pS-NP-IntN-Nano)。
图10至图12分别显示了SEQ ID No:1、SEQ ID No:6和SEQ ID No:9的序列。
具体实施方式
以下对本发明的基于细胞质线性质粒的T7表达***及其对于蛋白的稳定表达进行详细介绍。
本发明的基于细胞质线性质粒的T7表达***，包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元、细胞质线性质粒，所述T7转录单元包含T7启动子、T7终止子和目标基因。
本发明的细胞质线性质粒来自真核生物细胞。优选地，所述细胞质线性质粒来自酵母。更优选地，来自乳酸克鲁维酵母的细胞质线性质粒pGKL1和pGKL2。最优选地，来自酿酒酵母菌株F102-2(购自ATCC200585)，其含有pGKL1和pGKL2。
本发明的T7 RNA聚合酶基因用于构建整合型载体，转化酵母菌株，构建基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的宿主，且经所述宿主***转录、翻译，合成所需的蛋白。
本发明中的“整合型载体”是指在目标宿主中不能自主复制，其本身或将其线性化后的片段能整合到宿主基因组或者其它宿主中存在的自主复制遗传物质上(如质粒、细胞器基因组等)的质粒载体，例如，线性化后的片段能够整合到细胞质线性质粒上的质粒载体。
本发明中的“同源臂”是指整合型载体上与细胞质线性质粒同源的片段，来自基因整合位点两端，用于在酵母中与细胞质线性质粒相应片段发生体内基因重组，达到替换基因片段的目的。所述同源臂长度不受限制，优选地，可为20～2000bp，更优选地，可为100～1500bp，最优选地，可为500～1000bp。优选地，所述同源臂选自pGKL1和pGKL2质粒，更优选地，可选自pGKL1。
本发明中选取真核生物的启动子作为表达所述T7 RNA聚合酶的启动子，使用真核生物的终止子作为表达所述T7 RNA聚合酶的终止子。
本发明中使用的筛选阳性转化子的标记基因不受限制，可选择酵母相应的缺陷型基因，优选地，可使用亮氨酸筛选标记leu2基因作为标记基因。
本发明中用于筛选阳性转化子的标记基因由pGKL1和/或pGKL2质粒自身启动子启动，所用启动子不受限制，可选择pGKL1和/或pGKL2质粒各个ORF的启动子，优选地，可使用pGKL1质粒ORF2的UCS启动子。此处，ORF为开放阅读框的缩写(open reading frame)，UCS是上游保守序列的缩写(upstream conserved sequence)。
优选地，本发明中T7转录单元在线性质粒中的***位置为pGKL1质粒ORF2。
<使用基于细胞质线性质粒的T7表达***在酿酒酵母中表达蛋白质的方法>
需要说明的是，本发明中涉及的常规的质粒和载体的构建、蛋白的表达方法以及细胞转化等方法，可参照本领域公知的分子生物学及遗传学方法，例如，可参照“本领域的常规生物学方法”、“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in MolecularBiology，Wiley出版)”、“分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
本发明的基于细胞质线性质粒的T7表达***在酿酒酵母中表达蛋白质的方法主要包括以下步骤：
1)合成T7 RNA聚合酶的基因序列，并将其构建到整合型载体中；
2)将1)中的整合型载体直接转化或线性化后转化酵母菌株，得到基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌株；
3)合成两段线性质粒的部分序列作为两个基因整合用同源臂，合成用于筛选阳性转化子的标记基因序列，并将两个同源臂和标记基因构建到载体中，标记基因位于两个基因整合用同源臂之间，以含有目标基因的质粒为模板扩增包含T7转录单元的DNA片段，回收包含目标基因的T7转录单元片段，将其***带有同源臂、所述标记基因的载体中，得到整合型载体；
4)将3)中的整合型载体线性化后转化2)中的整合后得到的宿主菌株，构建基于细胞质线性质粒的T7表达***；
5)使用T7表达***，在重组酵母菌株中表达目标基因的蛋白。
本发明通过在细胞质线性质粒上引入T7转录单元，将线性质粒核外复制的特点与T7***强大的转录功能耦合，构建了稳定的T7表达***。
本领域常用的报告基因均可作为目标基因用于本发明。优选地，使用编码荧光素酶的基因或编码绿色荧光蛋白(sfGFP)的基因作为目标基因，验证所述表达***表达目标基因的蛋白的能力。
<基于细胞质线性质粒的T7表达***的蛋白表达稳定性的检测>
在本发明的一种实施方式中，对酿酒酵母使用所述T7表达***，并对目标基因重组蛋白进行表达和检测。
本发明通过报告基因在重组酿酒酵母菌株中的继代培养表达来检测基于细胞质线性质粒的T7表达***表达重组蛋白的稳定性，报告基因可使用荧光素酶(Nluc)、绿色荧光蛋白(sfGFP)等。通过荧光强度的对比来表征目标基因的蛋白表达，通过连续转接具有基于细胞质线性质粒的T7表达***的目标菌株，测定其目标基因蛋白表达的稳定性，表征目标酵母菌株中T7***的稳定性。
<实验材料>
载体：pMRI 31(GenBank:KJ502281.1)；pUC57购自Invitrogen公司。
菌株：酿酒酵母菌株F102-2，购自ATCC200585。
培养基：YPD培养基和SD-LEU培养基，购自北京索莱宝科技有限公司。
试剂：10×PBS缓冲液，购自北京索莱宝科技有限公司；荧光素酶活性测定试剂盒，购自Promega公司；Sfi I核酸内切酶，购自New England Biolabs(NEB)公司；无缝克隆试剂盒(Infusion)，购自中美泰和生物技术(北京)有限公司；山梨醇，半乳糖，氨苄青霉素，卡那霉素，遗传霉素G418，均购自北京索莱宝科技有限公司；1Kb DNA ladder购自北京全式金生物技术有限公司。
以下结合实施例进一步解释本发明，需要说明的是，以下实施例仅用于描述本发明，本发明不限于此。
<实施例>基于细胞质线性质粒的T7表达***在酿酒酵母中的构建和表达
1.带有T7 RNAP的整合型质粒载体的构建
基于pMRI 31质粒载体，构建带有T7 RNAP的整合型质粒载体p-T7 RNAP；p-T7RNAP的完整DNA序列如SEQ ID No:1所示，其结构如图1所示，按以下顺序其主要包括：
(1)酿酒酵母HO基因的5′基因组侧翼区；
(2)pBR322质粒复制起始位点(pBR322 ori)；
(3)卡那霉素/遗传霉素抗性标记基因(KanMX)，卡那霉素用于大肠杆菌菌株筛选，遗传霉素用于酿酒酵母菌株筛选；
(4)细胞色素C1(CYC1)终止子(TCYC1)；
(5)T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)基因；
(6)TEF1启动子(PTEF1)；
(7)酿酒酵母HO基因的3′基因组侧翼区。
2.基因组***T7RNAP的酿酒酵母基因工程菌的构建
将质粒p-T7RNAP使用Sfi I核酸内切酶线性化，回收线性化DNA片段，将线性片段电转入酿酒酵母菌株F102-2，具体操作参照以下酵母感受态制备和酵母电转化步骤：
酵母感受态细胞制备：
(1)从平板上挑取酵母单菌落接种到5mL的YPD培养基中，30℃培养12h。
(2)以千分之一以接种率吸取培养液40μL至40mL YPD培养基中，30℃过夜培养，使菌体浓度达到OD600≈2。
(3)将菌液转移到50mL无菌离心管中，4℃下3000×g离心5min，去上清。
(4)使用30mL冰上预冷的灭菌水重悬细胞，4℃下3000×g离心5min，去上清。
(5)使用20mL冰上预冷的1M的无菌山梨醇洗涤细胞沉淀，4℃下3000×g离心5min，去上清。
(6)使用200～500μL冰上预冷的1M的无菌山梨醇重悬细胞，并转移至预冷的无菌1.5mL离心管中，酵母感受态细胞制备完成。每次电转制备新鲜的感受态细胞以保证足够的转化率。
酵母电转化：
(1)取2～5μL线性化DNA片段，加入到预冷的1.5mL离心管中；
(2)向上述加有DNA的离心管中加入40μL的感受态细胞，用枪轻轻吹打混匀后转移到预冷的2mm电转杯中，冰上静置5min；
(3)将电转杯***的水用吸水纸擦干净，于750V/mm的电击强度下进行电击；
(4)向电击后的电转杯中加入1mL的YPD培养基，轻轻悬浮细胞，转移到1.5mL无菌离心管中，30℃静置复苏2h；
(5)复苏后的细胞4000rpm离心2min去上清，用灭菌水清洗两遍，再加100～200μL灭菌水轻轻吹打混匀后涂布到相应的琼脂平板，30℃培养2～3天。
通过遗传霉素G418抗性选择得到基因组整合了T7 RNAP基因的酿酒酵母菌株F102-2(HO::PTEF1-T7 RNAP)。为确保得到阳性转化子，提取转化后酿酒酵母菌株和空白菌株(F102-2)的基因组，并使用特定三对引物HO-Up/HO-Down、HO-Up/T7RP-1、HO-Down/T7RP-2进行PCR验证T7 RNAP基因是否正确***到酿酒酵母基因组的HO区域上，验证结果如图2所示。
HO-Up、HO-Down、T7RP-1、T 7RP-2的核苷酸序列如下：
HO-Up：GTGCCGGTAACGCTTTTTGTATCTTG(SEQ ID No:2)
HO-Down：GAGCTCATAATTCAAGCAAGTTGCGG(SEQ ID No:3)
T7RP-1：GATTGAGCGTGAAGAACTCCCGA(SEQ ID No:4)
T7RP-2：GAGAAGTGCTGGATGCCAGAGCAA(SEQ ID No:5)
使用引物HO-Up/HO-Down进行PCR扩增时，对照组扩增出3402bp片段，阳性转化子扩增出7601bp的片段；使用HO-Up/T7RP-2、HO-Down/T7RP-1两对引物分别进行PCR扩增时，阳性转化子分别扩增出3264bp、4916bp片段，而对照菌株无此长度扩增片段，说明所述T7RNAP基因成功***酿酒酵母F102-2染色体上。
3.带有目标基因荧光素酶 基因的质粒的构建
基于pUC-57质粒，构建pUC-T7-Nluc质粒，pUC-T7-Nluc质粒的完整DNA序列如SEQID NO:6所示，结构参见图3，该质粒按以下顺序主要包括：
(1)同源臂1(HR1)，pGKL1质粒ORF2的5′侧翼区，包含pGKL1质粒ORF2启动子；
(2)亮氨酸筛选标记基因leu2，包括leu2基因(leu2)和leu2终止子(Tleu)；
(3)T7启动子启动的荧光素酶基因转录单元，包括T7启动子(PT7)、核糖体内部结合位点(IRES)、荧光素酶基因(Nanoluc)、细胞色素C1终止子(TCYC1)、T7终止子(TT7)，IRES用来帮助T7 RNAP转录的mRNA与核糖体结合进行翻译；
(4)同源臂2(HR2)，pGKL1质粒ORF2的3′侧翼区，包含pGKL1质粒ORF2终止区域；
(5)pUC质粒复制起始位点(ori)；
(6)氨苄青霉素抗性标记基因(AmpR)。
4.基于细胞质线性质粒的T7表达***表达荧光素酶的酿酒酵母基因工程菌的构 建
使用引物HR1、HR2对pUC-T7-Nluc质粒进行PCR扩增，获得带有同源臂、标记基因、T7启动子启动的荧光素酶转录单元的线性片段，回收线性化DNA片段，将该线性片段电转入酿酒酵母菌株F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP)，获得重组酿酒酵母菌株F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-Nluc)。具体操作参照上述2.中描述的酵母感受态制备和酵母电转化步骤。
引物HR1、HR2的核苷酸序列如下：
HR1：ACTTATAATAATTTTGAAGAAAG(SEQ ID No:7)
HR2：ACTTCTAAACAAAGTAATATAG(SEQ ID No:8)
5. 荧光素酶(Nluc)在重组酿酒酵母菌株中的表达检测
本实验中使用前述制备的酵母菌株F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-Nluc)。
将上述菌株从固体平板上挑取单菌落，接入5mL的SD-LEU液体培养基中，30℃培养48h后，离心收集菌体，用过滤除菌的PBS缓冲液洗涤2～3次，重悬于无菌PBS，同时样品浓度应稀释至OD600＝0.3～0.8。
荧光素酶发光强度检测方法：
(1)将200μl样品转移至96孔透明板中，使用多功能酶标仪测定OD600；
(2)将底物与试剂盒提供的裂解缓冲液以1:50稀释，并与酵母细胞PBS重悬液以1:1混合，转移200μl样品至白色96孔板中，立即使用多功能酶标仪的Luminescence模式测定生物发光强度；
(3)用生物发光强度除以OD600，获得平均发光强度，以此排除菌体之间的差异。
图4为利用基于细胞质线性质粒的T7表达***表达荧光素酶的效果图，对照组(Control)为F102-2菌株，任意选取F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-Nluc)的两个单菌落yNluc1、yNluc2进行培养和测定。从图4中可以看出，基于细胞质线性质粒的T7表达***其平均发光强度远远高于对照菌株，说明基于细胞质线性质粒，T7***成功实现了荧光素酶的表达，核外复制体系与T7***成功耦合，实现了酿酒酵母中T7表达***的构建。
6.基于细胞质线性质粒的T7表达***在酿酒酵母中表达 荧光素酶的稳 定性检测
挑取F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-Nluc)任意单菌落yNluc1、yNluc2，接入5mL的SD-LEU液体培养基中，30℃培养48h后，以1：10000的比例转接至新的5mL的SD-LEU液体培养基中，30℃培养48h。每48h进行一次转接，并测定菌株的平均发光强度，转接持续3次，结果如图5所示。
由图5可以看出，具有基于细胞质线性质粒的T7表达***的酿酒酵母在3次转接中均能表达荧光素酶。3次转接中菌株yNluc1平均发光强度的变化幅度为9.6％～11.5％，yNluc2平均发光强度的变化幅度为2.0％～6.3％，基本维持稳定，说明该T7表达***具有良好的表达目标蛋白的稳定性。
7.带有目标基因绿色荧光蛋白(sfGFP)基因的质粒的构建
基于pUC-57质粒，构建pUC-T7-sfGFP质粒，pUC-T7-sfGFP质粒的完整DNA序列如SEQ ID NO:9所示，结构参见图6，该质粒按以下顺序主要包括：
(1)同源臂1(HR1)，pGKL1质粒ORF2的5′侧翼区，包含pGKL1质粒ORF2启动子；
(2)亮氨酸筛选标记基因leu2，包括leu2基因(leu2)和leu2终止子(Tleu)；
(3)T7启动子启动的绿色荧光蛋白(sfGFP)基因转录单元，包括T7启动子(PT7)、核糖体内部结合位点(IRES)、绿色荧光蛋白基因(sfGFP)、细胞色素C1终止子(TCYC1)、T7终止子(TT7)，IRES用来帮助T7 RNAP转录的mRNA与核糖体结合进行翻译；
(4)同源臂2(HR2)，pGKL1质粒ORF2的3′侧翼区，包含pGKL1质粒ORF2终止区域。
8.基于细胞质线性质粒的T7表达***表达绿色荧光蛋白(sfGFP)的酿酒酵母基因 工程菌的构建
使用引物HR1、HR2对pUC-T7-sfGFP质粒进行PCR扩增，获得带有同源臂、标记基因、T7启动子启动的绿色荧光蛋白转录单元的线性片段，回收线性化DNA片段，将该线性片段电转入酿酒酵母菌株F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP)，获得重组酿酒酵母菌株F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-sfGFP)。具体操作参照上述2.中描述的酵母感受态制备和酵母电转化步骤。引物HR1、HR2的核苷酸序列参照上述4.中的记载。
9.绿色荧光蛋白(sfGFP)在重组酿酒酵母菌株中的表达检测
本实验中使用前述制备的酵母菌株F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-sfGFP)。
将上述菌株从固体平板上挑取单菌落，接入5mL的SD-LEU液体培养基中，30℃培养48h后，离心收集菌体，用过滤除菌的PBS缓冲液洗涤2～3次，重悬于无菌PBS。
sfGFP荧光强度检测方法：
(1)将200μL样品转移至96孔透明底黑板中，使用多功能酶标仪测定OD600；
(2)然后测定荧光强度，激发波长460nm，发射波长510nm；
(3)荧光强度扣除PBS本底荧光强度后，除以OD600，获得平均荧光强度，以此排除菌体之间的差异。
图7为利用基于细胞质线性质粒的T7表达***表达绿色荧光蛋白(sfGFP)的效果图，对照组(Control)为F102-2菌株，任意选取的F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-sfGFP)两个单菌落ysf1、ysf2进行培养和测定。从图7中可以看出，基于细胞质线性质粒的T7表达***其平均发光强度显著高于对照菌株，说明基于细胞质线性质粒核外复制体系，T7***成功实现了sfGFP的表达，核外复制体系与T7***成功耦合，实现了酿酒酵母中T7表达***的构建。
10.基于细胞质线性质粒的T7表达***在酿酒酵母中表达绿色荧光蛋白(sfGFP) 的稳定性检测
挑取F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-sfGFP)任意单菌落ysf1、ysf2，接入5mL的SD-LEU液体培养基中，30℃培养48h后，以1：10000的比例转接至新的5mL的SD-LEU液体培养基中，30℃培养48h。每48h进行一次转接，并测定菌株的平均荧光强度，转接持续3次，结果如图8所示。
由图8可以看出，在3次转接中，具有基于细胞质线性质粒的T7表达***的酿酒酵母在3次转接中均能表达绿色荧光蛋白。3次转接中菌株ysf1平均荧光强度的变化幅度为13.3％～22.9％，ysf2平均荧光强度的变化幅度为10.4％～24.2％，基本维持稳定，说明该T7表达***具有良好的表达目标蛋白的稳定性。
<比较例>不同T7表达***在酿酒酵母中的荧光素酶表达量的差异
将本发明的基于细胞质线性质粒的T7表达***构建的酿酒酵母菌株F102-2(HO::PTEF1-T7RNAP,p1*leu-T7-Nluc)(yNluc1、yNluc2)、公开号为CN111534533A的基于HIV-1Vpu蛋白的T7表达***构建的酿酒酵母菌株BY4741(HO::NLS-T7RNAP,pS-Vpu/Nluc)(yVpu-Nluc)、公开号为CN114181957A的基于病毒加帽酶的T7表达***构建的酿酒酵母菌株BY4741(HO::T7RNAP-NLS,pS-NP-IntN-Nano)(yf-NP868R)、BY4741(HO::IntC-T7RNAP-NLS，pS-NP-IntN-Nano)(yF-NP868R)，按照5.中的方法，测定菌株的平均发光强度，并进行比较，结果如图9所示。
由图9可以看出，yNluc1和yNluc2菌株的发光强度远高于基于HIV-1Vpu蛋白的T7表达***构建的酿酒酵母菌株yVpu-Nluc菌株、和基于病毒加帽酶的T7表达***构建的酿酒酵母菌株yf-NP868R、yF-NP868R菌株，对比可知，本发明的基于细胞质线性质粒的T7表达***在酿酒酵母中表达荧光素酶的效果更优异。
分析原因，本发明的基于细胞质线性质粒的T7表达***将T7启动子启动的目标基因转录单元整合至细胞质线性质粒，细胞质线性质粒的转录在细胞核外进行，能够规避T7RNAP转录产物由细胞核向细胞质基质转运的问题，T7转录产物能够直接在细胞质中进行下一步的翻译合成报告基因的蛋白，因此蛋白表达效率更高。
产业上的可利用性
本发明开发了一种基于线性质粒进行核外复制用于酿酒酵母生产蛋白质的T7表达***，其通过将T7 RNA聚合酶整合到宿主基因组，基于线性质粒进行核外复制、利用T7***转录目标基因，在细胞质中完成目标基因的复制、转录、翻译，实现了在酿酒酵母中持续、稳定、高效地表达重组蛋白的目的。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 一种基于细胞质线性质粒的稳定T7表达***及其在酵母中表达蛋白质的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7096
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatcttcga gaacccttaa tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattaggt 60
gatatcagat ccacggatca ctaaagggaa caaaagctgg agctggcctt gtatcgagat 120
cacttttcgt gatccgctaa tcagcgacgg tcacattagg tttgccaagt cagggtatga 180
accatacgat cagttttcgt gaacctggta cgtatattgt ggcgtttgtg tatattttca 240
ttctttgaca acaatcaata ccaacctcaa ataggaaaag taataagttt ggcgttacac 300
cccaaaagac gccaaacgga tcgaacttac tcaatagcaa ttagcgagac aaaacctacg 360
ttaagacctg taaccgattt atcaaagcac tctgcggttc tttcttggga atattacctg 420
gacattttgt gccctcaaga aacgaggctc tacgagcctg ttggagcccc tcagacatta 480
gccgccacga atcaaacttt ttacgcgatt cggcccatga ggcccgcgga cagcatcaaa 540
ctgtaagatt ccgccacatt ttatacactc tggtccttta actggcaaac cttcgggcgt 600
aatgcccaat ttttcgcctt tgtcttttgc ctttttcact tcacgtgctt ctggtacata 660
cttgcaattt atacagtgat gaccgctgaa tttgtatctt ccatagcatc tagcacatac 720
tcgattttta ccactccaat ctttataaaa atacttgatt ccctttctgg gacaagcaac 780
acagtgtttt agattctttt tttgtgatat tttaagctgt tctcccacac agcagcctcg 840
acatgatttc acttctattt tgttgccaag caagaaattt ttatggcctt ctatcgtaag 900
cccatataca gtactctcac cctggaaatc atccgtgaag ctgaaatata cgggttccct 960
ttttataatt ggcggaactt ctcttgtttt gtgaccactt cgacaatatg acaaaacatt 1020
ctgtgaagtt gttcccccag caacattaca gtcgtatgta aattgacatt ggacttttct 1080
tccttcaatg atttcctccc tagctgacct ggtcgtcttg taggcctctt cgctattacg 1140
ccagctgaat tggagcgacc tcatgctata cctgagaaag caacctgacc tacaggaaag 1200
agttactcaa gaataagaat tttcgtttta aaacctaaga gtcactttaa aatttgtata 1260
cacttatttt ttttataact tatttaataa taaaaatcat aaatcataag aaattcgctt 1320
atttagaagt gtcaacaacg tatctaccaa cgatttgacc cttttccatc ttttcgtaaa 1380
tttctggcaa ggtagacaag ccgacaacct tgattggaga cttgaccaaa cctctggcga 1440
agaattgtta attaagagct cagatcttat cgtcgtcatc cttgtaatcc atcgatacta 1500
gtgcggccgc cctttagtga gggttgaatt cgaatccaca caccatagct tcaaaatgtt 1560
tctactcctt ttttactctt ccagattttc tcggactccg cgcatcgccg taccacttca 1620
aaacacccaa gcacagcata ctaaatttcc cctctttctt cctctagggt gtcgttaatt 1680
acccgtacta aaggtttgga aaagaaaaaa gagaccgcct cgtttctttt tcttcgtcga 1740
aaaaggcaat aaaaattttt atcacgtttc tttttcttga aaattttttt ttttgatttt 1800
tttctctttc gatgacctcc cattgatatt taagttaata aacggtcttc aatttctcaa 1860
gtttcagttt catttttctt gttctattac aacttttttt acttcttgct cattagaaag 1920
aaagcatagc aatctaatct aagttttaat tacaaaatga acacgattaa catcgctaag 1980
aacgacttct ctgacatcga actggctgct atcccgttca acactctggc tgaccattac 2040
ggtgagcgtt tagctcgcga acagttggcc cttgagcatg agtcttacga gatgggtgaa 2100
gcacgcttcc gcaagatgtt tgagcgtcaa cttaaagctg gtgaggttgc ggataacgct 2160
gccgccaagc ctctcatcac taccctactc cctaagatga ttgcacgcat caacgactgg 2220
tttgaggaag tgaaagctaa gcgcggcaag cgcccgacag ccttccagtt cctgcaagaa 2280
atcaagccgg aagccgtagc gtacatcacc attaagacca ctctggcttg cctaaccagt 2340
gctgacaata caaccgttca ggctgtagca agcgcaatcg gtcgggccat tgaggacgag 2400
gctcgcttcg gtcgtatccg tgaccttgaa gctaagcact tcaagaaaaa cgttgaggaa 2460
caactcaaca agcgcgtagg gcacgtctac aagaaagcat ttatgcaagt tgtcgaggct 2520
gacatgctct ctaagggtct actcggtggc gaggcgtggt cttcgtggca taaggaagac 2580
tctattcatg taggagtacg ctgcatcgag atgctcattg agtcaaccgg aatggttagc 2640
ttacaccgcc aaaatgctgg cgtagtaggt caagactctg agactatcga actcgcacct 2700
gaatacgctg aggctatcgc aacccgtgca ggtgcgctgg ctggcatctc tccgatgttc 2760
caaccttgcg tagttcctcc taagccgtgg actggcatta ctggtggtgg ctattgggct 2820
aacggtcgtc gtcctctggc gctggtgcgt actcacagta agaaagcact gatgcgctac 2880
gaagacgttt acatgcctga ggtgtacaaa gcgattaaca ttgcgcaaaa caccgcatgg 2940
aaaatcaaca agaaagtcct agcggtcgcc aacgtaatca ccaagtggaa gcattgtccg 3000
gtcgaggaca tccctgcgat tgagcgtgaa gaactcccga tgaaaccgga agacatcgac 3060
atgaatcctg aggctctcac cgcgtggaaa cgtgctgccg ctgctgtgta ccgcaaggac 3120
aaggctcgca agtctcgccg tatcagcctt gagttcatgc ttgagcaagc caataagttt 3180
gctaaccata aggccatctg gttcccttac aacatggact ggcgcggtcg tgtttacgct 3240
gtgtcaatgt tcaacccgca aggtaacgat atgaccaaag gactgcttac gctggcgaaa 3300
ggtaaaccaa tcggtaagga aggttactac tggctgaaaa tccacggtgc aaactgtgcg 3360
ggtgtcgata aggttccgtt ccctgagcgc atcaagttca ttgaggaaaa ccacgagaac 3420
atcatggctt gcgctaagtc tccactggag aacacttggt gggctgagca agattctccg 3480
ttctgcttcc ttgcgttctg ctttgagtac gctggggtac agcaccacgg cctgagctat 3540
aactgctccc ttccgctggc gtttgacggg tcttgctctg gcatccagca cttctccgcg 3600
atgctccgag atgaggtagg tggtcgcgcg gttaacttgc ttcctagtga aaccgttcag 3660
gacatctacg ggattgttgc taagaaagtc aacgagattc tacaagcaga cgcaatcaat 3720
gggaccgata acgaagtagt taccgtgacc gatgagaaca ctggtgaaat ctctgagaaa 3780
gtcaagctgg gcactaaggc actggctggt caatggctgg cttacggtgt tactcgcagt 3840
gtgactaagc gttcagtcat gacgctggct tacgggtcca aagagttcgg cttccgtcaa 3900
caagtgctgg aagataccat tcagccagct attgattccg gcaagggtct gatgttcact 3960
cagccgaatc aggctgctgg atacatggct aagctgattt gggaatctgt gagcgtgacg 4020
gtggtagctg cggttgaagc aatgaactgg cttaagtctg ctgctaagct gctggctgct 4080
gaggtcaaag ataagaagac tggagagatt cttcgcaagc gttgcgctgt gcattgggta 4140
actcctgatg gtttccctgt gtggcaggaa tacaagaagc ctattcagac gcgcttgaac 4200
ctgatgttcc tcggtcagtt ccgcttacag cctaccatta acaccaacaa agatagcgag 4260
attgatgcac acaaacagga gtctggtatc gctcctaact ttgtacacag ccaagacggt 4320
agccaccttc gtaagactgt agtgtgggca cacgagaagt acggaatcga atcttttgca 4380
ctgattcacg actccttcgg taccattccg gctgacgctg cgaacctgtt caaagcagtg 4440
cgcgaaacta tggttgacac atatgagtct tgtgatgtac tggctgattt ctacgaccag 4500
ttcgctgacc agttgcacga gtctcaattg gacaaaatgc cagcacttcc ggctaaaggt 4560
aacttgaacc tccgtgacat cttagagtcg gacttcgcgt tcgcgtaaat ccgctctaac 4620
cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct atttattttt ttatagttat 4680
gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt ttttttctgt acagacgcgt 4740
gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag gttttgggac gctcgaagat 4800
cccaattcgc catatagtga gtcgtattac gcgcgctcga caacccttaa tataacttcg 4860
tataatgtat gctatacgaa gttattaggt ctagtagctt gcctcgtccc cgccgggtca 4920
cccggccagc gacatggagg cccagaatac cctccttgac agtcttgacg tgcgcagctc 4980
aggggcatga tgtgactgtc gcccgtacat ttagcccata catccccatg tataatcatt 5040
tgcatccata cattttgatg gccgcacggc gcgaagcaaa aattacggct cctcgctgca 5100
gacctgcgag cagggaaacg ctcccctcac agacgcgttg aattgtcccc acgccgcgcc 5160
cctgtagaga aatataaaag gttaggattt gccactgagg ttcttctttc atatacttcc 5220
ttttaaaatc ttgctaggat acagttctca catcacatcc gaacataaac aaccatgggt 5280
aaggaaaaga ctcacgtttc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat 5340
gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat 5400
gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat 5460
gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc 5520
aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccggcaaa 5580
acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg 5640
gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat 5700
cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt 5760
gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag 5820
cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt 5880
atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac 5940
cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag 6000
aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat 6060
ttgatgctcg atgagttttt ctaatcagta ctgacaataa aaagattctt gttttcaaga 6120
acttgtcatt tgtatagttt ttttatattg tagttgttct attttaatca aatgttagcg 6180
tgatttatat tttttttcgc ctcgacatca tctgcccaga tgcgaagtta agtgcgcaga 6240
aagtaatatc atgcgtcaat cgtatgtgaa tgctggtcgc tatactgctg tcgattcgat 6300
actaacgccg ccatccagtg tcgaaaacga acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 6360
atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 6420
ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 6480
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 6540
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 6600
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 6660
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 6720
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 6780
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 6840
aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 6900
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 6960
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 7020
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 7080
atgagattat caaaaa 7096
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgccggtaa cgctttttgt atcttg 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagctcataa ttcaagcaag ttgcgg 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gattgagcgt gaagaactcc cga 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagaagtgct ggatgccaga gcaa 24
<210> 6
<211> 7597
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tacttataat aattttgaag aaagtacata tatagcatgg tatacaaatg 480
tagatataga tataggtttg tctgaaggtc ataatataga atatatcccc tttgattctt 540
atggaaatat aggttattct tggtctaaaa aaggtaaaat attcgaaaaa tatataaaag 600
acgtgctgta caaattaaaa ataaagtatg aaaaacaaaa caataaagtt aaaagaaatg 660
ttatcaaaat tattatgaac agtttatggg gcaaattcgc acaaaaatgg gtaaattttg 720
agtattttat aaaatcagaa gatgatatag attttgagtc agaagaggca tataagatat 780
gggacactga ttttatgctg ataaagaaaa ttaaagaatc tacttattca tctaaaccta 840
tacaaaatgg agtatttaca ttaagttggg caagatacca catgaaaagt atatgggatg 900
caggggctaa agaaggagca gaatgtatct attcggacac agatagtatt tttgtacata 960
aagaacattt taaaaagaat gctaaattta tgttaaatgg tttaaaagtt cctattatag 1020
gatcagaagt aggacaatta gaattagaat gtgagtttga taaattgtta tgtgcaggta 1080
aaaagcaata catgggattt tatacttatt ttcaagatgg aaaaccatgt ataaaagaaa 1140
agaaaagatt taagggtatt cctagtaatt atataatacc tgaattatat gctcatttac 1200
tttcaggtgc agacaaagaa gctaaaatac aatttttgaa atttagaaga gaatggggat 1260
cagttaaagg atatatagaa aataagaccg tgaaagctac ttaatatatg aaagttttta 1320
taataattat aaaatgtctg cccctaagaa gatcgtcgtt ttgccaggtg accacgttgg 1380
tcaagaaatc acagccgaag ccattaaggt tcttaaagct atttctgatg ttcgttccaa 1440
tgtcaagttc gatttcgaaa atcatttaat tggtggtgct gctatcgatg ctacaggtgt 1500
tccacttcca gatgaggcgc tggaagcctc caagaaggct gatgccgttt tgttaggtgc 1560
tgtgggtggt cctaaatggg gtaccggtag tgttagacct gaacaaggtt tactaaaaat 1620
ccgtaaagaa cttcaattgt acgccaactt aagaccatgt aactttgcat ccgactctct 1680
tttagactta tctccaatca agccacaatt tgctaaaggt actgacttcg ttgttgtcag 1740
agaattagtg ggaggtattt actttggtaa gagaaaggaa gacgatggtg atggtgtcgc 1800
ttgggatagt gaacaataca ccgttccaga agtgcaaaga atcacaagaa tggccgcttt 1860
catggcccta caacatgagc caccattgcc tatttggtcc ttggataaag ctaatgtttt 1920
ggcctcttca agattatgga gaaaaactgt ggaggaaacc atcaagaacg aattccctac 1980
attgaaggtt caacatcaat tgattgattc tgccgccatg atcctagtta agaacccaac 2040
ccacctaaat ggtattataa tcaccagcaa catgtttggt gatatcatct ccgatgaagc 2100
ctccgttatc ccaggttcct tgggtttgtt gccatctgcg tccttggcct ctttgccaga 2160
caagaacacc gcatttggtt tgtacgaacc atgccacggt tctgctccag atttgccaaa 2220
gaataaggtc aaccctatcg ccactatctt gtctgctgca atgatgttga aattgtcatt 2280
gaacttgcct gaagaaggta aggccattga agatgcagtt aaaaaggttt tggatgcagg 2340
tatcagaact ggtgatttag gtggttccaa cagtaccacc gaagtcggtg atgctgtcgc 2400
cgaagaagtt aagaaaatcc ttgcttaaaa agattctctt tttttatgat atttgtacat 2460
aaactttata aatgaaattc ataatagaaa cgacacgaaa ttacaaaatg gaatatgttc 2520
atagggtaga cgaaactata tacgcaatct acatacattt atcaagaagg agaaaaagga 2580
ggatgtaaag gaatacaggt aagcaaattg atactaatgg ctcaacgtga taaggaaaaa 2640
gaattgcact ttaacattaa tattgacaag gaggagggca ccacacaaaa agttaggtgt 2700
aacagaaaat catgaaacta tgattcctaa tttatatatt ggaggatttt ctctaaaaaa 2760
aaaaaaatac aacaaataaa aaacactcaa tgacctgacc atttgatgga gtttaagtca 2820
ataccttctt gaaccatttc ccataatggt gaaagttccc tcaagaattt tactctgtca 2880
gaaacggcct taacgacgta gtcgactaat acgactcact ataggtgttt attcaagtgg 2940
aagcagattt gtacgctcaa gcggttgaat aaactagtta acgttactgg ccgaagtcgc 3000
ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt 3060
ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt 3120
tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg 3180
gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca 3240
cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg 3300
gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc 3360
tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct 3420
gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta 3480
ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac 3540
aacgtcgata tgatggtctt cacactcgaa gatttcgttg gggactggcg acagacagcc 3600
ggctacaacc tggaccaagt ccttgaacag ggaggtgtgt ccagtttgtt tcagaatctc 3660
ggggtgtccg taactccgat ccaaaggatt gtcctgagcg gtgaaaatgg gctgaagatc 3720
gacatccatg tcatcatccc gtatgaaggt ctgagcggcg accaaatggg ccagatcgaa 3780
aaaattttta aggtggtgta ccctgtggat gatcatcact ttaaggtgat cctgcactat 3840
ggcacactgg taatcgacgg ggttacgccg aacatgatcg actatttcgg acggccgtat 3900
gaaggcatcg ccgtgttcga cggcaaaaag atcactgtaa cagggaccct gtggaacggc 3960
aacaaaatta tcgacgagcg cctgatcaac cccgacggct ccctgctgtt ccgagtaacc 4020
atcaacggag tgaccggctg gcggctgtgc gaacgcattc tggcgtaatt atgtcacgct 4080
tacattcacg ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa ggaaggagtt agacaacctg 4140
aagtctaggt ccctatttat ttttttatag ttatgttagt attaagaacg ttatttatat 4200
ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa 4260
ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat ttgcggccgg taccatcttg 4320
ctgaaaaact cgagccatcc ggaagatctg gcggccctag cataacccct tggggcctct 4380
aaacgggcct tgaggggttt tttggaccta taggtatagc tacatctgtt cttgcagatt 4440
ttgctctatt aggagcagat gccgctataa acggagagtt aaatccatca gacctagcat 4500
tcgctttagc aggtttattc ttaccagtat ttgcttcttt aggaaaaaca tttaaatttg 4560
ctgaagcttt acaaaaaatt aatattaata aatctaaaaa ctttgataat ttaaatgaat 4620
ttgagaaaat aagatttttc agatctaaat tagggaaagt taagatgtgt ggctcttaaa 4680
agtaatggat gaccattatt cttgtgtaaa ttgtcaaaat ctacatcttc atatttatga 4740
tatttaaata tatatttttc gttttcaaaa tctaaatgtt gacacatacc tccttctttt 4800
tttgctttat tcatcataat attataaaat tcaatactac cagaagcata agctattctt 4860
attaaatcta tatctggact ataattttct aaatcttcag ttatattcat aatagcataa 4920
tttactaata ttgcatatct ttggcgtgga aaatcgataa gtagtttttg aaccatatat 4980
ttatttaaag ttttataagt gtaaaaataa aaaggcctat aaagagacac aaagtttgaa 5040
tcataaatat cattcactaa taaatttaat actgcttttt tacacaaatc atctggatat 5100
tctttatgat gtttaagtac ataagctgaa tttaaaaaat taaattcaac tgtatttata 5160
tttatatcta aataaggttt ataagagacc atattatagt acacactttt atctacagaa 5220
acacaatcca taggaccaaa ttctgtattt tgactataat ctatatatgt atataacata 5280
tcatctataa tttgttctat attactttgt ttagaagtat cggatcccgg gcccgtcgac 5340
tgcagaggcc tgcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 5400
tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 5460
ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 5520
tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 5580
ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 5640
ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 5700
gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 5760
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 5820
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 5880
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 5940
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 6000
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 6060
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 6120
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 6180
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 6240
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 6300
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 6360
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 6420
cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 6480
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 6540
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 6600
gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 6660
gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 6720
ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 6780
attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 6840
gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 6900
tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 6960
agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 7020
gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 7080
actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 7140
tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 7200
attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 7260
tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 7320
tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 7380
aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 7440
tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 7500
cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 7560
acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 7597
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acttataata attttgaaga aag 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acttctaaac aaagtaatat ag 22
<210> 9
<211> 7798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tacttataat aattttgaag aaagtacata tatagcatgg tatacaaatg 480
tagatataga tataggtttg tctgaaggtc ataatataga atatatcccc tttgattctt 540
atggaaatat aggttattct tggtctaaaa aaggtaaaat attcgaaaaa tatataaaag 600
acgtgctgta caaattaaaa ataaagtatg aaaaacaaaa caataaagtt aaaagaaatg 660
ttatcaaaat tattatgaac agtttatggg gcaaattcgc acaaaaatgg gtaaattttg 720
agtattttat aaaatcagaa gatgatatag attttgagtc agaagaggca tataagatat 780
gggacactga ttttatgctg ataaagaaaa ttaaagaatc tacttattca tctaaaccta 840
tacaaaatgg agtatttaca ttaagttggg caagatacca catgaaaagt atatgggatg 900
caggggctaa agaaggagca gaatgtatct attcggacac agatagtatt tttgtacata 960
aagaacattt taaaaagaat gctaaattta tgttaaatgg tttaaaagtt cctattatag 1020
gatcagaagt aggacaatta gaattagaat gtgagtttga taaattgtta tgtgcaggta 1080
aaaagcaata catgggattt tatacttatt ttcaagatgg aaaaccatgt ataaaagaaa 1140
agaaaagatt taagggtatt cctagtaatt atataatacc tgaattatat gctcatttac 1200
tttcaggtgc agacaaagaa gctaaaatac aatttttgaa atttagaaga gaatggggat 1260
cagttaaagg atatatagaa aataagaccg tgaaagctac ttaatatatg aaagttttta 1320
taataattat aaaatgtctg cccctaagaa gatcgtcgtt ttgccaggtg accacgttgg 1380
tcaagaaatc acagccgaag ccattaaggt tcttaaagct atttctgatg ttcgttccaa 1440
tgtcaagttc gatttcgaaa atcatttaat tggtggtgct gctatcgatg ctacaggtgt 1500
tccacttcca gatgaggcgc tggaagcctc caagaaggct gatgccgttt tgttaggtgc 1560
tgtgggtggt cctaaatggg gtaccggtag tgttagacct gaacaaggtt tactaaaaat 1620
ccgtaaagaa cttcaattgt acgccaactt aagaccatgt aactttgcat ccgactctct 1680
tttagactta tctccaatca agccacaatt tgctaaaggt actgacttcg ttgttgtcag 1740
agaattagtg ggaggtattt actttggtaa gagaaaggaa gacgatggtg atggtgtcgc 1800
ttgggatagt gaacaataca ccgttccaga agtgcaaaga atcacaagaa tggccgcttt 1860
catggcccta caacatgagc caccattgcc tatttggtcc ttggataaag ctaatgtttt 1920
ggcctcttca agattatgga gaaaaactgt ggaggaaacc atcaagaacg aattccctac 1980
attgaaggtt caacatcaat tgattgattc tgccgccatg atcctagtta agaacccaac 2040
ccacctaaat ggtattataa tcaccagcaa catgtttggt gatatcatct ccgatgaagc 2100
ctccgttatc ccaggttcct tgggtttgtt gccatctgcg tccttggcct ctttgccaga 2160
caagaacacc gcatttggtt tgtacgaacc atgccacggt tctgctccag atttgccaaa 2220
gaataaggtc aaccctatcg ccactatctt gtctgctgca atgatgttga aattgtcatt 2280
gaacttgcct gaagaaggta aggccattga agatgcagtt aaaaaggttt tggatgcagg 2340
tatcagaact ggtgatttag gtggttccaa cagtaccacc gaagtcggtg atgctgtcgc 2400
cgaagaagtt aagaaaatcc ttgcttaaaa agattctctt tttttatgat atttgtacat 2460
aaactttata aatgaaattc ataatagaaa cgacacgaaa ttacaaaatg gaatatgttc 2520
atagggtaga cgaaactata tacgcaatct acatacattt atcaagaagg agaaaaagga 2580
ggatgtaaag gaatacaggt aagcaaattg atactaatgg ctcaacgtga taaggaaaaa 2640
gaattgcact ttaacattaa tattgacaag gaggagggca ccacacaaaa agttaggtgt 2700
aacagaaaat catgaaacta tgattcctaa tttatatatt ggaggatttt ctctaaaaaa 2760
aaaaaaatac aacaaataaa aaacactcaa tgacctgacc atttgatgga gtttaagtca 2820
ataccttctt gaaccatttc ccataatggt gaaagttccc tcaagaattt tactctgtca 2880
gaaacggcct taacgacgta gtcgactaat acgactcact ataggtgttt attcaagtgg 2940
aagcagattt gtacgctcaa gcggttgaat aaactagtta acgttactgg ccgaagtcgc 3000
ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt 3060
ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt 3120
tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg 3180
gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca 3240
cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg 3300
gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc 3360
tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct 3420
gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta 3480
ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac 3540
aacgtcgata tgatgcgtaa aggcgaagag ctgttcactg gtgtcgtccc tattctggtg 3600
gaactggatg gtgatgtcaa cggtcataag ttttccgtgc gtggcgaggg tgaaggtgac 3660
gcaactaatg gtaaactgac gctgaagttc atctgtacta ctggtaaact gccggtacct 3720
tggccgactc tggtaacgac gctgacttat ggtgttcagt gctttgctcg ttatccggac 3780
catatgaagc agcatgactt cttcaagtcc gccatgccgg aaggctatgt gcaggaacgc 3840
acgatttcct ttaaggatga cggcacgtac aaaacgcgtg cggaagtgaa atttgaaggc 3900
gataccctgg taaaccgcat tgagctgaaa ggcattgact ttaaagaaga cggcaatatc 3960
ctgggccata agctggaata caattttaac agccacaatg tttacatcac cgccgataaa 4020
caaaaaaatg gcattaaagc gaattttaaa attcgccaca acgtggagga tggcagcgtg 4080
cagctggctg atcactacca gcaaaacact ccaatcggtg atggtcctgt tctgctgcca 4140
gacaatcact atctgagcac gcaaagcgtt ctgtctaaag atccgaacga gaaacgcgat 4200
catatggttc tgctggagtt cgtaaccgca gcgggcatca cgcatggtat ggatgaactg 4260
tacaaataat tatgtcacgc ttacattcac gccctccccc cacatccgct ctaaccgaaa 4320
aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg tccctattta tttttttata gttatgttag 4380
tattaagaac gttatttata tttcaaattt ttcttttttt tctgtacaga cgcgtgtacg 4440
catgtaacat tatactgaaa accttgcttg agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa 4500
tttgcggccg gtaccatctt gctgaaaaac tcgagccatc cggaagatct ggcggcccta 4560
gcataacccc ttggggcctc taaacgggcc ttgaggggtt ttttggacct ataggtatag 4620
ctacatctgt tcttgcagat tttgctctat taggagcaga tgccgctata aacggagagt 4680
taaatccatc agacctagca ttcgctttag caggtttatt cttaccagta tttgcttctt 4740
taggaaaaac atttaaattt gctgaagctt tacaaaaaat taatattaat aaatctaaaa 4800
actttgataa tttaaatgaa tttgagaaaa taagattttt cagatctaaa ttagggaaag 4860
ttaagatgtg tggctcttaa aagtaatgga tgaccattat tcttgtgtaa attgtcaaaa 4920
tctacatctt catatttatg atatttaaat atatattttt cgttttcaaa atctaaatgt 4980
tgacacatac ctccttcttt ttttgcttta ttcatcataa tattataaaa ttcaatacta 5040
ccagaagcat aagctattct tattaaatct atatctggac tataattttc taaatcttca 5100
gttatattca taatagcata atttactaat attgcatatc tttggcgtgg aaaatcgata 5160
agtagttttt gaaccatata tttatttaaa gttttataag tgtaaaaata aaaaggccta 5220
taaagagaca caaagtttga atcataaata tcattcacta ataaatttaa tactgctttt 5280
ttacacaaat catctggata ttctttatga tgtttaagta cataagctga atttaaaaaa 5340
ttaaattcaa ctgtatttat atttatatct aaataaggtt tataagagac catattatag 5400
tacacacttt tatctacaga aacacaatcc ataggaccaa attctgtatt ttgactataa 5460
tctatatatg tatataacat atcatctata atttgttcta tattactttg tttagaagta 5520
tcggatcccg ggcccgtcga ctgcagaggc ctgcatgcaa gcttggcgta atcatggtca 5580
tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 5640
agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 5700
cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 5760
caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 5820
tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 5880
cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 5940
aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 6000
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 6060
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 6120
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 6180
cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 6240
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 6300
gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 6360
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga 6420
acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 6480
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 6540
attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 6600
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 6660
ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 6720
taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 6780
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 6840
ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 6900
gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 6960
ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 7020
gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 7080
tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 7140
atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 7200
gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 7260
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 7320
atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 7380
agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 7440
ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 7500
tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 7560
aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 7620
tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 7680
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 7740
accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc 7798
Claims (12)
1.一种基于细胞质线性质粒的T7表达***，其特征在于，所述T7表达***由T7 RNA聚合酶、T7转录单元、细胞质线性质粒构成，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成，所述线性质粒为来自乳酸克鲁维酵母的细胞质线性质粒pGKL1和pGKL2。
2.根据权利要求1所述的T7表达***，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶的基因用于构建整合型载体，转化酵母菌株，构建基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌株。
3.根据权利要求1所述的T7表达***，其特征在于，所述T7转录单元及细胞质线性质粒的部分片段用于构建整合型载体，所述细胞质线性质粒的部分片段作为基因整合用线性质粒的同源臂。
4.根据权利要求1所述的T7表达***，其特征在于，将权利要求3中的含有所述T7转录单元及所述基因整合用线性质粒的同源臂的整合型载体转化到权利要求2中的宿主菌株中，构建细胞质线性质粒上整合有T7转录单元的、基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的菌株，由此得到所述T7表达***。
5.根据权利要求1或2所述的T7表达***，其特征在于，选取真核生物的启动子作为表达所述T7RNA聚合酶的启动子，使用真核生物的终止子作为表达所述T7 RNA聚合酶的终止子。
6.根据权利要求3所述的T7表达***，其特征在于，用于构建所述整合型载体的同源臂为两个，分别来自所述T7转录单元待***位置的上游和下游。
7.根据权利要求3所述的T7表达***，其特征在于，所述整合型载体中，用于筛选阳性转化子的标记基因由所述细胞质线性质粒自身启动子启动。
8.根据权利要求1所述的T7表达***，其特征在于，所述T7转录单元在所述线性质粒中的***位置为所述pGKL1质粒的ORF2。
9.一种基于细胞质线性质粒的T7表达***在酵母中表达蛋白质的方法，其特征在于，所述方法使用由T7 RNA聚合酶、T7转录单元、细胞质线性质粒构成的T7表达***，其中，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成，所述线性质粒为来自乳酸克鲁维酵母的细胞质线性质粒pGKL1和pGKL2。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)合成所述T7 RNA聚合酶的基因序列，并将其构建到整合型载体中；
2)将1)中所述的整合型载体直接转化或线性化后转化酵母菌株，得到基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌株；
3)合成两段所述细胞质线性质粒的部分序列作为两个基因整合用同源臂，合成用于筛选阳性转化子的标记基因序列，并将所述两个基因整合用同源臂和所述标记基因构建到载体中，所述标记基因位于所述两个基因整合用同源臂之间，以含有目标基因的质粒为模板扩增包含所述T7转录单元的DNA片段，回收包含所述目标基因的T7转录单元片段，将其***带有所述两个基因整合用同源臂、所述标记基因的载体中，得到整合型载体；
4)将3)中所述的整合型载体线性化后转化2)中整合后得到的所述宿主菌株，构建所述基于细胞质线性质粒的T7表达***；
5)使用所述T7表达***，在重组酵母菌株中表达所述目标基因的蛋白。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，使用报告基因编码荧光素酶的基因或编码绿色荧光蛋白的基因作为所述目标基因验证所述表达***表达所述目标基因的蛋白的能力。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酵母菌株含有所述细胞质线性质粒pGKL1和pGKL2。
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