CN110295128A

CN110295128A - 一株四环素类抗生素降解菌及其应用

Info

Publication number: CN110295128A
Application number: CN201910614668.8A
Authority: CN
Inventors: 郑艺; 李盈萱; 朱颖琪; 王剑; 崔超月; 孙坚
Original assignee: Guangdong Experimental High School
Current assignee: Guangdong Experimental High School
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2019-07-09
Publication date: 2019-10-01

Abstract

本发明属于抗生素的生物降解技术领域，涉及一种降解微生物，具体涉及一株四环素类抗生素降解菌及其应用，该菌株经鉴定为Wautersiella falsenii菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：60678；保藏时间为：2019年05月30日；该菌株可应用在制备降解四环素类抗生素菌剂中，有利于丰富四环素类抗生素降解菌的菌种资源库，为四环素类抗生素污染的治理提供有效的生物降解方法。

Description

一株四环素类抗生素降解菌及其应用

技术领域

本发明属于抗生素的生物降解技术领域，涉及一种降解微生物，具体涉及一株四环素类抗生素降解菌及其应用。

背景技术

四环素类抗生素是我国畜禽饲养业中生产量和使用量最大的一类抗生素，仅在1999年，我国四环素类抗生素使用量就高达9413吨，到2003年我国土霉素的产量占世界总产量的65%，多西环素产量排在世界第一。2013年我国四环素类抗生素的总使用量已高达12000吨。由于吸收率较低，服用后大量四环素类抗生素以母体或活性代谢物的形式随尿液和粪便进入环境，使得动物粪肥和养殖场周边环境蓄积了大量的四环素类抗生素。四环素类抗生素的大量使用和排放促进了四环素耐药菌和相关耐药基因的产生和传播。四环素类抗生素通过食物链逐级传递到人体内，长期低剂量的抗生素摄取，除了会干扰人体内正常的肠道菌群，还可能导致临床“超级细菌”的产生，部分药物还含有致畸、致癌、致突变等作用，严重危害人的生理健康。

而目前解决环境中蓄积的抗生素的方法主要为生物降解法和非生物降解法两种。非生物降解法包括高温堆肥降解、光电催化降解、氧化降解等，但具有专一性差、成本高、易导致二次污染等缺点。生物降解法是四环素类抗生素的主要降解途径，也是目前比较经济有效的方法。其中，降解微生物是一种比较常见生物降解法，降解微生物可通过各类生物酶的作用将四环素类抗生素降解转化为能源物质或对自身无毒害作用的其他代谢产物，从而降低甚至消除抗生素的生态风险。但目前报道的四环素类抗生素降解微生物种类仍然较少，亟需补充新的菌种资源，因此，筛选到合适的高效的降解菌株显得尤为重要。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一株四环素类抗生素降解菌及其应用，该菌分离自广州从化某养猪场的粪便样品，经分子鉴定为Wautersiella falsenii菌，命名为HNS2-5-2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，该菌降解四环素类抗生素的功能为首次报道，不仅有助于丰富四环素类抗生素降解微生物的菌种资源，而且投入应用中可以有效的降解环境中残留的四环素类抗生素，降低抗生素的生态风险。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一株四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株，该菌株为Wautersiella falsenii菌，于2019年5月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60678。

上述的四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株可应用于制备降解四环素类抗生素的菌剂中。

优选的，HNS2-5-2菌株可降解的四环素类抗生素为四环素、土霉素、金霉素、多西环素、米诺环素中的一种或多种，所述多种四环素类抗生素为各种四环素类抗生素任意比例的混合抗生素。

更优选的，HNS2-5-2菌株可降解的四环素类抗生素为四环素。

优选的，HNS2-5-2菌株制备降解四环素类抗生素菌剂的方法为：将所述HNS2-5-2菌株用液体培养基进行常规活化培养，8～10 h后收集培养液即可得到菌剂，具体为将HNS2-5-2菌株接种于M9培养基（1×M9微量盐，2 mM MgSO₄和100 mM CaCl₂）上，并往培养基中加入9 g/L浓度的葡萄糖，100 mg/L硫胺素和100 mg/L亮氨酸，8～10 h后收集培养液即可得到菌剂。

更优选的，上述降解四环素类抗生素菌剂可对药物浓度为32 mg/L以下的四环素、土霉素、金霉素，药物浓度为16 mg/L 以下的多西环素，药物浓度为8 mg/L 的米诺环素进行降解。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明从养猪场的粪便样品中筛选分离得到一株具有四环素类抗生素降解活性的菌株，该菌经分子鉴定为Wautersiella falsenii菌，命名为HNS2-5-2，该菌的16S rDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，该菌具有降解四环素类抗生素的功能，有利于丰富四环素类抗生素降解菌的菌种资源库，为四环素类抗生素污染的治理提供有效的生物降解方法。

附图说明

图1为HNS2-5-2菌株对含四环素培养基的变色效果；

图2为HNS2-5-2菌株在LB固体培养基上的培养形态；

图3为菌株HNS2-5-2降解四环素的LC-MS定量检测结果（横坐标中的Theoretical max表示培养基中初始的四环素浓度；M9 media-only表示阴性对照组；HNS2-5-2表示添加了菌株HNS2-5-2的试验组；“***”表示P<0.0001；纵坐标中的Concentration表示培养基中四环素的浓度）。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1 四环素类抗生素降解菌的分离与筛选

从广州从化某养猪场取粪便样品经生理盐水稀释后涂布于LB固体培养基（广东环凯微生物科技有限公司）上，37 ℃培养12 h。挑选培养基上所有不同形态的单菌落进行纯化，将纯化过的单菌落进行编号和保藏。将分离到的全部菌株按照临床实验标准化委员会（Clinical and Laboratory Intitute，CLSI）的指导原则采用MH琼脂（广东环凯微生物科技有限公司）稀释法做四环素类药物（四环素类药物包括四环素、土霉素、金霉素、多西环素、米诺环素等，且均购自上海源叶生物科技有限公司）的最小抑菌浓度实验（MICs，单位mg/L），筛选得到一株具有四环素类药物耐药表型的菌株，并将菌株命名为HNS2-5-2，结果见表1所示。

表1 菌株对四环素类抗生素类药物的最小抑菌浓度值

将上述具有四环素类药物耐药表型的菌株接种在4 mL LB试管肉汤（广东环凯微生物科技有限公司）中，在37 ℃下以180 rpm的转速振荡培养12 h，次日取200 mL过夜培养物加入100 mL的LB肉汤中，在肉汤中加入终浓度为100 mg/L的四环素。然后将培养物置于37 ℃黑暗环境中以220 rpm的转速振荡培养，用未添加四环素的培养物做空白对照。发现菌株HNS2-5-2的过夜培养物可以使含有四环素的培养基从黄色变为棕褐色（如图1所示），初步推定该菌与四环素类抗生素的降解有关。

至此，初步分离与筛选得到对四环素类抗生素具有降解作用的菌株，即HNS2-5-2菌株。

实施例2 HNS2-5-2菌株的培养

HNS2-5-2菌株为革兰氏阴性菌，通过划线的方式将其接种到LB固体培养基上，37 ℃培养24h后，菌落呈淡黄色，半透明，表面光滑湿润，边缘规则，圆形，无晕环，中央***（图2）。在25℃ MA培养基上生长6天，半乳糖苷酶阳性，淀粉酶、脂酶（三丁酸甘油酯）、蛋白酶、脂酶（Tween80）、纤维素酶、溶菌酶、胆固醇氧化酶、漆酶、褐藻酸酶、木聚糖酶、单宁酶、菊粉酶、卡拉胶酶、果胶酶、豆豉蛋白酶阴性。

实施例3 HNS2-5-2菌株的鉴定

使用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组提取试剂盒，按照说明书操作提取菌株HNS2-5-2的基因组DNA，随后对其16S rDNA基因进行PCR扩增，PCR扩增的体系（25 mL）为：18.375 mL ddH₂O，2.5 mL 10×Buffer，2 mL dNTPs，0.5 mL上游引物（SEQ ID NO：1），0.5mL下游引物（SEQ ID NO：2），0.125 mL rTaq酶和1 mL DNA模板。其中，扩增16S rDNA基因的上游引物和下游引物由广州擎科生物技术有限公司合成，其他PCR试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。PCR扩增的程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72℃延伸90 s，循环30次；72 ℃再延伸10 min，最后将所得的PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。

根据琼脂糖凝胶电泳的结果，将PCR阳性样品送往广州擎科生物技术有限公司进行测序，得到菌株HNS2-5-2的16S rDNA基因的核苷酸序列，利用NCBI数据库对该菌的16SrDNA基因进行核苷酸序列比对分析，

比对分析结果表明，菌株HNS2-5-2被鉴定为Wautersiella falsenii菌，菌株HNS2-5-2的16S rDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。最后对HNS2-5-2菌株进行保藏。

HNS2-5-2菌株的保藏信息如下：

保藏时间：2019年5月30日；

保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心；

保藏编号：GDMCC No：60678；

保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；

分类命名：Wautersiella falsenii HNS2-5-2。

实施例3 HNS2-5-2菌株对四环素的降解效果验证

将HNS2-5-2菌株接种于4 mL的M9培养基（1×M9微量盐，2 mM MgSO₄和100 mM CaCl₂）上，并往培养基中加入9 g/L浓度的葡萄糖，100 mg/L硫胺素和100 mg/L亮氨酸。将菌株在37 ℃下黑暗环境中200 rpm振荡培养9 h。然后往培养基中加入8 mg/mL四环素（试剂均购于上海源叶生物），混匀后振荡24 h，随后，离心取上清液，用0.22 mm孔径的滤头过滤上清液，将过滤的上清液稀释10倍并进行LC-MS定量检测。LC-MS定量结果显示：添加HNS2-5-2菌株的实验组24 h后的四环素含量为2.39×10^-3 mg/mL，阴性对照组24 h后的四环素含量为8.43×10^-3 mg/mL。与阴性对照组相比，实验组中四环素的含量下降了71.6%（见图3），表明HNS2-5-2菌株对四环素有高效的降解活性。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 广东省实验中学

<120> 一株四环素类抗生素降解菌及其应用

<141> 2019-06-21

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1425

<212> DNA

<213> Wautersiella falsenii

<400> 3

cggtaatgcg ggaggcttac catgcagccg aggggtatag ttctttcggg aactagagac 60

cggcgcacgg gtgcgtaacg cgtatgcaac ttgccttact gaaaaggata gcccttcgaa 120

aggaggatta atactttata acagatttaa tggcatcatt agattttgaa agatttatcg 180

cagtaggata ggcatgcgta agattagtta gttggtgagg taacggctca ccaagacgat 240

gatctttagg gggcctgaga gggtgaaccc ccacactggt actgagacac ggaccagact 300

cctacgggag gcagcagtga ggaatattgg acaatgggtg gaagcctgat ccagccatcc 360

cgcgtgtagg atgacggcct tatgggttgt aaactacttt tatctgggga taaacctact 420

tacgtgtaag tagctgaagg taccagaaga ataagcaccg gctaactccg tgccagcagc 480

cgcggtaata cggagggtgc aagcgttatc cggatttatt gggtttaaag ggtccgtagg 540

cggattaatc agtcagtggt gaaatctcat agcttaacta tgaaactgcc attgatactg 600

ttagtcttga gtgatgttga agttgctgga atgtgtagtg tagcggtgaa atgcttagat 660

attacgcaga acaccaattg cgaaggcagg tgactaaaca ttaactgacg ctgatggacg 720

aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatggata 780

cttgctgttg gattttcgga ttcagtggct aagcgaaagt tataagtatc ccacctgggg 840

agtacgttcg caagaatgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900

atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttaccaag gcttaaatgc aatttgacag 960

aactagaaat agttttttct tcggacagaa tgcaaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 1020

gtgccgtgag gtgttaggtt aagtcctgca acgagcgcaa cccctatcat tagttgccag 1080

cgtttaaaga cggggactct aatgagactg ccggtgcaaa ccgcgaggaa ggtggggacg 1140

acgtcaagtc atcacggccc ttacgtcttg ggctacacac gtgctacaat ggtaagtaca 1200

gagggcagct acttggcaac aagatgcgaa tctcaaaaac ttatctcagt tcggattgga 1260

gtctgcaact cgactctatg aagctggaat cgctagtaat cgcatatcag ccatgatgcg 1320

gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaag ccatggaagc tgggggtacc 1380

tgaagtcggt gaccgtaata ggagctgcct aggctagacc cgtcg 1425

Claims

1.一株四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株，其特征在于：所述HNS2-5-2菌株于2019年5月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60678。

2.权利要求1所述的四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株在制备降解四环素类抗生素菌剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株在制备降解四环素类抗生素菌剂中的应用，其特征在于，所述四环素类抗生素为四环素、土霉素、金霉素、多西环素、米诺环素中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株在制备降解四环素类抗生素菌剂中的应用，其特征在于，所述四环素类抗生素为四环素。

5.根据权利要求2所述的四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株在制备降解四环素类抗生素菌剂中的应用，其特征在于，所述菌剂的制备方法为：将所述HNS2-5-2菌株用液体培养基进行常规活化培养，8～10 h后收集培养液即可得到菌剂。

6.根据权利要求5所述的四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株在制备降解四环素类抗生素菌剂中的应用，其特征在于，所述菌剂可对药物浓度为32 mg/L以下的四环素进行降解。

7.根据权利要求5所述的四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株在制备降解四环素类抗生素菌剂中的应用，其特征在于，所述菌剂可对药物浓度为32 mg/L以下的土霉素进行降解。

8.根据权利要求5所述的四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株在制备降解四环素类抗生素菌剂中的应用，其特征在于，所述菌剂可对药物浓度为32 mg/L以下的金霉素进行降解。

9.根据权利要求5所述的四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株在制备降解四环素类抗生素菌剂中的应用，其特征在于，所述菌剂可对药物浓度为8 mg/L 的米诺环素进行降解。

10.根据权利要求5所述的四环素类抗生素降解菌HNS2-5-2菌株在制备降解四环素类抗生素菌剂中的应用，其特征在于，所述菌剂可对药物浓度为16 mg/L 以下的多西环素进行降解。