CN114807151B - 用于检测病原微生物的多核酸适体及其组合 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测病原微生物的多核酸适体及其组合，属于生物检测技术领域。本发明公开的核酸适体及其组合，能够特异性结合病原微生物，因此可用于病原微生物的识别和鉴定。本发明核酸适体使用指数富集配体***进化技术筛选，本发明筛选的核酸适体用于检测病原微生物时，特异性强，灵敏度高。此外，核酸适体具有分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短等特点，相比于抗体，更加适用于病原微生物的检测。

Description

用于检测病原微生物的多核酸适体及其组合
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种用于检测病原微生物的多核酸适体及其组合。
背景技术
新冠病毒抗原检测跟病毒核酸检测一样，都是通过检测病毒的组分来判定是否存在新冠病毒。新冠病毒颗粒中，特异性结构蛋白含量是病毒核酸分子的数千倍。新冠抗原检测法直接检测新冠病毒的结构蛋白，不存在扩增放大过程，省去了核酸检测过程中占据时间较长的扩增步骤，所以具有快速、简单、便捷、经济、早期诊断、可信度高等特点。目前，新冠病毒抗原检测主要使用可以特异性结合新冠结构蛋白的抗体来制备抗体夹心法试剂盒。但是由于新冠病毒变异迅速，而新冠结构蛋白的特异性抗体的筛选过程较为繁杂漫长，新冠病毒抗原检测试剂盒还存在极大的提升空间。
核酸适体（aptamer）是指通过指数富集的配基***进化技术（SELEX）筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其它靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析、环境监测、基础学、新药合成等方面展示广阔的前景。相比于抗体，核酸适体具有分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短等特点，核酸适体可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。基于核酸适体的性质，新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适体具有结构相对稳定，简单，易于修饰以及短期内可以人工合成的优势。目前，已有报道核酸适体与抗体的混合夹心法检测新型冠状病毒核衣壳蛋白，但是，实现高灵敏度、高特异性仍存在市场需求。
中国专利CN112941078A公开了一种检测新冠病毒SARS-CoV-2 S1蛋白的核酸适体、筛选方法及其用途。该发明通过体外筛选技术筛选出能和SARS-CoV-2 S1蛋白特异性结合的核酸适体，该核酸适体具有高度的结合性和特异性，能够与SARS-CoV-2 S1蛋白结合，跟其它病毒无交叉反应；具有高度的结合性和特异性，结合SARS-CoV-2 S1蛋白的下限达到1 ng/ml以下。但该专利未对核酸适体与其他蛋白结合的能力做出评价。因此，能够结合多个蛋白位点的核酸适体或核酸适体组合仍需进一步研究。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种用于检测病原微生物的多核酸适体与抗体。
一种核酸适体：所述核酸适体如SEQ ID NO.1-4所示：
如SEQ ID NO.1所示序列N35：
CACGTCGGGGGGGTCACACATGAACCGTGCGGATACGGAGACGAG；
如SEQ ID NO.2所示序列N10：
CGCCTCCTTCCTCTCGGGGTGTGTAGGGTCAGGGAGTGTGAGAGGAGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQ ID NO.3所示序列N2-62：
CGCCTCCTTCCACGGGATCGGATTCCCCACTCGGCTCTATCGGATTGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQ ID NO.4所示序列N2：
CACGCATAGCCGTGCGGATACGGAACCGTACCATGGGCGGTGGGTGGCCTATGCGTG。
优选地，核酸适体还包括对上述的核酸适体进行修饰得到的序列：
修饰包括以下修饰方法的至少一种：
（1）磷酸化；
（2）甲基化；
（3）氨基化；
（4）巯基化；
（5）同位素化；
（6）用硫取代氧；
（7）用硒取代氧；
（8）偶联生物素；
（9）偶联化学发光基团；
（10）偶联化学荧光基团；
（11）偶联多肽；
（12）偶联配体；
（13）偶联siRNA；
（14）偶联治疗性基团；
（15）偶联乳胶微球。
更优选地，乳胶微球包括链霉亲和素修饰。
优选地，所述组合包括以下一种或几种：
（1）N35/N2；
（2）N35/N2-62；
（3）N35/N10；
（4）N2/N2-62；
（5）N2/N10；
（6）N2-62/N10；
（7）N35/N2/N2-62；
（8）N35/N2/N10；
（9）N35/N2-62/N10；
（10）N2/N2-62/N10；
（11）N35/N2/N10/N2-62。
优选地，核酸适体的制备，包括如下步骤：
核酸适体的筛选方法为SELEX（Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，指数富集配体***进化技术）筛选；设计长度为60-80 nt的筛选文库，文库包含中间的随机序列和两端的引物序列；根据设计的筛选文库，筛选出高亲和力的核酸适体。核酸适体具有良好的亲和力、低免疫原性、分子量小、合成成本低、易于保存、方便进行修饰和取代等优点。
本发明还公开了上述核酸适体及其组合在检测病原微生物中的用途。
优选地，病原微生物包括SARS-CoV-2及其突变株。本发明核酸适体与SARS-CoV-2野生型或突变型核衣壳蛋白具有高亲和力，能够特异性结合SARS-CoV-2野生型或突变型核衣壳蛋白，因此可用于对SARS-CoV-2及其突变株的检测，具有高特异性和高灵敏度。
优选地，SARS-CoV-2的有效检测靶点包括核衣壳蛋白。核衣壳蛋白是冠状病毒中含量最丰富的蛋白。核衣壳蛋白是一种具有高度免疫原性的磷蛋白，基因序列非常保守，因此非常适合作为检测标志物。
本发明还公开了上述核酸适体及其组合在制备检测病原微生物所使用的试剂和/或试纸和/或试剂盒中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的核酸适体具有良好的亲和力、低免疫原性、分子量小、合成成本低、易于保存、方便进行修饰和取代等优点，在对病原微生物的检测中能够发挥巨大作用；并且，本发明核酸适体的组合用于检测SARS-CoV-2时，更加高效、准确。
附图说明
图1为单个核酸适体与抗体夹心在试纸条上对核衣壳蛋白的检测效果情况；
图2为双核酸适体组与抗体夹心在试纸条上对核衣壳蛋白的检测效果情况；
图3为三核酸适体组与抗体夹心在试纸条上对核衣壳蛋白的检测效果情况；
图4为多核酸适体组与抗体夹心在试纸条上对核衣壳蛋白的检测效果情况。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
核酸适体的制备
1、构建筛选文库
本研究中所用的ssDNA文库，全长为76 nt，由两端固定的20 nt长度的引物片段和中间30 nt的随机片段构成；正向引物5’修饰FITC荧光基团，与初始文库的5’端固定序列相同；反向引物5’端以Biotin标记，序列与初始文库的3’端固定序列反向互补；
靶向SARS-CoV-2核衣壳蛋白筛选文库序列为：
SEQ ID NO.5：
CTTCTGCACGCCTCCTTCC（N35）GGAGACGAGATCGGCGGACACT。
构建文库所使用的引物为：
正向引物：SEQ ID NO.6：CTTCTGCACGCCTCCTTCC；
反向引物：SEQ ID NO.7：AGTGTCCGCCGATCTCGTCTCC。
2、蛋白与磁珠偶联
取链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠加入SARS-CoV-2核衣壳蛋白或BSA稀释液，室温摇床孵育60 min，使羧基磁珠与蛋白偶联。
3、蛋白筛选
文库变性后与偶联凝胶珠的SARS-CoV-2核衣壳蛋白混合孵育；洗脱后，利用高温将结合在偶联凝胶珠的SARS-CoV-2核衣壳蛋白上的序列分离下来；利用PCR扩增，之后进行单链制备；
文库变性后与偶联BSA的凝胶珠混合孵育；将不与凝胶珠结合的序列收集投入到下一轮筛选中；
如此反复，进行蛋白筛选。
4、核酸适体候选链的挑选
使用qPCR检测筛选进程，为了获得与SARS-CoV-2 N蛋白结合的ssDNA，将第8轮ssDNA富集文库进行高通量测序，挑选核酸适体；得到如下序列：
如SEQ ID NO.1所示序列N35：
CACGTCGGGGGGGTCACACATGAACCGTGCGGATACGGAGACGAG；
如SEQ ID NO.2所示序列N10：
CGCCTCCTTCCTCTCGGGGTGTGTAGGGTCAGGGAGTGTGAGAGGAGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQ ID NO.3所示序列N2-62：
CGCCTCCTTCCACGGGATCGGATTCCCCACTCGGCTCTATCGGATTGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQ ID NO.4所示序列N2：
CACGCATAGCCGTGCGGATACGGAACCGTACCATGGGCGGTGGGTGGCCTATGCGTG。
筛选出以上序列后交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成，合成的核酸适体带有生物素修饰。
实施例2
不同核酸适体与抗体的夹心组合选择
经过试验和筛选，选定的核酸适体组合如表1所示。
表1 核酸适体组合方案
组别 组合
1 N35/N2
2 N35/N2-62
3 N35/N10
4 N2/N2-62
5 N2/N10
6 N2-62/N10
7 N35/N2/N2-62
8 N35/N2/N10
9 N35/N2-62/N10
10 N2/N2-62/N10
11 N35/N2/N10/N2-62
实施例3
乳胶微球标记的核酸适体的制备
将链霉亲和素（SA）修饰的乳胶颗粒（质量分数1%，杭州优思达提供）用超纯水稀释一倍至质量分数为0.5%。然后，向质量分数为0.5%的SA修饰的乳胶颗粒加入4倍过量生物素修饰的核酸适体（生物素修饰的核酸适体由上海生工生物合成）进行交联。将所得到的交联产物通过离心法除去上清液中未结合乳胶颗粒的核酸适体，离心条件为4℃，10000 rpm，10min。然后通过离心法用超纯水洗涤交联产物两次，最终用50 μL的点胶液定容待后续使用。
其中，标记方法有两种，分别为：
1）混合标记，即不同的核酸适体序列标记至同一个乳胶微球标表面；
2）单一标记，即同一种核酸适体序列标记至同一个乳胶微球标表面，然后将不同的乳胶微球进行混合使用；
按照不同的表及方法进行标记，制得不同的乳胶微球标记的核酸适体，用于后续试纸条的制备。
实施例4
试纸条的制备
1、预处理
按配方配制如下处理液：
样品垫处理液：1 M Tris-HCl缓冲液，1% PVP，1% PEG，5% BSA，pH为9.0；
结合垫处理液：0.2 M Tris-HCl缓冲液，5% BSA，1% PVP，2% PEG，20% 蔗糖，pH为8.0；
透析液：0.008 mol/L NaCl，pH 7.0；
配制完成后进行预处理：
样品垫处理：将玻璃纤维浸润在样品垫处理液中，静置30 min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；
结合垫处理：将玻璃纤维浸润在结合垫处理液中，静置30 min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；
抗体透析：将抗体稀释后装入透析袋中依次放入透析液和三蒸水中透析12 h；
2、喷涂乳胶微球
将实施例2中制得的乳胶微球标记的核酸适体通过划膜机喷涂于预处理后的结合垫上，乳胶微球标记的核酸适体质量分数为0.8%，喷量为6 μL/cm；
3、划膜
使用划膜机进行划膜，检测线（T线）使用的抗体为：核衣壳蛋白抗体Cov6，浓度为2mg /mL；
质控线（C线）使用的抗体为：抗链霉亲和素抗体，浓度为1 mg /mL；
4、组合
依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装到PVC板上即得试纸条；
按照上述方法制备不同的试纸条，试纸中核酸适体组合以及标记方法如表2所示。
表2 试纸条包含物
试纸序号 核酸适体 标记方法 试纸序号 核酸适体 标记方法
组合 组合
1 N35 单一标记 14 N2/N2-62/N10 单一标记
2 N2 单一标记 15 N35/N2/N10/N2-62 单一标记
3 N10 单一标记 16 N35/N2 混合标记
4 N2-62 单一标记 17 N35/N2-62 混合标记
5 N35/N2 单一标记 18 N35/N10 混合标记
6 N35/N2-62 单一标记 19 N2/N2-62 混合标记
7 N35/N10 单一标记 20 N2/N10 混合标记
8 N2/N2-62 单一标记 21 N2-62/N10 混合标记
9 N2/N10 单一标记 22 N35/N2/N2-62 混合标记
10 N2-62/N10 单一标记 23 N35/N2/N10 混合标记
11 N35/N2/N2-62 单一标记 24 N35/N2-62/N10 混合标记
12 N35/N2/N10 单一标记 25 N2/N2-62/N10 混合标记
13 N35/N2-62/N10 单一标记 26 N35/N2/N10/N2-62 混合标记
试验例1
核酸适体及其组合检测效果的鉴定
1、单核酸适体试纸条对核衣壳蛋白的检测效果
选择SARS-CoV-2的核衣壳蛋白进行检测，
将上述病毒或病毒核衣壳蛋白使用DPBS缓冲液配制成浓度为1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL的标准液，用胶头滴管吸取标准液，滴3滴在样品垫上，滴加后静置15分钟后进行结果判读：
阳性（+）：出现两条带，检测线和质控线，表示样本中存在SARS-CoV-2；
阴性（-）：仅质控线出现一条带，检测线无条带出现，表示样本中没有SARS-CoV-2；
无效：质控线未出现红色条带，可能是由于不正确的操作或试剂已失效，应重新测试。
此处展示1-4号试纸的检测结果照片（见图1）；结果显示，单个核酸适体最多能检出1 ng/mL，灵敏度一般。
2、双核酸适体组试纸条对核衣壳蛋白的检测效果
与单核酸适体检测方法相同，对双核酸适体组进行检测，受测试纸为5-10号和16-21号；为避免冗余，此处仅展示5-10号试纸的检测结果照片（见图2），16-21号试纸检测结果与5-10号试纸一致，不再展示结果照片；结果显示，双核酸适体组合中，组合N35/N2-62的检测性能最佳，能够检出100 pg/mL，灵敏度高。
3、三核酸适体组试纸条对核衣壳蛋白的检测效果
与单核酸适体检测方法相同，对三核酸适体组进行检测，受测试纸为11-14号和22-25号；为避免冗余，此处仅展示11-14号试纸的检测结果照片（见图3），22-25号试纸检测结果与11-14号试纸一致，不再展示结果照片；结果显示，在核衣壳蛋白1ng/mL水平下，三核酸适体组合都可以出现明显T线，大多数可检测10 pg/mL的核衣蛋白。
4、多核酸适体组试纸条对核衣壳蛋白的检测效果
与单核酸适体检测方法相同，对多核酸适体组进行检测，受测试纸为15号和26号；为避免冗余，此处仅展示15号试纸的检测结果照片（见图4），26号试纸检测结果与15号试纸一致，不再展示结果照片；结果显示，在核衣壳蛋白1 ng/mL水平下，多核酸适体组合都可以出现明显T线，甚至可检测出10 pg/mL的核衣蛋白。相比较而言，四种组合的检测下限最低，灵敏度高。
综上所述，多核酸适体组合较单一核酸适体检测的灵敏度更高，并且，在多核酸适体组合中，最低检测限可达10 pg/mL。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院基础医学与肿瘤研究所（筹）
<120> 用于检测病原微生物的多核酸适体及其组合
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacgtcgggg gggtcacaca tgaaccgtgc ggatacggag acgag 45
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcctccttc ctctcggggt gtgtagggtc agggagtgtg agaggaggag acgagatcgg 60
cg 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcctccttc cacgggatcg gattccccac tcggctctat cggattggag acgagatcgg 60
cg 62
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacgcatagc cgtgcggata cggaaccgta ccatgggcgg tgggtggcct atgcgtg 57
<210> 5
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttctgcacg cctccttccn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnggagac 60
gagatcggcg gacact 76
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttctgcacg cctccttcc 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtgtccgcc gatctcgtct cc 22

Claims (6)

1.一种核酸适体，其特征在于，所述核酸适体包括SEQ ID NO.1-3所示序列的一条或几条：
如SEQIDNO.1所示序列N35：
CACGTCGGGGGGGTCACACATGAACCGTGCGGATACGGAGACGAG；
如SEQIDNO.2所示序列N10：
CGCCTCCTTCCTCTCGGGGTGTGTAGGGTCAGGGAGTGTGAGAGGAGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQIDNO.3所示序列N2-62：
CGCCTCCTTCCACGGGATCGGATTCCCCACTCGGCTCTATCGGATTGGAGACGAGATCGGCG。
2.如权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体包括对权利要求1中所述的核酸适体进行修饰得到的序列：
所述修饰包括以下修饰方法的至少一种：
（1）磷酸化；
（2）甲基化；
（3）氨基化；
（4）巯基化；
（5）同位素化；
（6）用硫取代氧；
（7）用硒取代氧；
（8）偶联生物素；
（9）偶联化学发光基团；
（10）偶联化学荧光基团；
（11）偶联多肽；
（12）偶联配体；
（13）偶联siRNA；
（14）偶联治疗性基团；
（15）偶联乳胶微球。
3.一种核酸适体的组合，其特征在于，所述组合包括以下一种：
（1）N35/N2；
（2）N35/N2-62；
（3）N35/N10；
（4）N2/N2-62；
（5）N2/N10；
（6）N2-62/N10；
（7）N35/N2/N2-62；
（8）N35/N2/N10；
（9）N35/N2-62/N10；
（10）N2/N2-62/N10；
（11）N35/N2/N10/N2-62；
其中，核酸适体N35序列如SEQIDNO.1所示：
CACGTCGGGGGGGTCACACATGAACCGTGCGGATACGGAGACGAG；
核酸适体N10序列如SEQIDNO.2所示：
CGCCTCCTTCCTCTCGGGGTGTGTAGGGTCAGGGAGTGTGAGAGGAGGAGACGAGATCGGCG；
核酸适体N2-62序列如SEQIDNO.3所示：
CGCCTCCTTCCACGGGATCGGATTCCCCACTCGGCTCTATCGGATTGGAGACGAGATCGGCG；
核酸适体N2序列如SEQIDNO.4所示：
CACGCATAGCCGTGCGGATACGGAACCGTACCATGGGCGGTGGGTGGCCTATGCGTG。
4.权利要求1或2中所述核酸适体在非疾病诊断目的的病原微生物SARS-CoV-2检测中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述SARS-CoV-2的有效检测靶点包括核衣壳蛋白。
6.权利要求1或2中所述核酸适体及其组合在制备检测病原微生物SARS-CoV-2所使用的试剂和/或试纸和/或试剂盒中的用途。
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