CN114790426B - 一种毛柄金钱菌菌种在生产伽马氨基丁酸中的应用及其培育方法 - Google Patents
一种毛柄金钱菌菌种在生产伽马氨基丁酸中的应用及其培育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种毛柄金钱菌菌种在生产伽马氨基丁酸中的应用及其培育方法,所述毛柄金钱菌菌种,其菌种名称为Fv‑HL,本发明获得的毛柄金钱菌菌株具备γ‑氨基丁酸高产能力,是用于制造各种富含γ‑氨基丁酸功能食品的良好来源。
Description
技术领域
本发明属于毛柄金钱菌菌种选育技术领域,具体涉及一种毛柄金钱菌菌种在生产伽马氨基丁酸中的应用及其培育方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种天然存在的四碳非蛋白质氨基酸,广泛分布于自然界中。研究证明GABA是参与抑制性突触传递的主要氨基酸类神经递质,具有广泛的生理功能,如降血压、降血糖、调节心律失常、抗焦虑、保护肝脏等。人脑中,GABA可由脑部的谷氨酸在专一性较强的谷氨酸脱羧酶作用下转化而成。但是随着年龄的增长和精神压力的增大,GABA的积累变得异常困难。通过日常饮食的补充,可有效改善这种状况,从而促进人体健康。
除了细菌、真菌和动物外,几乎所有重要经济作物和模式作物中都发现并测定了GABA含量。常见作物如西红柿,菠菜,西兰花等存在的GABA为300~400mg/kg,小麦胚芽中的GABA含量积累到了1630mg/kg。对于食用菌中GABA的研究较少。
目前GABA的常见制备方法有化学合成法、植物富集法和微生物发酵法。化学合成法存在成本高、产率低、反应条件苛刻、易有化学成分残留、易造成环境污染等缺点,不适用于食品、药品等方面。植物富集法成本高、产率低但安全性较好;微生物发酵法成本低、产量高,且不受空间、环境、资源的限制,因此,植物富集法和微生发酵法被更多地选择用于富集GABA。目前尚无高产γ-氨基丁酸毛柄金钱菌选育方法和利用微生物发酵法富集毛柄金钱菌γ-氨基丁酸含量的文献报道。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊,而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面,本发明提供一种毛柄金钱菌菌种在生产伽马氨基丁酸中的应用,其特征在于:所述毛柄金钱菌菌种,其菌种名称为Fv-HL。
作为本发明的另一个方面,本发明提供所述的毛柄金钱菌菌种的培育方法,其由以下步骤组成:
(1)将所述毛柄金钱菌菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基PDA上,培养后收集菌丝;
(2)挑取步骤(1)培养后的毛柄金钱菌,接种于马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基PDB中,避光培养,获得毛柄金钱菌菌丝;
(3)将步骤(1)的菌丝接种到无菌的栽培瓶中培养,进行出菇管理,避光培养,获得毛柄金钱菌子实体。
作为本发明所述的毛柄金钱菌菌种的培育方法的一种优选方案:所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基PDA,其马铃薯葡萄糖琼脂的质量百分含量为3.9~4.5%。
作为本发明所述的毛柄金钱菌菌种的培育方法的一种优选方案:所述马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基PDB,马铃薯葡萄糖肉汤粉末的质量百分含量为2.4~3.0%。
作为本发明所述的毛柄金钱菌菌种的培育方法的一种优选方案:步骤(1)中,所述培养后收集菌丝,培养时间为10~12d。
作为本发明所述的毛柄金钱菌菌种的培育方法的一种优选方案:步骤(1)中,所述培养后收集菌丝,培养温度为为22~25℃。
作为本发明所述的毛柄金钱菌菌种的培育方法的一种优选方案:步骤(2)中,所述避光培养,为22~25℃避光培养10~12d后收集菌丝。
作为本发明所述的毛柄金钱菌菌种的培育方法的一种优选方案:步骤(3)中,所述避光培养,为25℃避光培养50-70d。
作为本发明所述的毛柄金钱菌菌种的培育方法的一种优选方案:步骤(2)中,在所述马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基PDB中添加0.5~1g/L的L-谷氨酸。
作为本发明所述的毛柄金钱菌菌种的培育方法的一种优选方案:步骤(3)中,在栽培瓶中添加2.4~3.2g/L的L-谷氨酸。
本发明的有益效果:本发明获得的毛柄金钱菌γ-氨基丁酸高产菌株Fv-HL,其菌丝体中的GABA含量达到28431.47mg/kg(图4),子实体中GABA含量达到4303.63mg/kg(图5),本发明获得的毛柄金钱菌菌株具备γ-氨基丁酸高产能力,是用于制造各种富含γ-氨基丁酸功能食品的良好来源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。其中:
图1为毛柄金钱菌菌丝体及子实体形态图。
图2为毛柄金钱菌生长过程中的GABA含量变化。
图3为毛柄金钱菌种质子实体不同生长时期图。
图4为毛柄金钱菌菌株Fv-HL菌丝体培养检测得到的GABA含量峰图。
图5为毛柄金钱菌菌株Fv-HL子实体培养检测得到的GABA含量峰图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广,因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1:
主要试剂及培养基配置如下:
PDA固体培养基:马铃薯葡萄糖琼脂粉末39g,1000mL蒸馏水,pH值自然,用于菌丝培养。
PDB液体培养基:马铃薯葡萄糖肉汤粉末24g,1000ml蒸馏水,pH值自然,用于菌丝培养。
种子液体培养基:白砂糖20g,膨化豆粕3.3g,硫酸镁0.66g,磷酸二氢钾0.51g,磷酸氢二钾0.15g,双蒸水定容至1L,pH调至5.8-6.2,用于菌丝培养。
0.1M盐酸:取860μL盐酸加蒸馏水定容至100mL,混匀后储存于密封容器中。
10%三氯乙酸溶液:称取三氯乙酸10g,溶解于100mL蒸馏水中,混匀后储存于密封容器中。
氨基酸提取液:将0.1M盐酸和10%三氯乙酸溶液按体积比1:2配制溶液,混匀后密封避光保存。
为了探究不同品种的毛柄金钱菌GABA含量的差异,从种质资源库中筛选出26株工厂化生产菌株进行栽培试验,编号分别为Fv-WC、ENOKI-J、J54-3、×3E、J5011、WH25、SCY1-2、Fv-SY、ENOKI-H、WX01、ENOKI-I、W1638、XH、FM、Fv-FM、2345、Fv-GF、Fv-RYJ、Fv-KL、Fv-BY、Fv-HTC、ENOKI-G、Fv-GR、Fv-CYS、Fv-YH、Fv-HL,见图1。最终有22株菌株顺利出菇。图1的a为毛柄金钱菌菌丝体生长形态,图1的b为毛柄金钱菌子实体生长形态。
毛柄金钱菌培育及检测方法如下:
(1)将毛柄金钱菌菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)上,25℃培养10d后收集菌丝。
(2)挑取步骤(1)PDA平板上培养后的10块8mm2毛柄金钱菌菌块,接种于马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基(PDB)中,25℃避光培养10d后收集菌丝。
(3)准确称取滤干后的步骤(2)得到的菌丝1g,加入5mL的氨基酸提取液(将0.1M盐酸和10%三氯乙酸溶液按体积比1:2配制溶液),冰浴超声10min,工作条件为超声功率200W,工作时间3.0s,停3.0s。超声结束后,4℃,8000rpm条件下离心10min,取上清液保存于-20℃冰箱,以日立835-50型氨基酸自动分析仪测定γ-氨基丁酸含量。
(4)将步骤(1)中活化的毛柄金钱菌平板接种到无菌的栽培瓶中培养,进行出菇管理。25℃避光培养50-70d后,获得新鲜毛柄金钱菌子实体。
(5)称取成熟期的新鲜毛柄金钱菌子实体150g,置于55℃条件下,热风干燥至恒重。经高速粉碎机粉碎后过60目筛,样品粉末置于阴凉干燥处密封保存。
(6)准确称取待测样品粉末70-80mg,加入6mol/L的盐酸溶液进行酸水解,以日立835-50型氨基酸自动分析仪测定γ-氨基丁酸含量。
利用氨基酸分析仪测定22株毛柄金钱菌子实体的GABA含量(DW),不同品种之间的毛柄金钱菌GABA含量具有明显差异,见表1。
表1 22株毛柄金钱菌子实体的GABA含量(DW)
子实体发育过程中GABA含量的时空变化:利用氨基酸分析仪测定不同生长时期的毛柄金钱菌菌柄和菌盖的GABA含量,见图2,结果显示毛柄金钱菌子实体菌柄和菌盖中的GABA含量均呈现出先下降后上升的趋势,均在第三阶段GABA含量累积达到最大值。在整个子实体发育过程中,无论是在高产或低产GABA菌株中,菌盖中的GABA含量都高于菌柄中的GABA含量。其中Fv-HL成熟期子实体菌盖中的GABA含量高达5056.88mg/kg DW,约是同时期Fv-HL菌柄的1.9倍。图3为毛柄金钱菌种质子实体不同生长时期,图3的(a)-(c)分别为毛柄金钱菌生长第一阶段、生长第二阶段、生长第三阶段,1,2分别代表毛柄金钱菌种质ENOKI-J、Fv-HL。
Fv-HL菌种为记载于《基于遗传多样性构建金针菇的核心种质群体及分子身份证》,菌物学报,高利慧等,2021的已公开菌种。
实施例2:
(1)将毛柄金钱菌Fv-HL菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)上,25℃培养10d后收集菌丝。
(2)挑取步骤(1)PDA平板上培养后的10块8mm2毛柄金钱菌菌块,接种于马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基(PDB)中,25℃避光培养10d后收集菌丝。
(3)准确称取滤干后的步骤(2)得到的菌丝1g,加入5mL的氨基酸提取液(将0.1M盐酸和10%三氯乙酸溶液按体积比1:2配制溶液),冰浴超声10min,工作条件为超声功率200W,工作时间3.0s,停3.0s。超声结束后,4℃,8000rpm条件下离心10min,取上清液保存于-20℃冰箱,以日立835-50型氨基酸自动分析仪测定γ-氨基丁酸含量。
(4)将步骤(1)中活化的毛柄金钱菌平板接种到无菌的栽培瓶中培养,进行出菇管理。25℃避光培养50-70d后,获得新鲜毛柄金钱菌子实体。
(5)称取成熟期的新鲜毛柄金钱菌子实体150g,置于55℃条件下,热风干燥至恒重。经高速粉碎机粉碎后过60目筛,样品粉末置于阴凉干燥处密封保存。
(6)准确称取待测样品粉末70-80mg,加入6mol/L的盐酸溶液进行酸水解,以日立835-50型氨基酸自动分析仪测定γ-氨基丁酸含量。
结果统计:氨基酸分析仪测定毛柄金钱菌菌株Fv-HL菌丝体培养获得的GABA含量为28431.47mg/kg(图4)、子实体培养获得的GABA含量为4303.63mg/kg干重(图5),子实体培养获得的GABA含量为645.54mg/kg鲜重。
研究例:
比较不同菌株分别在不同成分的培养基进行实验室液体培养,测定其在不同培养基中的GABA含量。GABA含量数据显示,以种子液体培养基培养菌丝体,获得的GABA含量为1018.72mg/kg,而以PDB液体培养菌丝体获得的GABA含量为28431.47mg/kg,远高于种子液体培养基。因此,选用PDB培养基作为实验室菌丝体液体培养基。
在PDB培养基中添加L-谷氨酸,观察L-谷氨酸对菌丝水平GABA含量的影响,结果表明,添加0.5~1g/L的低浓度L-谷氨酸可以提高菌株产GABA能力,而高浓度的谷氨酸添加对毛柄金钱菌菌丝体合成GABA有抑制作用。当谷氨酸的添加浓度为0.5g/L时,菌丝体富集GABA含量达到最高,比对照组(实施例2方法,采用PDB培养基,不添加营养物质)提高了41.9%。然而当L-谷氨酸添加浓度为1.5g/L时,菌丝体中的GABA产量低于对照组。随着L-谷氨酸添加浓度的持续增加,菌丝体富集GABA的能力反而下降,这可能是因为菌丝体利用L-谷氨酸进行生物转化GABA的能力是有限的,高浓度的底物会使得细胞膜渗透压力增强,导致菌体生长受到抑制,不利于GABA的积累。
在毛柄金钱菌栽培瓶的固体栽培基质中添加L-谷氨酸,以不添加L-谷氨酸的固体栽培基质作为对照,观察L-谷氨酸对子实体水平GABA含量的影响,结果表明,当L-谷氨酸添加浓度为3.2g/L时,毛柄金钱菌子实体富集GABA产量达到最大,是对照组的1.95倍。继续增加L-谷氨酸添加量,GABA产量未继续上升反而下降,原因可能是在GABA合成通路中,GAD合成GABA的能力是有限的,过高浓度的L-谷氨酸含量,可能使得子实体内部L-谷氨酸达到饱和,不能继续促进GAD脱羧富集GABA反应。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种毛柄金钱菌菌种在生产伽马氨基丁酸中的应用,其特征在于:所述毛柄金钱菌菌种,其菌种名称为Fv-HL。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述毛柄金钱菌菌种,其培育方法由以下步骤组成:
(1)将所述毛柄金钱菌菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基PDA上,培养后收集菌丝;
(2)挑取步骤(1)培养后的毛柄金钱菌,接种于马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基PDB中,避光培养,获得毛柄金钱菌菌丝;
(3)将步骤(1)的菌丝接种到无菌的栽培瓶中培养,进行出菇管理,避光培养,获得毛柄金钱菌子实体。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基PDA,其马铃薯葡萄糖琼脂的质量百分含量为3.9~4.5%。
4.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于:所述马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基PDB,马铃薯葡萄糖肉汤粉末的质量百分含量为2.4~3.0%。
5.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于:步骤(1)中,所述培养后收集菌丝,培养时间为10~12d。
6.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于:步骤(1)中,所述培养后收集菌丝,培养温度为22~25℃。
7.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于:步骤(2)中,所述避光培养,为22~25℃避光培养10~12d后收集菌丝。
8.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于:步骤(3)中,所述避光培养,为25℃避光培养50-70d。
9.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于:步骤(2)中,在所述马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基PDB中添加0.5~1g/L的L-谷氨酸。
10.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于:步骤(3)中,在栽培瓶中添加2.4~3.2g/L的L-谷氨酸。
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