CN114774554A - 上皮样血管内皮瘤分子标志物及其检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其是涉及一种上皮样血管内皮瘤的分子标志物PDGFRA‑USP46融合基因及试剂盒，分子标志物为PDGFRA‑USP46融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该融合基因是由位于染色体4q12上的PDGFRA基因Exon 16末端与位于4q12上的USP46基因Exon 2前端融合形成，属于inversion类型中的splice‑site融合位点。本发明基于一步法qRT‑PCR技术检测上皮样血管内皮瘤的试剂盒，可实现对石蜡包埋组织中PDGFRA‑USP46 mRNA的绝对定量检测，灵敏度和特异性较高，可操作性及重复性强。

Description

上皮样血管内皮瘤分子标志物及其检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其是涉及一种上皮样血管内皮瘤的分子标志物PDGFRA-USP46融合基因及其一步法qRT-PCR检测试剂盒。
背景技术
上皮样血管内皮瘤（Epithelioid Hemangioendothelioma，EHE）是一种少见的恶性血管源性肿瘤，1982年由 Weiss和 Enzinger首先报道及描述一组发生于周围软组织内的血管肿瘤。2020年WHO发表的肉瘤分型认为EHE分为两种，一种是常见的经典的基因t(1;3)(p36.3; q25)易位形成了WWTR1-CAMTA1融合基因，另一种是不常见的YAP1-TFE3融合基因的形成。迄今国内外有关EHE的文献报道约100例，对其临床病理和分子遗传学特征尚缺少足够的认识。约90%的EHE伴有WWTR1-CAMTA1融合基因，典型的病理表现为黏液透明间质内的上皮样内皮细胞巢和条索组成，缺乏血管形成；一小部分(10%)的EHE具有独特的形态，包括明显的血管形成，内皮细胞内衬有丰富的嗜酸性细胞质，并有YAP1-TFE3融合。EHE肿瘤细胞常表达血管相关标记物CD31、CD34、ERG、FLI-1、FⅧ等， CAMTA1融合的肿瘤中CAMTA1(+)，YAP1-TFE3融合的肿瘤中TFE3核(+)。
近年来，分子遗传学研究发现90%以上的EHE具有可重复的染色体易位，形成WWTR1-CAMTA1融合基因。2013年Cristina R等在WWTR1-CAMTA1融合阴性的EHE子集中，检测出YAP1-TFE3基因融合目前，文献已报道的EHE中存在的染色体易位及其融合基因见表1。除WWTR1-CAMTA1与YAP1-TFE3外，Suurmeijer AJH等人2020年在6例病例中检测到不同的WWTR1基因融合，包括WWTR1-MAML2及WWTR1-ACTL6A，其中4例位于心脏。宋等人2020年在EHE中检测到低丰度的PTPRM-CCDC120融合。运用RT-PCR、FISH或二代测序等手段对这些染色体易位或融合基因进行检测，有助于EHE的诊断、分型和鉴别诊断。
表1.目前文献报道上皮样血管内皮瘤存在的染色体易位及其融合基因
Figure 841024DEST_PATH_IMAGE001
近期，申请者运用转录组测序、RT-PCR和FISH技术，在1例人上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织中发现和验证了一个新的融合基因PDGFRA-USP46，它是由位于染色体4q12上的PDGFRA基因Exon 16末端与位于4q12上的USP46基因Exon 2前端融合形成，属于inversion类型中的splice-site融合位点。目前，国内外尚未见PDGFRA-USP46融合基因在上皮样血管内皮瘤或其它肿瘤的研究报道。
本发明致力于提供一种用于上皮样血管内皮瘤诊断与分型的新型融合基因PDGFRA-USP46，以及基于一步法qRT-PCR技术检测上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织中融合基因PDGFRA-USP46的试剂盒，以实现对石蜡组织中PDGFRA-USP46 mRNA的绝对定量检测，从而有利于上皮样血管内皮瘤的诊断与分子分型。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种上皮样血管内皮瘤的分子标志物，该分子标志物有利于上皮样血管内皮瘤的诊断与分子分型；
本发明的第二目的在于提供一种检测人上皮样血管内皮瘤的检测试剂盒，该检测试剂盒可实现对石蜡包埋组织中PDGFRA-USP46 mRNA的绝对定量检测，灵敏度和特异性较高，可操作性及重复性强。
本发明提供一种上皮样血管内皮瘤的分子标志物，所述分子标志物为PDGFRA-USP46融合基因，所述PDGFRA-USP46融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
作为本技术方案优选地，所述PDGFRA-USP46融合基因由位于染色体4q12上的PDGFRA基因Exon 16末端与位于4q12上的USP46基因Exon 2前端融合形成。
作为本技术方案优选地，所述PDGFRA-USP46融合基因的融合位点分别为PDGFRA-chr4:55146649和USP46-chr4:53497311。
本发明针对上述PDGFRA-USP46融合基因还提供了一种检测人上皮样血管内皮瘤的检测试剂盒，也理应属于本发明的保护范围。
作为本技术方案优选地，还包括所述PDGFRA-USP46融合基因的引物组合物。
作为本技术方案优选地，所述引物组合物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列为5’- ATCGTCCAGCCTCATATAAGAAG -3’，如SEQ ID No.2所示，所述反向引物的序列为5’- AAGCACGGAGTTACAGTAGC -3’，如SEQ ID No.3所示。
作为本技术方案优选地，还包括所述PDGFRA-USP46融合基因的探针，所述探针的序列为FAM-5'- ATCTATGTTAGGGCACCAATGCCTCTGCT -3'-BHQ1，如SEQ ID No.4所示。
作为本技术方案优选地，还包括阳性定量参考品，所述阳性定量参考品为含有PDGFRA-USP46融合基因接合位点片段的PESI-T质粒。
作为本技术方案优选地，还包括阴性对照，所述阴性对照为融合基因PDGFRA-USP46呈阴性的软组织血管纤维瘤石蜡包埋组织。
本发明的上皮样血管内皮瘤分子标志物，至少具有以下技术效果：
本发明的上皮样血管内皮瘤分子标志物--PDGFRA-USP46融合基因，是由位于染色体4q12上的PDGFRA基因Exon 16末端与位于4q12上的USP46基因Exon 2前端融合形成，属于inversion类型中的splice-site融合位点。
其中，PDGFRA基因编码的蛋白全名为血小板源性生长因子受体α，是一种细胞表面受体酪氨酸激酶，PDGFRA可以与其相应的配体PDGF结合后活化，再激活磷脂酰肌醇、cAMP及多种蛋白质的磷酸化途径，调控细胞的***和增殖。PDGFRA的突变与胃肠道间质瘤GIST密切相关，其突变发生在大约5-7%的胃肠道间质瘤(GIST)中，尤其是第12/14/18外显子的改变，最常见的突变是第18外显子D842V，与特定的临床病理特征有关，如原发性伊马替尼耐药和更高的惰性。此外，在嗜酸性粒细胞增多的急性髓系白血病可见多种PDGFRA基因融合。
而USP46全称为泛素特异性肽酶，位于4号染色体，目前并无相关融合基因报道。泛素对细胞蛋白质的修饰是由多种泛素结合酶和去泛素化酶的协同作用控制的重要调控机制。USP46属于作为去泛素化酶的一大类半胱氨酸蛋白酶，在多种肿瘤中发挥作用。USP46对于HPV转化的癌症的增殖和肿瘤生长至关重要，而在肝细胞癌、卵巢癌、肺癌和肾细胞癌中USP46低表达，且与预后不良相关。
本发明的上皮样血管内皮瘤的检测试剂盒，通过以PDGFRA-USP46融合基因作为标志物，利用一步法qRT-PCR技术，通过引物的序列设计一条特异性的探针，与扩增产物互补杂交，而荧光的种类和量能特异性的代表目标产物的种类和量。因此，本发明基于一步法qRT-PCR技术的上皮样血管内皮瘤的检测试剂盒，在对上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织中融合基因检测时，可操作性及重复性强，灵敏度和特异性均较高，不仅丰富了上皮样血管内皮瘤的分子分型，且提高对该少见软组织肿瘤的临床病理与分子特征的认识和理解。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为PDGFRA-USP46融合基因形成、表达及测序结果；具体图1A为本发明提供的PDGFRA-USP46融合基因形成示意图；图1B为一步法RT-PCR检测上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织中PDGFRA-USP46 mRNA表达；图1C为PDGFRA-USP46 mRNA测序结果；
图2为一步法RT-PCR检测上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织中WWTR1-CAMTA1和YAP1-TFE3融合基因4种转录体的表达；
图3为本发明提供的PDGFRA-USP46标准品的标准曲线，本实验标准曲线斜率为-3.861，效率值为1.816；
图4为本发明提供的PDGFRA-USP46标准品与上皮样血管内皮瘤组织中PDGFRA-USP46 mRNA的一步法qRT-PCR扩增曲线；
图5为FISH检测上皮样血管内皮瘤中CAMTA1基因重排结果；
图6为FISH检测上皮样血管内皮瘤中TFE3基因重排结果；
图7为上皮样血管内皮瘤RNA测序结果中PDGFRA-USP46基因重排与融合位点分析图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本发明提供了一种上皮样血管内皮瘤分子标志物—PDGFRA-USP46融合基因及其定量检测试剂盒。
技术思路如下：申请人在运用RT-PCR和FISH技术对1例人上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织进行常见的融合基因WWTR1-CAMTA1/YAP1-TFE3和CAMTA1/TFE3基因重排检测无果后，通过高通量测序（RNA-sq）技术，在该样本中检测出一个新的融合基因：PDGFRA-USP46，分析发现该融合基因由位于染色体4q12上的PDGFRA基因Exon 16末端与位于4q12上的USP46基因Exon 2前端融合形成（图1A），属于inversion类型中的splice-site融合位点，其融合位点分别为PDGFRA-chr4：55146649和USP46-chr4:53497311。
由于此PDGFRA-USP46融合基因为国内外首次发现，申请人进一步设计和优选PDGFRA-USP46的扩增引物，运用一步法RT-PCR技术在此例上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织中成功扩增到一个150bp的阳性目的片段，通过对PCR产物行Sanger测序并使用NCBI数据库进行比对，证实为融合基因PDGFRA-USP46，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
与此同时，申请人提供了基于一步法qRT-PCR技术实现对石蜡组织中PDGFRA-USP46 mRNA的绝对定量检测试剂盒，该试剂盒可操作性及重复性强，灵敏度和特异性较高，有助于EHE的诊断与分子分型。
一、实验材料
1.上皮样血管内皮瘤和对照病例组织样本
本组1例上皮样血管内皮瘤（Epithelioid hemangioendothelioma，EHE）和1例对照病例软组织血管纤维瘤（Angiofibroma of soft tissue，AFST）均为***固定、石蜡包埋组织，其临床病理信息见表2。
表2上皮样血管内皮瘤和对照病例临床病理信息表
Figure 108058DEST_PATH_IMAGE002
2. 实验中各种PCR相关引物与探针序列
2.1 PDGFRA-USP46融合基因引物及探针设计
因本申请PDGFRA-USP46融合基因是由染色体4q12上的PDGFRA基因Exon 16末端与4q12上的USP46基因Exon 2前端融合形成，其融合位点分别为PDGFRA-chr4:55146649和USP46-chr4:53497311。因此，发明人在设计引物时，通过已知的PDGFRA基因序列和USP46基因序列，设计了PDGFRA-USP46融合基因的正向和反向引物，其序列见表3，该融合基因的扩增片段大小为150bp。同样，根据PDGFRA-USP46融合基因序列，设计了该融合基因特异性探针，其序列见表3，用于qRT-PCR对PDGFRA-USP46融合基因进行定量检测。
表3 实验所用PCR引物和探针序列表
Figure 306958DEST_PATH_IMAGE003
2.2常见融合基因WWTR1-CAMTA1/YAP1-TFE3引物序列
本申请还分别设计和合成了上皮样血管内皮瘤中常见融合基因WWTR1-CAMTA1/YAP1-TFE3的4对引物，其序列和扩增片段大小均见表3。
2.3 阳性定量参考品的制备
通过SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的正向引物和反向引物对从上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织中提取的总RNA进行扩增，得到150bp长度的含PDGFRA-USP46融合基因位点的片段产物，将其导入PESI-T质粒，转入大肠杆菌进行大量培养，提取纯化质粒，测定质粒浓度，计算单位体积的拷贝数，按比例稀释，得到阳性定量质粒参考品系列：1×106 copies/ml、1×105 copies/ml、1×104 copies/ml、1×103 copies/ml和1×102 copies/ml。
3. FISH探针
表4实验所用的FISH探针
Figure 975836DEST_PATH_IMAGE004
4. 其它主要试剂
1）Trizol试剂（Invitrogen）
2）Proteinase K (PK) Solution（Promega）
3）QIAGEN One Step RT-PCR Kit（Qiagen）
4）RNeasy FFPE Kit (Qiagen)
5）TruSeq RNA Exome Kit (Illumina Inc)
6）CAMTA1分离探针（安必平）
7）TFE3分离探针（安必平）；
8）胃蛋白酶工作液（安必平）
9）DAPI染色液（安必平）
10）50×EDTA（安必平）
11）2×SSC（安必平）
12）0.1% NP-40/2×SSC（安必平）
二、实验方法与步骤
1. 一步法RT-PCR和qRT-PCR
1.1石蜡包埋肿瘤组织RNA的抽提
新刀连续切取10μm蜡膜10张，置入1.5 ml消毒离心管中；加1.0 ml二甲苯55℃孵育10分钟；13000 rpm/4℃离心2分钟；重复1次；加100％酒精1.0ml室温孵育10分钟，13000rpm/4℃离心2分钟，弃上清；重复1次；加提前配置细胞裂解液250ul后13000 rpm/4℃离心10秒，混匀；加蛋白酶K（Protease K）（20mg/ml）50ul，55℃干式恒温器中过夜（12小时）。
干式恒温器中95℃ 5分钟灭活蛋白酶K，13000 rpm/4℃离心2分钟，弃沉淀，收集上清液至2ml离心管中；加1.0 ml Trizol液（Invitrogen）入离心管中，室温孵育5分钟；加氯仿200 ul后用vortex剧烈混匀15秒，室温孵育5分钟；然后13000 rpm/4℃离心10分钟；移水相至另一2.0 ml离心管中(约700 ul) 按1:1体积(即700 ul)加异丙醇，吹打后室温10分钟，–25℃沉淀30分钟；13000 rpm/4℃10分钟，弃上清；加75%酒精1.0ml，上下颠倒离心管数次；离心13000 rpm/4℃ 5分钟，弃上清，干燥；加无酶水50ul溶解RNA (30-60分钟)，Nanodrop测RNA浓度及A260/A280和A260/A230比值并记录。
1.2一步法RT-PCR
1.2.1样本RNA一步法RT-PCR扩增反应
取标记好的200μL无酶EP管，按照表5配制PCR扩增反应体系，混匀，离心；
表5 一步法RT-PCR扩增反应体系
Figure 969200DEST_PATH_IMAGE005
将加入反应体系的EP管放入PCR仪，按如下设置的反应条件开始PCR扩增：
Figure 661213DEST_PATH_IMAGE006
1.2.2 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳
制胶：按照琼脂糖2.5g，1×TAE100mL，Gelstain10μL配方制琼脂糖凝胶。
电泳：将琼脂糖凝胶放入电泳槽，加满1×TAE，在每胶孔中加入8μL PCR产物、标准带孔加入2μL 50bp DNA marker，调节电压90V，持续30min。
曝光：将琼脂糖凝胶放入曝光仪自动曝光并拍照保存。
1.3一步法qRT-PCR
1.3.1取标记96孔板，按表6配制qRT-PCR扩增反应体系，混匀，离心；
表6一步法qRT-PCR扩增反应体系
Figure 398225DEST_PATH_IMAGE007
1.3.2将加入反应体系的96孔板放入Light Cycler 480 PCR仪，按设置反应条件开始PCR扩增（根据长度等设定退火温度、时间等）
Figure 921610DEST_PATH_IMAGE008
1.3.3数据读取、分析与结果计算
LightCycler 480 PCR仪根据标准品溶液系列浓度1×106、1×105、1×104、l×103、1×102 copies/mL，绘制标准曲线。
LightCycler 480 PCR仪***软件读取与分析PDGFRA-USP46融合基因的表达数据，并与标准曲线对比后，计算出组织样品中PDGFRA-USP46融合基因的含量（copies/mL）。
2. 二代测序
1例上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织送索真公司分别进行转录组测序和肉瘤panel测序（BSR）。
3.组织荧光原位杂交（FISH）
3.1制片与脱蜡
3.1.1制片
连续切取3μm白片5张，烤箱中60℃烘烤2小时。
3.1.2脱蜡
将玻片放入室温二甲苯中10分钟，三次；取出玻片，放入100%乙醇中3分钟，三次；取出玻片，室温去离子水中洗一遍。
3.2 切片预处理
将玻片放入1×EDTA工作液中，置于99℃水浴锅中25分钟，取出后冷却至室温，用去离子水冲洗一遍；将玻片放入室温2×SSC中浸泡3分钟，室温晾干；玻片样本区滴加预热（37℃水浴锅中，预热15分钟）的胃蛋白酶消化液200ul，放入杂交仪中37℃孵育7分钟；甩去玻片上多余液体，放入室温2×SSC中，3分钟；取出玻片，分别放入70%、90%、100%乙醇中各1分钟；取出玻片，室温晾干。
3.3变性杂交
从-20℃冰箱中取出CAMTA1分离探针及TFE3分离探针，震荡混匀，离心15s ；玻片样本区分别滴加CAMTA1/ TFE3分离探针10ul，迅速放置盖玻片，轻压使探针液均匀分布；然后用封片胶沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片和载玻片接触部位；将玻片放入杂交仪（Thermo Fisher，美国）中，杂交仪湿度条湿润后***杂交仪，盖好杂交仪上盖，设置程序：85℃变性5分钟，然后37℃避光杂交过夜16小时。
3.4洗涤和复染
先将2×SSC、0.1%NP-40/2×SSC放入37℃恒温水浴锅中，预热30分钟；关闭杂交仪电源，取出玻片后去除橡皮封胶，移去盖玻片；将玻片放入预热37℃的2×SSC中，10分钟；取出玻片再放入预热37℃的0.1%NP-40/2×SSC中5分钟；取出玻片按顺序分别放入室温70%，90%，100%乙醇中1分钟；取出玻片，暗处晾干；室温下，滴加10ul DAPI染色液于干燥的载玻片上，轻压盖玻片，避免产生气泡，暗处存放，荧光显微镜下观察。
3.5结果判读
玻片置荧光显微镜高倍镜及油镜下进行观察，应选择细胞核大小一致，胞核边界完整，DAPI染色均一，核无重叠，信号清晰的细胞。
3.5.1 CAMTA1分离探针检测
随机计数100个癌细胞核中的双色信号。当红、绿两种信号的距离大于信号长度的两倍时，认为是CAMTA1分离阳性细胞。
判读标准：若阳性细胞大于15%（15个细胞），则为CAMTA1分离阳性。
3.5.2 TFE3分离探针检测
随机计数100个肿瘤细胞核中双色信号。当红、绿两种信号的距离大于信号长度的两倍时，认为是TFE3分离阳性细胞。
判读标准：若阳性细胞大于15%（15个细胞），则该病例为TFE3分离阳性。
三、结果
1. 一步法RT-PCR和qRT-PCR检测融合基因的表达
1.1上皮样血管内皮瘤中PDGFRA-USP46等融合基因的表达
选取1例上皮样血管内皮瘤（EHE）的石蜡包埋组织，以1例软组织血管纤维瘤（AFST）为阴性对照，使用PDGFRA-USP46引物SEQ ID No.2和SEQ ID No.3进行一步法RT-PCR。
凝胶电泳显示，上皮样血管内皮瘤（EHE）组织扩增出150bp的PDGFRA-USP46目的条带，而阴性对照软组织血管纤维瘤（AFST）组织及和空白对照均为阴性。Sanger测序结果与NCBI数据库中的序列一致（图1 B，图1C）。PDGFRA-USP46的核苷酸序列见附表SEQ ID No.1。
运用一步法RT-PCR技术检测上皮样血管内皮瘤中常见融合基因WWTR1-CAMTA1/YAP1-TFE3四种转录体的结果显示，该2例病例及阴性对照中均未检测到WWTR1-CAMTA1/YAP1-TFE3四种转录体表达（图2，图2中从左到右四种转录体分别为WWTR1(ex4)-CAMTA1(ex9)、WWTR1(ex3)-CAMTA1(ex9)、YAP1(ex1)-TFE3(ex4)和YAP1(ex1)-TFE3(ex6)），该结果也与RNA-Seq高通量测序结果一致（图7）。
1.2qRT-PCR检测EHE中PDGFRA-USP46 mRNA的表达
上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织，成功抽提RNA，以软组织血管纤维瘤作为阴性对照，一步法qRT-PCR检测上皮样血管内皮瘤样本中PDGFRA-USP46 mRNA的表达，本实验标准曲线斜率为-3.861，效率值为1.816（图3）。与标准曲线对比后，PDGFRA-USP46 mRNA的定量结果见表7和图4。
表7 EHE组织中PDGFRA-USP46 mRNA定量检测结果
Figure 351454DEST_PATH_IMAGE009
2. 二代测序结果
本次1例上皮样血管内皮瘤的转录组测序结果分析并未发现目前文献已报道的常见融合基因WWTR1-CAMTA1/YAP1-TFE3四种转录体的存在。
但是，在该例上皮样血管内皮瘤样本检测到一个新的PDGFRA-USP46基因融合，融合位点具体为：PDGFRA—chr4:55146649；USP46--chr4:53497311，PDGFRA基因exon16末端（chr4:55146649）与USP46基因exon2前端（chr4:53497311）融合，属于inversion类型中的splice-site融合位点（图7）。
通过已知的PDGFRA基因的序列和USP46基因的序列，以及RNA-Seq预测的断裂结合位点，申请者进一步拼接出PDGFRA-USP46基因的序列SEQ ID No.1。
3. FISH检测结果
3.1上皮样血管内皮瘤中CAMTA1基因重排检测结果
使用CAMTA1双色分离探针对EHE样本进行CAMTA1基因重排检测，FISH结果显示：计数100个肿瘤细胞，阳性细胞0个，CAMTA1基因重排阴性（图5）。该结果与之前融合基因WWTR1-CAMTA1的RT-PCR检测结果一致。
3.2上皮样血管内皮瘤中TFE3基因重排检测结果
使用TFE3双色分离探针对EHE样本进行TFE3基因重排检测，FISH结果显示，计数100个细胞，阳性细胞0个，TFE3基因重排阴性（图6）。该结果与之前融合基因YAP1-TFE3的RT-PCR检测结果一致。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京朝阳医院
<120> 上皮样血管内皮瘤分子标志物及其检测试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 248
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctatgttatt ttatcttttg aaaacaatgg tgactacatg gacatgaagc aggctgatac 60
tacacagtat gtccccatgc tagaaaggaa agaggtttct aaatattccg acatccagag 120
atcactctat gatcgtccag cctcatataa gaagaaatct atgttagggc accaatgcct 180
ctgctctgga aaaagacatt ggtccagagc agtttccaat caatgaacac tatttcggat 240
tggtcaat 248
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcgtccagc ctcatataag aag 23
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagcacggag ttacagtagc 20
<210> 4
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atctatgtta gggcaccaat gcctctgct 29

Claims (9)

1.一种上皮样血管内皮瘤的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为PDGFRA-USP46融合基因，所述PDGFRA-USP46融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的上皮样血管内皮瘤的分子标志物，其特征在于，所述PDGFRA-USP46融合基因由位于染色体4q12上的PDGFRA基因Exon 16末端与位于4q12上的USP46基因Exon 2前端融合形成。
3.根据权利要求1所述的上皮样血管内皮瘤的分子标志物，其特征在于，所述PDGFRA-USP46融合基因的融合位点分别为PDGFRA-chr4和USP46-chr4。
4.一种检测上皮样血管内皮瘤的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述PDGFRA-USP46融合基因的试剂。
5.根据权利要求4所述的检测上皮样血管内皮瘤的检测试剂盒，其特征在于，还包括所述PDGFRA-USP46融合基因的引物组合物。
6.根据权利要求5所述的检测上皮样血管内皮瘤的检测试剂盒，其特征在于，所述引物组合物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID No.2所示，所述反向引物的序列如SEQ ID No.3所示。
7.根据权利要求4所述的检测上皮样血管内皮瘤的检测试剂盒，其特征在于，还包括所述PDGFRA-USP46融合基因的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.4所示。
8.根据权利要求4所述的检测上皮样血管内皮瘤的检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性定量参考品，所述阳性定量参考品为含有PDGFRA-USP46融合基因接合位点片段的PESI-T质粒。
9.根据权利要求4所述的检测上皮样血管内皮瘤的检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照，所述阴性对照为融合基因PDGFRA-USP46呈阴性的软组织血管纤维瘤石蜡包埋组织。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070275404A1 (en) * 2006-05-10 2007-11-29 Van De Rijn Jan M Gene expression signatures associated with tumor stromal cells
CN112094915A (zh) * 2020-11-17 2020-12-18 苏州科贝生物技术有限公司 一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组及试剂盒
WO2021096888A1 (en) * 2019-11-12 2021-05-20 Foundation Medicine, Inc. Methods of detecting a fusion gene encoding a neoantigen
CN113278611A (zh) * 2021-03-07 2021-08-20 华中科技大学同济医学院附属协和医院 捕获测序探针及其用途
CN114245807A (zh) * 2019-06-25 2022-03-25 吉利德科学公司 Flt3l-fc融合蛋白和使用方法
CN114574590A (zh) * 2022-05-06 2022-06-03 首都医科大学附属北京朝阳医院 软组织血管纤维瘤分子标志物及其检测试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070275404A1 (en) * 2006-05-10 2007-11-29 Van De Rijn Jan M Gene expression signatures associated with tumor stromal cells
CN114245807A (zh) * 2019-06-25 2022-03-25 吉利德科学公司 Flt3l-fc融合蛋白和使用方法
WO2021096888A1 (en) * 2019-11-12 2021-05-20 Foundation Medicine, Inc. Methods of detecting a fusion gene encoding a neoantigen
CN112094915A (zh) * 2020-11-17 2020-12-18 苏州科贝生物技术有限公司 一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组及试剂盒
CN113278611A (zh) * 2021-03-07 2021-08-20 华中科技大学同济医学院附属协和医院 捕获测序探针及其用途
CN114574590A (zh) * 2022-05-06 2022-06-03 首都医科大学附属北京朝阳医院 软组织血管纤维瘤分子标志物及其检测试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
N. SAVAGE等: "Myeloid neoplasms associated with eosinophilia andrearrangement ofPDGFRA,PDGFRB, andFGFR1: a review", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF LABORATORY HEMATOLOGY》 *
NIKOLA HOLTKAMP等: "Characterization of the amplicon on chromosomal segment 4q12 in glioblastoma multiforme", 《NEURO-ONCOLOGY》 *
王艳芳,等: "应用FISH技术检测嗜酸性粒细胞增多症PDGFRA基因异常表达", 《中国实验血液学杂志》 *

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