CN114774493A - 一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法 - Google Patents

一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法，包括以下步骤：低温冻干粉碎，紫外辐照后酶解，热水‑超声浸提，提取桑黄粗多糖，脱脂、脱色素、脱蛋白处理，透析，最终得到高纯度的桑黄活性物质多糖。本发明通过紫外辐照处理，将酶解与超声联合提取，最大程度地将桑黄多糖提取出来，最后通过脱脂、脱色素、脱蛋白处理，得到高纯度桑黄多糖。本发明提供的方法提取率高，提取时间短，操作方便，获得的桑黄多糖纯度高，具有极大的药用价值。

Description

一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法
技术领域
本发明属于活性物质提取技术领域，具体涉及一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法。
背景技术
桑黄(Phellinus igniarius)，是一种大型珍稀药用真菌，属担子菌纲，味甘辛、微苦。现代研究表明，桑黄具有抗肿瘤、抗氧化等功效，桑黄的这种功效主要是其中的桑黄活性物质起作用，而多糖是其活性物质中含量最丰富的。目前，有桑黄多糖产品用于癌症治疗，但市场上价格昂贵，将桑黄多糖作为免疫型药物用于临床是近年来***的一个新方向，它以多种功能参与机体的代谢调节活动，近年来越来越受到人们的重视，对桑黄多糖的研究也逐渐增多。
目前对桑黄多糖的研究主要集中于桑黄子实体，桑黄生长周期较长，得到子实体耗费时日与原料比较多，应用于生产和医疗的价格昂贵，使用不够广泛。若桑黄菌丝体多糖的含量与成分与子实体的差别甚微，则可以对菌丝体中的多糖进行提取与加工，这样可以减少大量经济成本，可以应用于市场。传统的样品前处理主要是采用水煮方法，萃取时间长达6小时以上，耗能高，且粗多糖的得率低，仅为生药的2％。然后粗桑黄多糖经凝胶过滤技术进行提纯，过程繁琐，耗时较长，而且产品纯度低，一般在25％左右，作为药物制剂需要更高纯度的桑黄多糖产品。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化的方法以克服现有技术中存在的桑黄多糖得率低、纯度不高的技术缺陷。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法，包括以下步骤：
(1)低温冻干粉碎：将洗净后的桑黄菌丝体在低温下粉碎，过筛后得到桑黄粉；
(2)紫外辐照后酶解：将步骤(1)得到的桑黄粉放入紫外辐照场中进行辐照，随后加入去离子水、复合酶，酶解后过滤，得到酶解滤液和滤渣；
(3)浸提：接着将步骤(2)中得到的滤渣加入去离子水，进行超声波浸提，提取完成后离心，取上清液，得到浸提液和残渣；
(4)提取桑黄粗多糖：将步骤(2)得到的酶解滤液和步骤(3)得到的浸提液合并，加热浓缩，离心，去除沉淀，上清液中加入95％乙醇，静置24h，离心，收集沉淀，干燥得桑黄粗多糖；
(5)脱脂、脱色素、脱蛋白处理：将步骤(4)得到的桑黄粗多糖加入石油醚，离心，吸取并弃去石油醚，重复2次，除去脂类物质；向脱脂后的多糖中加入过氧化氢至浓度为20％，水浴反应，除色素，用氨水调节多糖溶液的pH至7.0；向脱色素后粗多糖样品中加入三氯乙酸至浓度为5％，静置，离心，弃沉淀，重复3次，得到脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液；
(6)透析：选用7000D的透析袋，将步骤(5)中得到的脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液用透析袋透析，得到纯化后的桑黄多糖溶液，随后减压浓缩，得到纯化后的桑黄多糖。
优选的，所述步骤(1)的粉碎温度为-65～-45℃，过筛目数为40～80目。
优选的，步骤(2)中紫外辐照剂量为1000～1500mJ/cm2；所述复合酶为果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶混合制得，三种酶的质量比为1：1：1。
优选的，步骤(2)中所述桑黄粉与去离子水的料液比为1g：45～50mL；所述桑黄粉与复合酶的质量比为10：1，酶解温度为25～30℃，酶解时间为5～10min。
优选的，步骤(3)中所述滤渣与去离子水的料液比为1g：45mL，所述超声波提取温度为50～70℃，超声波提取时间为15～30min，离心速率为4000～5000r/min，离心时间为15～30min。
优选的，步骤(5)中离心速度为1800～2000r/min，离心时间为15～20min。
优选的，步骤(5)中过氧化氢浓度为5％，水浴温度为45～50℃，水浴时间为1～2h。
优选的，步骤(5)中三氯乙酸的浓度为1.5mol/L，静置温度为60℃，静置时间为30min。
优选的，步骤(6)中所述透析时间为24h，每2～3h换一次水。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明首先通过对桑黄菌丝体进行低温冻干粉碎，在低温状态下，可以使细胞壁内的细胞液处于冷冻状态，粉碎时不会残留在机器内壁；同时低温状态下的桑黄菌丝脆性大，更易于粉碎，有效提高粉碎效率；粉碎后的桑黄粉还处理较低温度，将其立即放入常温下的低共熔溶剂水溶液，在热胀冷缩和渗透的作用下，破坏桑黄菌丝体的细胞壁，更快的提取出桑黄活性物质多糖。
(2)本申请通过应用紫外辐照技术提取桑黄菌丝体中的活性物质多糖，提高了多糖的提取率，同时在酶解和超声波的联合提取作用下，大大缩短了提取时间，提高了提取效率；最后通过对多糖的脱脂、脱色素、脱蛋白处理，提高了多糖的纯度，制备得到的桑黄活性物质多糖的纯度高，具有极大的药用价值。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法，包括以下步骤：
(1)低温冻干粉碎：将洗净后的桑黄菌丝体在-65℃下粉碎，过40目筛后得到桑黄粉；
(2)紫外辐照后酶解：将步骤(1)得到的桑黄粉(10g)放入紫外辐照场中进行辐照，辐照剂量为1000mJ/cm2，随后加入450mL的去离子水、1g复合酶(果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶的质量比为1：1：1)，25℃下酶解5min，过滤后得到酶解滤液和滤渣；
(3)浸提：接着将步骤(2)中得到的滤渣(10g)加入450mL的去离子水，在50℃下超声波浸提15min，提取完成后以4000r/min的速率离心15min，取上清液，得到浸提液和残渣；
(4)提取桑黄粗多糖：将步骤(2)得到的酶解滤液和步骤(3)得到的浸提液合并，加热浓缩，离心，去除沉淀，上清液中加入等体积的95％乙醇，静置24h，离心，收集沉淀，干燥得桑黄粗多糖；
(5)脱脂、脱色素、脱蛋白处理：将步骤(4)得到的桑黄粗多糖加入50mL石油醚，1800r/min离心15min，吸取并弃去石油醚，重复2次，除去脂类物质；向脱脂后的多糖中加入浓度为5％的过氧化氢至多糖浓度为20％，45℃下水浴反应1h，除色素，用氨水调节多糖溶液的pH至7.0；向脱色素后粗多糖样品中加入1.5mol/L三氯乙酸至多糖浓度为5％，60℃下静置30min，离心，弃沉淀，重复3次，得到脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液；
(6)透析：选用7000D的透析袋，将步骤(5)中得到的脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液用透析袋透析，透析时间为24h，每2h换一次水，得到纯化后的桑黄多糖溶液，随后减压浓缩，得到纯化后的桑黄多糖。
实施例2
一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法，包括以下步骤：
(1)低温冻干粉碎：将洗净后的桑黄菌丝体在-55℃下粉碎，过60目筛后得到桑黄粉；
(2)紫外辐照后酶解：将步骤(1)得到的桑黄粉(10g)放入紫外辐照场中进行辐照，辐照剂量为1200mJ/cm2，随后加入480mL的去离子水、1g复合酶(果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶的质量比为1：1：1)，27℃下酶解8min，过滤后得到酶解滤液和滤渣；
(3)浸提：接着将步骤(2)中得到的滤渣(10g)加入450mL的去离子水，在60℃下超声波浸提20min，提取完成后以4500r/min的速率离心20min，取上清液，得到浸提液和残渣；
(4)提取桑黄粗多糖：将步骤(2)得到的酶解滤液和步骤(3)得到的浸提液合并，加热浓缩，离心，去除沉淀，上清液中加入等体积的95％乙醇，静置24h，离心，收集沉淀，干燥得桑黄粗多糖；
(5)脱脂、脱色素、脱蛋白处理：将步骤(4)得到的桑黄粗多糖加入50mL石油醚，1900r/min离心18min，吸取并弃去石油醚，重复2次，除去脂类物质；向脱脂后的多糖中加入浓度为5％的过氧化氢至多糖浓度为20％，48℃下水浴反应1.5h，除色素，用氨水调节多糖溶液的pH至7.0；向脱色素后粗多糖样品中加入1.5mol/L三氯乙酸至多糖浓度为5％，60℃下静置30min，离心，弃沉淀，重复3次，得到脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液；
(6)透析：选用7000D的透析袋，将步骤(5)中得到的脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液用透析袋透析，透析时间为24h，每3h换一次水，得到纯化后的桑黄多糖溶液，随后减压浓缩，得到纯化后的桑黄多糖。
实施例3
一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法，包括以下步骤：
(1)低温冻干粉碎：将洗净后的桑黄菌丝体在-45℃下粉碎，过80目筛后得到桑黄粉；
(2)紫外辐照后酶解：将步骤(1)得到的桑黄粉(10g)放入紫外辐照场中进行辐照，辐照剂量为1500mJ/cm2，随后加入500mL的去离子水、1g复合酶(果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶的质量比为1：1：1)，30℃下酶解10min，过滤后得到酶解滤液和滤渣；
(3)浸提：接着将步骤(2)中得到的滤渣(10g)加入450mL的去离子水，在70℃下超声波浸提30min，提取完成后以5000r/min的速率离心30min，取上清液，得到浸提液和残渣；
(4)提取桑黄粗多糖：将步骤(2)得到的酶解滤液和步骤(3)得到的浸提液合并，加热浓缩，离心，去除沉淀，上清液中加入等体积的95％乙醇，静置24h，离心，收集沉淀，干燥得桑黄粗多糖；
(5)脱脂、脱色素、脱蛋白处理：将步骤(4)得到的桑黄粗多糖加入50mL石油醚，2000r/min离心20min，吸取并弃去石油醚，重复2次，除去脂类物质；向脱脂后的多糖中加入浓度为5％的过氧化氢至多糖浓度为20％，50℃下水浴反应2h，除色素，用氨水调节多糖溶液的pH至7.0；向脱色素后粗多糖样品中加入1.5mol/L三氯乙酸至多糖浓度为5％，60℃下静置30min，离心，弃沉淀，重复3次，得到脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液；
(6)透析：选用7000D的透析袋，将步骤(5)中得到的脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液用透析袋透析，透析时间为24h，每3h换一次水，得到纯化后的桑黄多糖溶液，随后减压浓缩，得到纯化后的桑黄多糖。
对比例1
一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法，包括以下步骤：
(1)低温冻干粉碎：将洗净后的桑黄菌丝体在-65℃下粉碎，过40目筛后得到桑黄粉；
(2)酶解：将步骤(1)得到的桑黄粉(10g)加入450mL的去离子水、1g复合酶(果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶的质量比为1：1：1)，25℃下酶解5min，过滤后得到酶解滤液和滤渣；
(3)浸提：接着将步骤(2)中得到的滤渣(10g)加入450mL的去离子水，在50℃下超声波浸提15min，提取完成后以4000r/min的速率离心15min，取上清液，得到浸提液和残渣；
(4)提取桑黄粗多糖：将步骤(2)得到的酶解滤液和步骤(3)得到的浸提液合并，加热浓缩，离心，去除沉淀，上清液中加入等体积的95％乙醇，静置24h，离心，收集沉淀，干燥得桑黄粗多糖；
(5)脱脂、脱色素、脱蛋白处理：将步骤(4)得到的桑黄粗多糖加入50mL石油醚，1800r/min离心15min，吸取并弃去石油醚，重复2次，除去脂类物质；向脱脂后的多糖中加入浓度为5％的过氧化氢至多糖浓度为20％，45℃下水浴反应1h，除色素，用氨水调节多糖溶液的pH至7.0；向脱色素后粗多糖样品中加入1.5mol/L三氯乙酸至多糖浓度为5％，60℃下静置30min，离心，弃沉淀，重复3次，得到脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液；
(6)透析：选用7000D的透析袋，将步骤(5)中得到的脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液用透析袋透析，透析时间为24h，每2h换一次水，得到纯化后的桑黄多糖溶液，随后减压浓缩，得到纯化后的桑黄多糖。
对比例2
一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法，包括以下步骤：
(1)低温冻干粉碎：将洗净后的桑黄菌丝体在-65℃下粉碎，过40目筛后得到桑黄粉；
(2)紫外辐照：将步骤(1)得到的桑黄粉(10g)放入紫外辐照场中进行辐照，辐照剂量为1000mJ/cm2，随后加入450mL的去离子水，25℃搅拌5min后过滤，得到滤液和滤渣；
(3)浸提：接着将步骤(2)中得到的滤渣(10g)加入450mL的去离子水，在50℃下超声波浸提15min，提取完成后以4000r/min的速率离心15min，取上清液，得到浸提液和残渣；
(4)提取桑黄粗多糖：将步骤(2)得到的滤液和步骤(3)得到的浸提液合并，加热浓缩，离心，去除沉淀，上清液中加入等体积的95％乙醇，静置24h，离心，收集沉淀，干燥得桑黄粗多糖；
(5)脱脂、脱色素、脱蛋白处理：将步骤(4)得到的桑黄粗多糖加入50mL石油醚，1800r/min离心15min，吸取并弃去石油醚，重复2次，除去脂类物质；向脱脂后的多糖中加入浓度为5％的过氧化氢至多糖浓度为20％，45℃下水浴反应1h，除色素，用氨水调节多糖溶液的pH至7.0；向脱色素后粗多糖样品中加入1.5mol/L三氯乙酸至多糖浓度为5％，60℃下静置30min，离心，弃沉淀，重复3次，得到脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液；
(6)透析：选用7000D的透析袋，将步骤(5)中得到的脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液用透析袋透析，透析时间为24h，每2h换一次水，得到纯化后的桑黄多糖溶液，随后减压浓缩，得到纯化后的桑黄多糖。
分别计算实施例1～3及对比例1～2中提取率和纯化后多糖纯度的数值，计算公式如下，计算结果汇总见表1所示。
提取率％(g/g)＝桑黄粗多糖/桑黄粉量×100％。
取纯化后的多糖溶液10mL，利用醇沉、离心、干燥的方法得到多糖质量。采用苯酚-硫酸显色法求出桑黄多糖的浓度，进而计算出桑黄粗多糖纯化后的纯度。
纯化后多糖纯度(％)＝C1/C2*100％
式中：C1为纯化后多糖中纯多糖的浓度；C2为纯化前多糖的浓度。
表1桑黄多糖的提取率及纯度测试结果
桑黄粗多糖提取率(％) 桑黄多糖纯度(％)
实施例1 6.53 73.6
实施例2 6.21 68.5
实施例3 6.48 72.1
对比例1 3.19 36.1
对比例2 2.94 34.9
如上表结果，对比例1-2中的桑黄粗多糖提取率均低于实施例1-3，说明经过本发明的提取方法可以提高桑黄多糖的提取率，实施例1-3桑黄多糖的纯度均高于对比例1-2，说明经过本发明提纯方法可以提高桑黄多糖的纯度。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种桑黄活性物质多糖的提取及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)低温冻干粉碎：将洗净后的桑黄菌丝体在低温下粉碎，过筛后得到桑黄粉；
(2)紫外辐照后酶解：将步骤(1)得到的桑黄粉放入紫外辐照场中进行辐照，随后加入去离子水、复合酶，酶解后过滤，得到酶解滤液和滤渣；
(3)热水-超声浸提：接着将步骤(2)中得到的滤渣加入去离子水，进行超声波浸提，提取完成后离心，取上清液，得到浸提液和残渣；
(4)提取桑黄粗多糖：将步骤(2)得到的酶解滤液和步骤(3)得到的浸提液合并，加热浓缩，离心，去除沉淀，上清液中加入95％乙醇，静置24h，离心，收集沉淀，干燥得桑黄粗多糖；
(5)脱脂、脱色素、脱蛋白处理：将步骤(4)得到的桑黄粗多糖加入石油醚，离心，吸取并弃去石油醚，重复2次，除去脂类物质；向脱脂后的多糖中加入过氧化氢至浓度为20％，水浴反应，除色素，用氨水调节多糖溶液的pH至7.0；向脱色素后粗多糖样品中加入三氯乙酸至浓度为5％，静置，离心，弃沉淀，重复3次，得到脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液；
(6)透析：选用7000D的透析袋，将步骤(5)中得到的脱脂、脱色素、脱蛋白的多糖溶液用透析袋透析，得到纯化后的桑黄多糖溶液，随后减压浓缩，得到纯化后的桑黄多糖。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)的粉碎温度为-65～-45℃，过筛目数为40～80目。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中紫外辐照剂量为1000～1500mJ/cm2；所述复合酶为果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶混合制得，三种酶的质量比为1：1：1。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述桑黄粉与去离子水的料液比为1g：45～50mL；所述桑黄粉与复合酶的质量比为10：1，酶解温度为25～30℃，酶解时间为5～10min。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述滤渣与去离子水的料液比为1g：45mL，所述超声波提取温度为50～70℃，超声波提取时间为15～30min，离心速率为4000～5000r/min，离心时间为15～30min。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(5)中离心速度为1800～2000r/min，离心时间为15～20min。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(5)中过氧化氢浓度为5％，水浴温度为45～50℃，水浴时间为1～2h。
8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(5)中三氯乙酸的浓度为1.5mol/L，静置温度为60℃，静置时间为30min。
9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(6)中所述透析时间为24h，每2～3h换一次水。
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