CN1147729C - 半定量金标免疫层析测试条及诊断盒 - Google Patents

半定量金标免疫层析测试条及诊断盒

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CN1147729C CNB981228925A CN98122892A CN1147729C CN 1147729 C CN1147729 C CN 1147729C CN B981228925 A CNB981228925 A CN B981228925A CN 98122892 A CN98122892 A CN 98122892A CN 1147729 C CN1147729 C CN 1147729C
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Abstract

本发明涉及半定量金标免疫层析测试条，由样品吸收区、固相化金粒标记特异抗体区、固相化阻断试剂区、试验区(T区)、对照区(C区)、吸水纸区构成。其特征在于固相化阻断试剂能同待测样品结合，C区为质量控制及半定量对照带。该测试条将T区色带深浅与C区比较，可半定量测出样品浓度范围。

Description

半定量金标免疫层析测试条及诊断盒
技术领域
本发明涉及一种半定量金标免疫层析测试条，更具体地说利用抗原、抗体相反应原理在特定的载体上用显色深浅进行检测的测试条。
背景技术
快速斑点免疫结合试验是80年代中期发展起来的固相标记免疫测定新技术、其原理是以微孔滤膜为载体，通过渗滤或毛细管作用使抗原抗体反应快速进行，检测过程数分钟内完成，阳性反应在膜上出现着色斑点。最初建立的为酶标记的免疫渗滤试验，其后以胶体金等有色微粒作为标记物，不但减少了操作步骤，而且试剂可在室温长期保存，如：为简便快速地进行抗乙型肝炎(乙肝)病毒核心抗原(HBcAg)的抗体(包括抗HBcIgG和抗HBcIgM)的检测常用酶免疫测定法(EIA)。此后科学家对抗HBc的检测方法进行改进建立了简便快速的滴金免疫HBcAg(滴金法)。当时应用的是间接法模式，包被抗原为价格昂贵的高纯度酵母菌重组HBcAg。国产HBcAg含杂质较多，试用时出现假阳性。后又经进一步研究，建立了捕获法模式的检测抗HBc IgM及IgG抗体的滴金法，经初步应用，效果满意。
新发展的免疫层析试验将各种反应试剂分点固定在同一试条上，检测标本加在试条的一端，将一种试剂溶解，通过毛细管作用移行与膜上另一种试剂接触，发生反应。这样就简化成为一个试剂、一步完成的快速诊断试验。最简单的试剂犹如生化检验中测定尿糖的试纸条，浸取标本即可观察结果，本试验的特点是单份测定，简便、快速，除商品试剂外不需任何仪器设备，因此特别适用于小型化验室、医师诊所和急诊检验。在临床检验中应用最广的首推检测尿液人绒毛膜***(HCG)的早孕诊断试剂，操作简便，可在家中自行测试。其次为传染病抗原或抗体的检测，已有多种商品试剂供应。
虽然免疫金技术是近年来发展起来的一门免疫组织化学新技术。随着免疫细胞化学技术的迅速发展，为了不断探索优化更为敏感、安全而可靠的新方法，学者们一直在寻求更好的标记物。在免疫荧光、免疫酶、放射免疫等技术发展的同时，免疫胶体金技术越来越受到广大免疫细胞化学者的重视。但上述的各种方法尚存在一定缺陷，目前可以采用一步法进行免疫检测主要是定性尚不能作到半定量或定量。
发明内容
本发明的目的是寻找一种能快速简便对血液、尿液、唾液中的“化验成分”(即称抗原)具有半定量检测抗原浓度范围的金标免疫层析测试条。
本发明采用胶体金技术使之需“化验成分”(即抗原)与抗体相反应的原理，在含有胶体金等抗体的特定载体上显示出颜色并根据色带深浅与固化金粒标记单克隆特异抗体A色带的颜色深浅作一比较，决定抗原浓度范围。采用胶体金技术是以胶体金作为一种标记物，它能稳定又迅速地吸附蛋白而蛋白的生物活性无明显改变。胶体金是指金的水溶液，它具有一般溶胶的特性。溶胶的颜色取决于分散相物质的颜色。对同一种物质的水溶液来说，粒子大小不同，呈现的颜色亦不同，一般应用于免疫组织化学的胶体金颗粒为5-60nm范围内呈现红色。胶体金与足够的绒毛膜***(hCG)抗体、***(LH)抗体、胚癌抗原(CEA)抗体、甲胎蛋白(α-FP)抗体、肝表面抗原(BHsAg)、心肌钙蛋白(Troponine)结合，其保持红色不变，此胶体金亦即标记蛋白质，再将此胶体金包被于玻璃纤维纸上真空抽干，制成第三区固相化金粒标记单克隆特异抗体A。在硝酸纤维素膜上包被有纯化的兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG和抗α-hCG抗体、抗FSH抗体、抗LH抗体、抗CEA抗体、α-FP抗体、TSH抗体、PSA抗体、HBsAg抗体和心肌钙抗体等分别在硝酸纤维素膜上划线，包被后置37℃烘箱内放置20分钟切成小条分别制成第四区固相化单克隆特异性抗体B(T区)，第五区固相化羊抗鼠抗体或兔抗鼠抗体(C区)。
第二区则是采用阻断剂由测试样品中的抗原与阻断剂中的抗体发生结合一中和反应，“阻断剂”可以是抗体、蛋白质、氨基酸或其他化学物质。购自加拿大Gellix公司，产品名为Geni Block试剂。
第一区为玻璃纤维层，第六区为吸水纸。
试纸条或盒的制备(见图2)：取一块10mm PVC一面贴有双面胶的塑料板，将玻璃纤维粘贴在塑料板的底部，作为第一区。
第二区为从市场上购得的阻断剂。
第三区为胶体金标记β-hCG抗体或FSH抗体或LH抗体或CEA抗体或α-FP抗体或肝表面抗原或心肌钙蛋白抗体，可根据测验试样品的要求而变化胶体金标记的不同蛋白抗体作为第三区。
第四区为硝酸纤维膜上包被抗α-hCG、抗FSH、抗LH、抗CEA、抗α-FP、抗TSH、抗HbsAg、抗心肌蛋白相对抗体，所用不同的抗蛋白抗体主要是根据测试样品要求与第三区作对应的变化。
第五区为硝酸纤维膜上包被兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG。
第六区是吸水纸片，将多余的水份吸干。
待测物质可以是抗原，如hCG、LH、FSH、CEA、α-FP、TSH、PSA、HBsAg、心肌钙蛋白等也可以是抗体，也可以为其他化合物。
待测样品滴加在“纸条”第一区—玻璃纤维，液体随即被吸收，以毛细管原理上行，待测液溶解第二区“阻断”试剂，其包含的抗原与“阻断”试剂发生结合—中和反应。“阻断”试剂量越高，中和结合抗原量越多。结合的抗原丧失与抗体A和B再结合的能力。液体上行至第三区，溶解金标抗体A，未中和抗原与金标抗体A形成免疫复合物-紫玫瑰色。这种紫色液体继续上行，至T区时，形成“抗体B-抗原-抗体A-金粒”沉淀线。沉淀线颜色深浅与抗原量、“阻断试剂量”有线性关系。紫色液体继续上行至第五区—“C区”时，与“C区”固相化羊抗鼠抗体或兔抗鼠抗体相遇，因单克隆抗体都属于小鼠克隆抗体，故不管抗原存在与否，“C区”总会有一条沉淀线出现-“羊抗鼠抗体·鼠单克隆抗体·金粒”。此条色带一般作为质量控制：如“C区”不出现紫带，则说明“纸带”失活，测试必须重做。本发明中，“C区”除作质量控制外，亦作为“半定量对照带”，即“C区”的颜色深度代表一定的抗原浓度含量。
在测试设定的时间，如5分钟或10分钟时，将“T区”的色带深浅与“C区”颜色比较，以决定抗原浓度范围。
附图说明：
图1是硝酸纤维膜上包被兔抗鼠抗体或羊抗鼠抗体和抗α-hCG抗体或抗FSH抗体或抗LH抗体或抗CEA抗体或抗α-FP抗体或PSA抗体或抗HBsAg抗体或抗心肌钙蛋白抗体其中1为包被兔抗鼠抗体的区带或羊抗鼠抗体的区带。
2为包被抗α-hCG抗体的区带。
图2是半定量一步法免疫诊断试纸
3为第一区：样品吸收区
4为第二区：固相化阻断试剂
5为第三区：固相化金粒标记单克隆特异抗体A
6为第四区：固相化单克隆特异性抗体B(T区)
7为第五区：固相化羊抗鼠抗体或兔抗鼠抗体C区
8为第六区：吸水纸片
具体实施方式
实施例1  应用测试条半定量测定绒毛膜***hCG在尿中含量测试条的制作：
一材料
1.兔抗鼠IgG(亲和纯化)：由华美生物公司上海分公司提供
2.hCG标准品：由上海生物化学制药厂生产
3.吸水纸片：采用上海造纸研究所生产的抄片定量吸水纸
4.抗β-hCG抗体、抗α-hCG抗体、Buffer F、胶体金、硝酸纤维素膜、玻璃纤维纸等均由美国提供。
5.新鲜尿液标本：由上海第二医科大学瑞金医院提供
6.“hCG阻断剂”(由加拿大温哥华Gellix公司购得)
二方法：
1.胶体金标记β-hCG抗体：分别取所需的胶体金及相应量的β-hCG抗体，在搅拌振荡下，使其结合，加10％的BSA作稳定剂。用离心法除去游离的未结合的β-hCG抗体及未充分稳定的金颗粒和其凝聚物。在离心管底部深红色沉淀即为胶体金-抗β-hCG抗体复合物。
2.纯化：
用聚乙二醇洗涤沉淀物，离心去上清液，得深红色沉淀。
3.沉淀部分用buffer溶解疏松红色沉淀物。铺玻璃纤维纸，真空抽干。
4.包被将硝酸纤维素膜剪成0.5×10cm的尺寸，用纯化的兔抗鼠IgG和抗α-hCG在硝酸纤维素膜上划线(如图所示)，包被后置37℃烘箱20分钟。
5.取一块尺寸为10cm×12cm厚约0.5mmd一面贴有双面胶的塑料底板，分别将滤纸、标记有β-hCG抗体的金标纸、包被有兔抗鼠及抗α-hCG抗体的硝酸纤维素膜和滤纸按图2所示的方法制作。
根据尿样品中的hCG含量设定三个临界值：300、1200、20000mIμ/ml按其阻断剂量1、5.0、25.0μl不同将测试条分为A、B、C型三组将上述测试条的第一区***尿液中(尿液不得超过第三区)，待5分钟后，尿液在层析作用下向上缓慢移动，将标记在玻璃纤维纸上的抗β-hCG抗体溶解且呈动态并带动其向上渗入到硝酸纤维素膜上。如果尿液呈阳性，即尿液中含有hCG激素且≥25mIU/ml时，由于抗β-hCG抗体-hCG-α-hCG抗体-金的搭桥作用，膜上包被有α-hCG抗体之处即显胶体金特有的红色。尿液-着色剂继续朝上渗透，到达包被有兔抗鼠抗体的位置。此区带即显红色，为对照线。当尿液中hCG≥300mIU/ml时，A型试条即硝酸纤维素膜上呈现两条红色带，呈阳性反应，如只出现一条红色带，即尿液中hCG≤300mIU/ml。
实验结果计算如表1所示(测试时间：5分钟)
表1：
    纸条型号     临界值mIU/ml “阻断试剂”加量μl   C区代表值mIU/ml    实验结果mIU/ml
    A     300     1.0     300     如T＞C，则浓度＞300
    B     1,200     5.0     1,200     如T＞C，则浓度＞1,200
    C     20,000     25.0     20,000     如T＞C，则浓度＞20,000
试验一：
将hCG标准品3050mIU/ml稀释至阴性尿液，配制成300、600、1,200和20,000mIU/ml，以此阴性尿液，用纸条A型、B型、C型作检测，结果列为表2。
hCG标准品3,050mIU/ml、用正常尿液稀释成150、300、600、12K、2.4K、10K、20K、40K mlU/ml溶液。
表2：
                                试验结果(5分钟)
    型号临界值         A300mIU/ml        B1.2 mIU/ml     C20KmIU/ml
    hCG浓度     A型  hCG浓度     B型  hCG浓度     C型
    150mIU/ml300mIU/ml600mIU/ml   T＜C    600mIU/mlT＝C    1.2KmIU/mlT＞C    2.4KmIU/ml   T＜C  10KmIU/mlT＝C  20KmIU/mlT＞C  40KmIU/ml     T＜CT＝CT＞C
试验二：
从临床上，分三次收集孕妇尿样29，30和35例。以酶标方法与一步法半定量纸条作对照检测，结果如表3所示。酶标法与半定量纸条法相关率三次分别为：
                                  表3-1：临床试验1
    待测对象号..     酶联法mIU/ml     A型300临界值     B型1.2K临界值     C型20K临界值
    001     51K     T＞＞C     T＞＞C     T＞＞C
    008     135     T＝/＜C     T＜C     -
    010     24K     T＞＞C     T＞＞C     T＞C
    011     2,050     T＞C     T＝/＞C     -
    012     1,200     T＞C     T＝C     -
    020     410     T＝C     T＜C     -
    023*     70K     T＝C     T＝C     T＝C
    048     60K     T＞＞C     T＞＞C     T＞＞C
    057     2,000     T＞＞C     T＝C     -
    061     8     -     -     -
    062     500     T＞C     T＜C     -
    079     2,100     T＞＞C     T＞C     T＜C
    083     2,300     T＞＞C     T＞C     T＜＜C
    084     3,900     T＞＞C     T＞C     T＜C
    100     2,350     T＞＞C     T＞C     T＜C
    101     10     -     -     -
    102     3,300     T＞＞C     T＞C     T＜C
    123     13,000     T＞＞C     T＞＞C     T＜C
    147     825     T＞＞C     T＞C     T＜C
    182     155     T＜C     -     -
    194     265     T＝C     T＜＜C     -
    199     14K     T＞＞C     T＞＞C     T＞C
    201     1,550     T＞C     T＞C     T＜＜C
    214     17K     T＞＞C     T＞＞C     T＝/＞C
    236     2,900     T＞＞C     T＞＞C     T＜C
    240     1,000     T＞＞C     T＝C     -
    243     5,750     T＞＞C     T＞＞C     T＜C
    247     5,250     T＞＞C     T＞＞C     T＝C
    251     12     T＜＜C     -     -
    合计                          相关性
    29     100％     96.5％     93.1％
注意：“-”表示无测试线，    23号病例用 Clomit治疗。
表3-2：
                                       临床试验2
    待测对象No.     酶联法mIU/ml     A型300临界值     B型1.2K临界值     C型20K临界值
    04     28K     T＞C     T＞C     T＞C
    05     21.5K     T＞C     T＞C     T＞C
    06     474     T＞C     T＜C     -
    07     3.3K     T＞C     T＞C     -
    08     1.2K     T＞C     T＝C     -
    09     6.4K     T＞C     T＞C     T＜＜C
    10     5.4K     T＞C     T＞C     T＜＜C
    11     9K     T＞C     T＞/＝C     -
    12     63K     T＞C     T＞C     T＞C
    13     2.4K     T＞C     T＞/＝C     -
    23     28     -     -     -
    24     25K     T＞C     T＞C     T＞C
    25     2.7K     T＞C     T＞C     T＜C
    26     24K     T＞C     T＞C     T＞/＝C
    27     3K     T＞C     T＞C     -
    28     4K     T＞C     T＞/＝C     -
    29     2.9K     T＞C     T＞C     T＜＜C
    30     4.0K     T＞C     T＞C     T＜＜C
    31     1.8K     T＞C     T＞C     -
    32     21.6K     T＞C     T＞C     T＞C
    33     23K     T＞C     T＞C     T＞C
    34     2.6K     T＞C     T＞C     T＜＜C
    36     19K     T＞C     T＞C     T＞C
    37     12K     T＞C     T＞C     T＝C
    38     20K     T＞C     T＞C     T＝C
    39     11.8K     I＞C     T＞C     T＜C
    41     7.6K     T＞C     T＞C     T＜C
    47     30     T＜C     -     -
    48     3.2K     T＞C     T＞C     T＜C
    50     25.5K     T＞C     T＞C     T＜C
    合计                                相关性
    100％     90.0-100％     96.6％
表3-3
                                      临床试验3
                                      批号9804
    待测对象No.     酶联法mIU/ml     A型300临界值     B型1.2K临界值     C型20K临界值
    01     3.1K     T＞C     T＞C     T＜C
    02     3.2K     T＞C     T＞C     -
    03     5.6K     T＞C     T＞C     T＞C
    04     1.1K     T＞C     T＝C     -
    05     48.0K     T＞C     T＞C     T＞C
    06     3.6K     T＞C     T＞C     T＜C
    07     2.8K     T＞C     T＞C     T＜C
    08     23.5K     T＞C     T＞C     T＞/＝C
    09     9.4K     T＞C     T＞C     T＞C
    10     2.4K     T＞C     T＞C     T＜C
    11     6.2K     T＞C     T＞C     T＞C
    12     61.0K     T＞C     T＞C     T＞C
    13     8.0K     T＞C     T＞C     T＜C
    14     38.0K     T＞C     T＞C     T＞C
    15     6.0K     T＞C     T＞C     -
    17     8.6K     T＞C     T＞C     T＝C
    18     1.1K     T＞C     T＝C     T＜C
    19     1.1K     T＞C     T＝C     T＜C
    20     4.3K     T＞C     T＞C     -
    21     4.4K     T＞C     T＞C     T＜C
    22     2.7K     T＞C     T＞C     T＜C
    23     28.4K     T＞C     T＞C     T＞C
    24     6.6K     T＞C     T＞C     T＜C
    25     24.0K     T＞C     T＞C     T＞C
    26     32.0K     T＞C     T＞C     T＞C
    27     5.0K     T＞C     T＞C     T＜C
    28     12.0K     T＞C     T＞C     T＜C
    29     5.4K     T＞C     T＞C     T＜C
    30     1.3K     T＞C     T＝C     -
    31     2.8K     T＞C     T＞C     -
    32     20.8K     T＞C     T＞C     T＞C
    33     3.0K     T＞C     T＞C     -
    34     6.1K     T＞C     T＞C     T＜C
    35     5.6K     T＞C     T＞C     -
    36     5.5K     T＞C     T＞C     -
    合计                            相关性
    35     100％     100％     91.4％
酶标法与半定量纸条法相关率三次分别为表3
表3
                半定量纸条法
    A型     B型     C型
    酶     第一次29例     100％   96.5％     93.1％
    标     第一次30例     100％   90～100％     96.6％
    法     第一次35例     100％   100％     91.4％
试验三：
从临床上，分二次收集孕妇尿样各25例。以羊红血球方法与一步法半定量纸条作对照检测，结果如表4所示。
表4
                                       临床实验4
                                       批号9801
    待测对象No.     酶联法mIU/ml     A型300临界值     B型1.2K临界值     C型20K临界值
    01     ＜312     T＜C     T＜C     T＜C
    02     ＜312     T＜C     T＜C     T＜C
    03     ＞312     T＞C     T＞C     T＜C
    04     ＞312     T＞C     T＜C     T＜C
    05     ＞625     T＞C     T＜C     T＜C
    06     ＞625     T＞C     T＜C     T＜C
    07     1250     T＞C     T＞C     T＜C
    08     5000     T＞C     T＞C     T＜C
    09     10000     T＞C     T＜C     T＜/＝C
    10     20K     T＞C     T＞C     T＞C
    11     40K     T＞C     T＞C     T＞C
    12     80K     T＞C     T＞C     T＞C
    13     ＞160K     T＞C     T＞C     T＞C
    14     ＜312     T＜C     T＜C     T＜C
    15     312     T＞C     T＜C     T＜C
    16     625     T＜C     T＜C     T＜C
    17     1250     T＞C     T＞C     T＜C
    18     2500     T＞C     T＞C     T＜C
    19     5000     T＞C     T＞C     T＜C
    20     10K     T＞C     T＞C     T＜C
    21     20K     T＞C     T＞C     T＞C
    22     20K     T＞C     T＞C     T＞C
    23     10K     T＞C     T＞C     T＜C
    24     160K     T＞C     T＞C     T＞C
    25     160K     T＞C     T＞C     T＞C
                            相关性
合计25     96％     100％     100％
羊红血球法与半定量纸条法相关率为：
          半定量纸条法
    A型     B型     C型
  羊红血球方法     25例     96％     100％     100％
实施例2.应用测试条半定量***LH在尿中含量
该测试条是检测尿中***LH的浓度范围，所用材料同hCG半定量测试条，只是用了一对LH单克隆抗体(自制)和“LH阻断试剂”(GelIix，Vancouva，Canada)。纸条型号A、B、C的临界值分别为300、500、1,000mIU/ml，用LH标液稀释至LH阴性尿液中，配制成不同浓度LH阳性待测尿样，测试结果如表5所示。
表5：
  测试条型号     临界值mIu/ml   LH阻断试剂加量μl   C区代表值mIu/ml     待测溶液配制值mIu/ml     测试结果
    A     300     3.0     300     1500400     T＜CT＞C
    B     500     6.0     500     400600     T＜CT＞C
    C     1,000     12.0     1,000     8001,200     T＜CT＞C
实施例3
               ***特异抗原PSA半定量测试盒该测试盒是测血液中***特异抗原Prostate Specific Ait:gen(PSA)的浓度范围。所用材料为一对PSA单克隆抗体(自制)和阻断试剂Geni Blockreagent(Gellix，Vancouva，Canada)。测试盒为A和B型。
表6
  测试盒型号   临界值ng/ml   阻断试剂加量μl     C区代表值ng/ml   待测溶液ng/ml     测试结果
    A     4     0     4     246     T＜CT＝CT＞C
    B     20     0.5     20     152025     T＜CT＝CT＞C
实施例4
            促甲状腺素TSH半定量测试盒该测试盒是检测血液中促甲状腺素TSH的浓度范围。以决定待测对象-成人或婴儿是否TSH水平过高。所用材料，试验区和金标抗体为一对TSH单克隆抗体(自制)，对照区C1和C2为羊抗鼠多克隆抗体。C1代表低剂量“半定量对照带”，C2代表高剂量“半定量对照带”。
表7
    测试盒临界值设定     待测溶液     测试结果
    C1 20μIU/mlC2 60μIU/ml     152025556065    T＜C1C1＝T＜C2C1＜T＜C2C1＜T＜C2C1＜T＝C2C2＜T

Claims (5)

1、一种半定量金标免疫层析测试条，由下而上包括第一区样品吸收区、第三区固相化金粒标记特异抗体A、第四区固相化与A相对应的特异抗体B即T区、第五区固相化非特异性抗体即C区、第六区吸水纸区，其特征在于在第一区和第三区之间还包括第二区固相化阻断试剂区，固相化阻断试剂能同待测样品结合，所述的C区为质量控制及半定量对照带，其反应后的颜色深浅代表事先设定的抗原临界值浓度，反应后T区的颜色与抗原的浓度成线性关系，在反应后，将T区的颜色深浅与C区颜色相比较，可半定量测出抗原浓度范围。
2、根据权利要求1所述的半定量金标免疫层析测试条，其特征在于固相化阻断试剂是抗体、蛋白质、氨基酸。
3、根据权利要求1所述的半定量金标免疫层析测试条，其特征在于固相化阻断试剂区还可以并入第三区。
4、根据权利要求1所述的半定量金标免疫层析测试条，其特征在于待测物质可以是抗原，包括hCG、LH、FSH、CEA、α-FP、TSH、HbsAg、PSA、心肌钙蛋白，也可为抗体。
5、一种半定量金标免疫层析诊断盒，其特征在于包含一种半定量金标免疫层析测试条，该测试条由下而上包括第一区样品吸收区、第二区固相化阻断试剂区、第三区固相化金粒标记特异抗体A、第四区固相化与A相对应的特异抗体B即T区、第五区固相化非特异性抗体即C区、第六区吸水纸区，所述的C区为质量控制及半定量对照带，其反应后的颜色深浅代表事先设定的抗原临界值浓度，反应后T区的颜色与抗原的浓度成线性关系，在反应后，将T区的颜色深浅与C区颜色相比较，可半定量测出抗原浓度范围。
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