CN114752601B - 调控水稻柱头外露的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控水稻柱头外露的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:2，该基因能够用于提高栽培稻的柱头外露水平，从而提高杂交水稻的结实率和产量。

Description

调控水稻柱头外露的基因及其应用

技术领域

本发明属于水稻基因工程领域，具体地说，涉及一种新发现的调控水稻柱头外露的基因RSE1和RSE2及其在杂交育种中的应用。

背景技术

亚洲栽培稻(Oryza sativa)由普通野生稻(Oryza rufipogon)驯化产生，是人类最重要的粮食作物之一。野生稻是异花授粉，而栽培稻是自花授粉。柱头外露率是衡量水稻异交水平的关键指标之一。在野生稻中，部分颖花或全部颖花在开花完全、内外稃闭合后，雌蕊柱头会残留在颖花外表面，这种现象称为柱头外露(Sigma Exsertion)(Yan,etal.2009)。但柱头外露在栽培稻中很少存在或柱头外露率比较低。柱头外露代表了两种不同的生殖方式，野生稻的异交生殖和栽培稻的自交生殖。异交生殖向自交生殖的转变是野生稻向栽培稻驯化过程中重要的生理机制变化，这种转变对降低栽培稻的子代分离具有重要意义，研究这种传代方式的变化将对水稻的驯化研究产生重要意义(Purugganan andFuller,2009)。

在杂交育种过程中，育种学家选择亲本材料最关注影响杂交种产量的一系列性状，如亲本的抽穗期和开花期、花粉数量和花粉寿命、穗型、柱头大小和形态以及植株异交水平，其中异交水平是影响杂交稻制种的最重要性状之一。松散穗型、大柱头和高水平柱头外露构成野生稻异交行为的发育学基础，柱头外露水平是决定植株异交水平的核心因素之一。田间观察发现裸露在外的柱头可以帮助植株获取更多的花粉，外露柱头在外界保留活性的时间要显著长于开花过程中颖花打开与关闭的窗口时间，这有利于植株克服花期不一致导致的传粉障碍，增加了不同水稻植株间互相授粉形成杂交种的几率。田间调查发现，杂交水稻雌性亲本的柱头外露水平升高可以显著提高杂交籽粒的结实率和产量。

水稻柱头的外露水平在驯化过程中扮演着极为重要的作用。基因组学研究发现，野生稻自然群体基因组水平的平均杂合率接近10％，而完全驯化的栽培稻自然群体基因组的平均杂合率基本为零(Song,et al.2010)。基因组杂合程度差异的产生是现代栽培稻柱头不再外露、完全自花授粉的必然结果。由于柱头外露和穗型松散，野生稻个体之间更容易进行遗传信息的交流，并不可避免的将一些基因组片段带入其他植株基因组中，这为野生稻适应不同的环境选择提供了重要的突变来源。遗传信息的交流也导致子代群体产生了更多的遗传突变和形态多样性，这是水稻驯化的重要基础。为满足人了不断增长的粮食需求，人类通过定向选择驯化野生稻以获得可以稳定传种并高产的水稻品种。伴随着人类的定向选择，水稻的授粉方式由异交转变为完全自交，水稻遗传多样性显著下降，基因组由高度杂合转化为高度纯和，同时驯化性状的等位基因数量也显著下降。栽培稻的基因组具有高度稳定性，有利性状的控制基因得以稳定存在并在子代中保持。为保持这种稳定性，柱头外露在人类驯化过程中被定向选择掉。

目前，水稻柱头外露的研究已经取得了一定的进展，但其详细的遗传机制和发育调控网络还很不清楚。遗传研究发现，水稻柱头外露是典型的多基因控制的复杂数量性状，受到多种外界环境的影响，包括风、温度、湿度、光照等(Miyata,et al.2007)，这增加了相关研究的困难程度。随着分子标记技术的进步，遗传学研究的手段不断丰富。在过去数十年，人们拓展了一系列分离群体用于水稻柱头外露的遗传研究，如F2群体、重组自交群体、加倍单倍体群体、回交群体和染色体片段替换群体。伴随着高通量基因组测序技术的更新，GWAS(genome wide association analysis，全基因组关联分析)技术也被应用于水稻柱头外露的研究(Huang,et al.2012)。借助上述技术方法和群体，研究人员已克隆至少38个控制柱头外露的QTLs(Quantitative Trait Loci，数量性状位点)，这些QTLs在水稻12条染色体上均有分布。这些QTLs大部分是微效位点，只有很少一部分被成功图位克隆到较小范围且可以解释超过10％的柱头外露表型变异。

发明内容

在水稻研究中，我们通过图位克隆的方法鉴定控制柱头外露的QTL基因并研究了它们的功能。首先构建了以籼稻GLA4为受体、普通野生稻W1943为供体的染色体单片段替换系GPSL41。其中GLA4的柱头外露率低于3％，而GPSL41的柱头外露率约30％-50％，两者回交获得BC1F1群体，进一步自交获得BC1F2定位群体，利用分子标记进行精细定位，将控制柱头外露的位点定位在P122和EC24分子标记之间14.1kb的区间。基因型和表型比对分析确定候选基因为2个高度同源的MBD基因，两者CDS相似性达到92.22％，蛋白序列相似性达到86.98％，分别命名为RSE1和RSE2基因。与此同时构建了近等基因系NIL-RSE，仅包含RSE1和RSE2基因在内的约180kb W1943片段，柱头外露率达到30％-40％。

转基因互补实验结果显示，RSE1和RSE2基因分别互补GLA4，可以提高柱头外露率约10％。由此我们验证了RSE1和RSE2基因是GPSL41中控制柱头外露的基因。两个基因都包含一个MBD结构域和C2H2锌指结构域。比较双亲RSE1和RSE2基因序列，发现在启动子区域、UTR区和基因编码区均存在变异。

对开花前NIL-RSE和GLA4颖花进行显微观察发现：NIL-RSE的柱头偏转角度显著大于GLA4，NIL-RSE的柱头长度也显著长于GLA4，这些因素都可能导致柱头外露。mRNA原位杂交检测RSE1和RSE2基因表达模式结果显示：RSE1和RSE2基因在GLA4和NIL-RSE颖花发育过程中的表达模式相似。在GLA4 0.8-1mm颖花中，RSE1和RSE2基因在颖花雌蕊柱头和花柱各部分的表达比较均匀，同期NIL-RSE颖花中，RSE1和RSE2基因在雌蕊柱头前端毛刷状部分强烈表达，表达水平显著高于非毛刷状部分和同时期的GLA4颖花柱头前端毛刷状部分。我们推测RSE1和RSE2基因在NIL颖花柱头上的特异表达模式影响了柱头的发育并导致柱头外露。

RSE1和RSE2基因与拟南芥花发育调控基因AtMBD8高度同源，MBD基因可进入细胞核参与调节基因组甲基化动态平衡。利用水稻原生质体***证实RSE1和RSE2融合蛋白可以进入细胞核中行使功能。对4-5cm幼穗转录组的比较分析发现：NIL-RSE和GLA4之间存在约1176个差异表达基因，其中582个基因被上调、594个基因被下调。GO富集分析结果显示，差异表达基因涉及到转录调控过程、生长素和细胞***素等激素调控途径、以及细胞周期相关途径等。

利用39份现代栽培稻材料和14份普通野生稻材料对RSE1和RSE2基因进行核酸多样性分析和Tajima’s D分析，结果显示RSE1和RSE2基因在栽培稻群体中DNA多样性显著下降，显著偏离中性选择。说明RSE1基因和RSE2基因可能受到驯化选择。这一研究发现构成了本发明的基础。具体而言，本发明包括如下技术内容。

一种调控水稻柱头外露的基因，本文中命名为RSE，包括两个基因RSE1或RSE2，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:2具有≥90％、≥92％、≥95％、优选≥98％，更优选≥99％的同源性。

上述基因的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:1(来源于水稻W1943)或者SEQ ID NO:2(来源于水稻W1943)。

本发明的第二个方面提供了包含上述基因的载体。该载体是用于将所述基因整合入水稻、尤其是栽培稻的基因组的质粒。

上述载体的骨架质粒可以为pCAMBIA系列。例如，骨架质粒可以是pCAMBIA1300等，所构建的RSE1或RSE2基因表达载体例如可以是pCAMBIA1300-RSE1和pCAMBIA1300-RSE2。

本发明的第二个方面提供了一种农杆菌，其转化了上述的载体。该农杆菌用于介导将包含上述RSE1或RSE2基因的载体导入水稻中，完成转基因操作。所述农杆菌选自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。

本发明的第三个方面提供了上述的RSE1或RSE2基因、上述的载体、或者上述的农杆菌在杂交育种中的用途。

在具体应用实施方式中，可以采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术将上述RSE1或RSE2基因整合入栽培稻、尤其是亚洲栽培稻(Oryza sativa)的基因组中。

上述的基因整合可以是农杆菌介导的质粒转化。

上述基因编辑技术可以采用CRISPR-Cas9***、CRISPR-Cpf1***、CRISPR-Cas相关的转座***INTEGRATE***或者CAST***。

上述INTEGRATE***是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertionof transposable elements by guide RNA-assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件***)；CAST***是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR-associatedtransposase，CRISPR相关转座酶)。

上述INTEGRATE***是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertionof transposable elements by guide RNA-assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件***)；CAST***是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR-associatedtransposase，CRISPR相关转座酶)。

上述的RSE1或RSE2基因在水稻中用于提高柱头外露水平，从而提高杂交水稻的结实率。

实验表明，本发明新发现的水稻RSE1或RSE2基因能够显著地提高栽培稻GLA4的柱头外露水平，从而提高结实率和产量，提示RSE1或RSE2基因能够用于改良改良现有的栽培稻品种，具有广阔的开发应用前景。

附图说明

图1显示了不同地区和年份GPSL41和GLA4的柱头外露水平比较照片和统计柱形图。其中，A、B：GLA4和GPSL41主穗开花完全的颖花，标尺5mm；C：GLA4(左)和GPSL41(右)的柱头外露表型，标尺5mm；D：不同地区年份GLA4与GPSL41的柱头外露率，数值以平均值(SD)的形式表示，n＝30(穗数)。

图2显示了GPSL系列染色体片段替换系的构建过程和GPSL41全基因组基因型。其中，A：GPSL系列染色体片段替换系的构建流程；B：GPSL41的全基因组基因型，G代表纯合GLA4基因型，W代表纯合W1943基因型，H代表W/G杂合基因型。

图3显示了正在开花的颖花和柱头的褐化的照片。其中，A-B：正在开花的水稻颖花，标尺5mm；C-H：水稻雌蕊柱头在空气中逐渐褐化的过程。

图4显示了不同基因型背景遗传群体的柱头外露率统计曲线。其中，Y轴表示柱头外露率，X轴表示观察数，nG＝77、nF1＝133、nW＝129。G表示GLA4，F1表示BC1F1，W表示GPSL41。使用单因素方差分析进行组间差异显著性检测，显著水平为0.01。GLA4组柱头外露率平均为0.053(0.035)，F1组平均柱头外露率为0.166(0.059)，GPSL41组平均柱头外露为0.286(0.085)。方差齐性检验显示F值＝24.342，p(sig.)＝10^-6，三组间方差不整齐。方差分析显示GLA4、F1和GPSL41之间柱头外露率存在极显著差异(F＝308.512，p(sig.)＝10^-6，统合力检验Power≥0.99)。

图5显示了RSE基因的图位克隆。其中，A：RSE基因的初定位；B、C：RSE基因的精细定位。数值以平均值(SD)的形式表示，RSE表示柱头外露率(Rate/Ratio of stigmaexsertion)。N表示群体规模。左边括号内数值表示重组子数目。

图6显示了RSE1基因、RSE2基因和AtMBD8基因MBD功能域的氨基酸序列比对。其中，深色标注为保守位点。

图7显示了RSE1基因和RSE2基因的氨基酸序列比对情况。

图8显示了包含RSE1基因和RSE2基因的野生稻W1943 BAC片段结构。

图9显示了RSE1互补转基因T2代表型照片和柱头外露率对比柱形图。其中，A：RSE1互补转基因T2代植株CP-1的柱头外露表型。整穗标尺为1cm，一级枝梗标尺为5mm。红色箭头标注为外露柱头；B：同批次亲本及CP-1的柱头外露率比较。数值以平均值(SD)的形式表示，n＝12。使用SNK检验和LSD检验进行组间差异显著性检验，表示0.05水平下组间的显著性差异。

图10显示了RSE2互补转基因T2代表型照片和柱头外露率对比柱形图。其中，A-C：RSE2互补转基因T2代植株CP-1、CP-2、CP-3的柱头外露表型，整穗标尺为1cm，一级枝梗标尺为5mm，红色箭头标注为外露柱头；D：同批次亲本及互补转基因株系的柱头外露率比较。数值以平均值(SD)的形式表示，n＝12。使用SNK检验和LSD检验进行组间差异显著性检验，表示0.05水平下组间的显著性差异。

图11显示了外露柱头和非外露柱头的形态结构的照片。其中，A：水稻柱头的精细结构；B：非外露柱头的形态；C：双边外露柱头的形态结构；D：单边外露柱头的形态结构。标尺1mm。

图12显示了外露柱头的长度和AS角度统计柱形图。其中，A：GLA4和NIL-RSE之间柱头长度的比较；B：GLA4和NIL-RSE之间柱头角度的比较。数值以平均值(SD)的形式表示，n＝300。使用独立样本的t检验进行组间差异显著性检验(方差方程的levene检验值sig＝0.082)，双侧sig＝10^-6。表示0.05水平下组间的显著性差异。

图13显示了RSE1基因在水稻不同穗发育时期的表达量变化。数值以平均值(SD)的形式表示，n＝3。使用单因素方差分析进行组间差异显著性检验。其中，Y轴表示相对表达量，X轴表示不同发育时期的幼穗，长度代表幼穗发育时期。

图14显示了RSE2基因在水稻不同穗发育时期的表达量变化。数值以平均值(SD)的形式表示，n＝3。使用单因素方差分析进行组间差异显著性检验。其中，Y轴表示相对表达量，X轴表示不同发育时期的幼穗，长度代表幼穗发育时期。

图15显示了RSE1基因和RSE2基因的原位杂交实验照片。其中，A-C：RSE1基因的原位杂交，A：RSE1基因在GLA4颖花中的表达；B-C：RSE1基因在NIL-RSE颖花中的表达；D-F：RSE2基因的原位杂交；D：RSE2基因在GLA4颖花中的表达；E-F：RSE2基因在NIL-RSE颖花中的表达。标尺20micron。黑色箭头指向柱头。材料为4-5cm长幼穗。

图16是本发明构建的质粒pCAMBIA1300-RSE1和pCAMBIA1300-RSE2的框架图。其中，A是pCAMBIA1300-RSE1；B是pCAMBIA1300-RSE2质粒。

具体实施方式

本发明克隆得到了调控水稻柱头外露的基因RSE(柱头外露率Rate of StigmaExsertion或Ratio of Stigma Exsertion的缩写)，包括两个基因RSE1或RSE2，研究发现它们可以提高水稻柱头外露率约10％，RSE基因通过控制水稻颖花柱头细胞数目和细胞大小来调控柱头外露率。高柱头外露率的RSE1、RSE2等位基因可以显著提高群体异交率。控制高柱头外露率的RSE1、RSE2位点主要存在于普通野生稻群体中，在亚洲栽培稻群体中受到驯化选择，因此可通过人工选择的方法使其进入绝大部分现代栽培稻，从而提高栽培稻群体遗传多样性和杂交稻制种成功率。

RSE1和RSE2基因可以增加水稻的柱头外露率，提高群体异交率，增加群体遗传多样性和杂交制种成功率。普通野生稻中含有该基因的特异表达基因型，亚洲栽培稻中含有低柱头外露率、低异交率的基因型，因此可以通过杂交育种将该基因导入亚洲栽培稻，改良现有的栽培稻品种。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。此外应理解，在阅读了本发明的构思之后，本领域技术人员对其作出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书限定的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。

本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由北京擎科生物技术有限公司和中国科学院国家基因研究中心完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。

可根据相关试剂盒说明书操作。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件比如PCR条件。

实施例

1.材料：

本研究主要使用极低柱头外露水平的亚洲栽培稻籼稻GLA4和柱头外露水平高的染色体片段替换系GPSL41。GPSL41是从以GLA4为背景，八号染色体上部分替换为普通野生稻W1943染色体片段的替换系。

所用遗传群体是将GPSL41和GLA4的杂交一代并回交一代后，子代不断自交产生的重组自交系。其中NIL-RSE是将其中一个重组自交系和GLA4回交，杂合子代的自交后代群体中筛选到的最小近等基因系。

2.石蜡切片及原位杂交：

用于组织学观察和原位杂交的材料用4％多聚甲醛固定，系列乙醇脱水，二甲苯透明并包埋在石蜡中。原位杂交的探针用罗氏公司的地高辛标记试剂盒进行标记。标记好的原位正义反义探针在8-μm的石蜡切片上进行杂交。

3.实时定量PCR：

新鲜植物组织或者-80℃冻存的组织用Trizol Reagent提取。总RNA样品中的DNA经过DNA酶消化后，用Invitrogen的SuperScript^TM II Reverse Transcriptase进行反转录为cDNA第一链，进一步为实时定量PCR的模版。定量PCR采用Takara公司的PremixEx TaqTM试剂盒，在Applied Biosystems 7500real time PCR仪上进行。根据基因序列设计特异基因引物，选择水稻基因eEF-1α(GenBank accession no.AK061464)作为内参。

4.RSE1或RSE2转基因载体的构建

将RSE1基因经过Hind III酶切BAC，***质粒pCAMBIA1300中；将RSE2基因经过SalI酶切BAC，***质粒pCAMBIA1300中，分别得到RSE基因表达载体pCAMBIA1300-RSE1和pCAMBIA1300-RSE2，如图16所示。该质粒除了RSE1或RSE2基因外，还包含来源于水稻的RSE基因启动子、终止子，筛选基因是潮霉素。

实验结果

1.亲本材料和表型考察

本课题使用柱头外露率低于3％的栽培稻广陆矮4号(GLA4)和柱头外露率达到30％-50％的染色体片段替换系GPSL41进行RSE(Rate of Stigma Exsertion,柱头外露率)位点的图位克隆，参见图1中A、B、C。GLA4和GPSL41的柱头外露率会随环境变化，但亲本间表型差异稳定存在，如图1中D所示。

GPSL41是本实验室构建的以普通野生稻W1943为供体亲本、GLA4为受体亲本、8号染色体存在大范围W1943片段替换的染色体片段替换系(GPSL系列，图2)，该片段包含本实验室利用自然群体全基因组关联分析定位的一个柱头外露QTL位点RSE(Huang,etal.2012)，该QTL位点在籼稻群体中和粳稻群体中同时受到强烈的驯化选择(Πw/Πc>4，Π值代表遗传多样性，w表示野生稻，c表示栽培稻)。

2.遗传群体的构建和表型考察方法的建立

2.1遗传群体的构建

本研究所用替换系材料GPSL41主要构建过程(参见图2中A)如下：1.将普通野生稻W1943和籼稻GLA4进行杂交获得F1代；2.将F1与GLA4进行回交获得BC1F1；3.将BC1F1和GLA4继续回交获得BC2F1，重复回交至BC5F1；4.将BC5F1自交获得BC5F2群体，通过分子辅助筛选获得不同染色***置替换的片段替换系。

本研究所用定位群体由GPSL41和GLA4回交获得，具体如下：1.将GPSL41与GLA4进行杂交获得F1群体；2.将F1群体自交获得F2群体，利用该群体进行初定位；3.分子辅助筛选F2群体，将发生关键重组的个体自交获得F3群体，利用该群体进行精细定位；4.利用F3自交获得F4群体以及后续自交群体进行精细定位和表型的验证，同时利用该群体构建近等基因系。

2.2表型考察方法的建立

虽然文献报道几个粒型基因(GS3、GW2、GW5等)可以影响水稻的柱头外露(Zhou,etal.2017)，但目前为止还没有通过群体遗传学的方法克隆到控制水稻柱头外露的基因，最重要的原因是柱头外露表型考察的复杂性。柱头外露是多基因调控、受环境因素影响的复杂性状，环境温度、光周期和空气湿度等都会影响柱头外露水平。同时，柱头外露表型呈现出不同的形式，包括单边(左、右)柱头外露、双边柱头外露等，增加了性状考察的复杂程度。为了准确评估柱头外露表型、寻找合适的考察方法，我们分别在2016年上海和2017年海南对两个亲本和F1杂合表型进行了较大样本的仔细考察，发现以下影响表型考察的因素：

(1)考察柱头外露的时间窗口。柱头外露始于开花，开花结束后柱头在颖花约下1/3处内外稃间隙露出，裸露的柱头逐渐褐化并在颖壳上留下显著褐色标记(参见图3)，统计褐化标记可以扩大表型考察的时间窗口。

(2)GLA4背景的水稻分蘖之间开花时间不统一，后期分蘖和早期分蘖会受到不同的光周期和温度的影响，可能干扰柱头外露水平。

(3)在GLA4和GPSL41亲本群体中，相同遗传背景下的单株柱头外露率会出现小幅度的波动，可能导致表型误差(参见图4)。

(4)柱头外露率是典型半显性的数量性状，F1表型和两个亲本表型呈现连续分布，导致杂合子表型鉴定困难，容易出现表型误判(图4)。

因此，为最大程度排除环境干扰和人为误差，准确衡量柱头外露水平，我们建立了一套表型考察的新规则，具体如下：

(1)考察柱头外露率(Ratio/Rate of Sigma Exsertion,RSE)，即一个穗子柱头外露的颖花数占总颖花数的比例，不区分外露形式(单边或双边外露)。

(2)考察特定基因型小群体的平均柱头外露率，根据GLA4抽穗特点，种植24株小群体，随机选择5个单株、每株3个主穗考察其柱头外露率(5株*3个穗子)，计算其柱头外露率的平均值作为表型数据。

(3)只考察定位群体中基因型纯合的重组子后代小群体的平均柱头外露率，使用M3小群体来复核M2单株表型。将平均柱头外露率高于20％的定义为W1943表型，而平均柱头外露率低于3％的定义为GLA4表型。

3.RSE的图位克隆和近等基因系的构建

3.1 RSE位点的图位克隆

我们在2015年海南获得了GPSL41和GLA4的杂交F1群体，并在2016上海获得自交F2群体。对F2群体进行筛选，获得了只在8号染色体上有W1943片段替换的个体约1000株，随后进行基因型鉴定和表型考察，利用indel分子标记P2和P90将目标片段定位在8号染色体长臂，利用分子标记EC22和P100将目标区域缩小到约2Mb的区间,与之前的GWAS结果一致(图5中A)。

进一步扩大F3群体约15000株，筛选获得约3000株的可用重组子。同时在分子标记EC22和P100之间设计了更细密的indel和SNP分子标记，利用分子标记P79和P48进行筛选获得了70个关键重组子，进一步使用分子标记P42和P70将目标区域缩小到约180kb的区域(图5中B)。

2018年在上海，利用F4群体约10000株进一步缩小定位区间。在P42和P70之间每隔10kb(部分片段每隔1kb)设计了一系列新的SNP分子标记并筛选到15个重组子。在进一步定位的过程中，我们获得了3个关键重组子R1、R3和R4(图5中C)。利用分子标记P122和P107，根据重组子R3和R4的表型差异，可以将目标区间缩小到14.1kb的范围之内，该区域包一个未知功能基因RSE1和一个芒基因EPF(图5中C)。

有趣的是重组子R1和R7，含有比重组子R3更大的W1943片段替换，且该重组子平均柱头外露率在不同地区和年份都显著高于R3(图5中C)。说明在R1和R7包含另一个控制柱头外露的位点，位于P107-P68之间，命名为RSE2(图5中C)。

3.2 NIL-RSE近等基因系得构建

在定位过程中，我们同时筛选得到了在分子标记P42和P70之间约180Kb区域的基因型是W1943型、而其余区域基因型是GLA4型的近等基因系，将该近等基因系命名为NIL-RSE。

3.3柱头外露候选基因

利用水稻基因注释数据库RAP-DB(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)，我们对最后得定位区间进行候选基因得分析。在分子标记P123和EC24之间包含两个完整的基因，其中一个已知功能基因EPF和一个MBD基因，我们推测这个MBD基因可能是RSE1的候选基因。在分子标记P107和P68之间也包含一个与候选RSE1基因邻接的MBD基因，该基因和RSE1在编码区DNA水平上有92.22％的相似度，两者蛋白序列有86.98％的相似度(参见图6、图7)，推测可能是RSE2候选基因。

4.基因RSE1和RSE2的遗传转化验证

为验证RSE1基因和RSE2基因是否确实是水稻柱头外露控制基因，我们进行了转基因实验。分别将包含RSE1基因(含有EPF基因)和RSE2基因的野生稻BAC(参见图8)酶切片段导入pCAMBIA1300载体中构建了RSE1基因和RSE2基因的互补载体(参见图16)。由于互补载体转化的GLA4是遗传转化难度较大的籼稻，选择将互补载体交予公司进行转化，最终分批次获得了RSE1基因和RSE2基因的互补转基因植株。

RSE1基因的T0代互补转基因共有16个株系，潮霉素鉴定全部阳性，基因特异分子标记鉴定全部阳性，第一批获得5株转基因植株在田间种植过程中意外死亡4株，我们对剩余的1株转基因植株的T2代进行表型考察发现其柱头外露率达到8％显著高于同批次阴性亲本GLA4的0.4％(参见图9)，对第二批的2株转基因T1代植株的表型调查也观察到同样的趋势(参见图10中B、C)，剩余的第三批9株转基因T1代和上述转基因的T2代刚刚在海南播种，等待后续的表型考察。

在构建RSE1基因互补转基因的过程中，包含RSE1基因的野生稻BAC酶切片段另外含有一个EPF基因(RAE2/EPFL1/GAD1)，该基因位于RSE1基因启动密码子上游约4kb处、编码一个125AA控制芒发育的短肽，可以导致RSE1转基因植株形成长芒。EPF基因属于一类植物表皮细胞生长因子，在拟南芥中主要调控叶表皮气孔细胞的发育。对小麦TaEPFL1基因的研究发现，TaEPFL1突变体雄蕊发育明显异常，但雌蕊发育未受影响。水稻OsEPFL1基因主要在芒原基特异表达，SP7后期和SP8早期的表达最强烈，将其野生型互补日本晴、NA93-11和Koshihikari都可以导致转基因植株形成长芒，但未发现长芒籽粒附带外露柱头。显微解剖观察发现，水稻柱头外露的发育基础为雌蕊柱头的长度和角度变化，这与EPF的组织表达模式不一致但和RSE1的表达模式完全一致，因此我们认为该EPF基因不影响柱头外露。目前，我们将只包含RSE1基因的互补载体已送公司转化GLA4，以期弥补上述实验失误。

RSE2基因的T0代互补转基因共有10个株系，潮霉素鉴定全部阳性，但是基因特异分子标记鉴定只有7株阳性，第一批4株转基因死亡1株，对其余3株转基因植株的T2代进行表型考察发现其柱头外露率分别达到12％、9％和10％显著高于同批次阴性亲本GLA4的0.3％(参见图10)，对第二批的3株转基因T1代植株的表型调查也观察到同样的趋势。

上述结果说明，互补RSE1基因和RSE2基因确实可以显著提高GLA4的柱头外露率。

5.NIL-RSE柱头外露表型解剖

为研究柱头外露的发育机制，我们对GLA4和NIL-RSE的小花进行了解剖分析，从GLA4和NIL-RSE群体中选择抽穗前的穗子的颖花进行解剖并观察比较雌蕊的结构。一个完整的心皮分为子房、花柱和柱头三个部分，而柱头进一步分为毛刷状部分(Stigma brush-shaped part,SBP)和非毛刷状部分(Stigma non-brush-shaped part,SNBP)。我们将柱头毛刷状区域(SBP)同心皮垂直中轴线之间的夹角定义为AS角(Angle of SBP,AS)；而非毛刷状区域(SNBP)同心皮垂直中轴线的夹角定义为ASN角Angle of SNBP,ASN)(见图11中A)。

解剖观察可以发现，GLA4中柱头不外露的雌蕊，在整体结构上左右对称，两个柱头的长度、ASN及AS角度基本一致。而NIL-RSE中发生单边柱头外露的雌蕊，则丧失左右对称性结构；不外露的柱头其长度和ASN及AS角度与GLA4中不外露情况没有明显差异，而外露柱头与GLA4的不外露柱头相比，其柱头长度显著增加、ASN和AS角度同时显著变大、或者AS角度显著变大，部分外露柱头的SBP区域发生大幅度扭转，AS可达90度角以上。在NIL-RSE群体中还存在少量的双边柱头外露，其雌蕊不一定丧失左右对称结构，但双边柱头长度、ASN和AS角度同时显著增加，如图11和图12所示。

上述结果说明，柱头长度和AS角度是决定柱头是否能够外露的结构基础。

6.RSE基因的时空表达模式分析

6.1表达量分析

我们首先在RiceXPro数据库(https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)中检索了RSE1基因和RSE2基因的组织表达模式，数据显示RSE1基因和RSE2基因在不同的水稻组织中都有较低水平的表达，说明RSE1和RSE2是广泛表达的基因。随后对RSE1基因和RSE2基因在GLA4和NIL-RSE穗发育不同时期的表达量进行了检测，结果显示RSE1和RSE2基因的表达量在穗发育不同时期之间没有显著差异。而且在同一穗发育时期，比较GLA4和NIL-RSE中RSE1基因和RSE2基因的表达水平也没有显著性变化(如图13和图14所示)。

上述结果说明，RSE1基因和RSE2基因在幼穗中的表达水平没有明显差异。

6.2表达模式分析

为了研究RSE1基因和RSE2基因的表达模式，我们分别以RSE1基因和RSE2基因特异的序列为模板构建了地高辛标记的RNA探针，并利用该探针进行RNA原位杂交检测RSE1基因和RSE2基因在幼穗发育过程中的时空表达模式。原位杂交结果显示，RSE1基因和RSE2基因无论在GLA4还是在NIL-RSE小花发育过程中的表达模式基本一致(参见图15)。在4-5cm幼穗小花中无论在GLA4还是在NIL-RSE中，RSE1基因和RSE2基因在内外稃中表达水平均很低，而在子房、雌蕊和雄蕊中均有表达。尤其在胚珠、花药、花丝、及柱头有比较强烈的表达。我们注意到：在GLA4中，RSE1基因和RSE2基因在4-5cm穗的小花雌蕊的柱头和花柱上比较均匀地表达，而在同一时期的NIL-RSE小花中，RSE1基因和RSE2基因在雌蕊柱头前段毛刷着生区域(SBP)强烈表达，其表达水平显著高于柱头非毛刷区域(SNBP)的表达水平，也显著高于相应发育阶段GLA4中柱头前段毛刷着生区域(SBP)的表达。在NIL-RSE近等基因系中，RSE1基因和RSE2基因通过柱头前段毛刷着生区域(SBP)的强烈表达可能会影响柱头的生长方向或者生长速度从而导致柱头外露表型。

结合前面的颖花解剖实验结果、柱头长度和角度的统计结果、及原位杂交实验结果，认为RSE基因在柱头上的特异表达模式最终影响了柱头的发育并导致柱头外露。

7.RSE基因的驯化分析

在图位克隆RSE1基因和RSE2基因的过程中，来自普通野生稻W1943的等位基因贡献了柱头外露表型，而来自GLA4的等位基因则不能引起、或只能引起极低水平的柱头外露。为研究RSE1^W和RSE2^W演变为RSE1^G和RSE2^G的过程中是否受到人工选择，我们选择了深度测序过的39份现代栽培稻材料和14份普通野生稻材料进行RSE1基因和RSE2基因全长基因组序列的比对分析。使用cluster-W进行多重比对，并用MEGA对比对结果进行修饰，随后使用DnaSP-v6对修饰后的比对结果进行Tajima’s D中性选择检测，结果见表1。

表1、RSE1基因和RSE2基因的Tajima’s D检测

其中：N，序列数；L，序列长度(bp)；S，多态性(分离)位点数；Π，核酸多样性。

结果显示，RSE1基因在栽培稻群体中的Tajima’s D值为-2.6596，说明其单倍体型数目少于多态性位点的数量、稀有等位基因以高频率存在，同时群体平均杂合度较低并发生了选择性清除；p-value<0.001否定中性选择假设，说明RSE1基因在栽培稻群体中受到定向选择。RSE1基因在野生稻群体中的Tajima’s D值为-0.6336，说明RSE1基因在该群体中也发生了选择性清除；p-value>0.1接受中性选择假说，说明RSE1基因在野生稻群体中的等位变异是随机突变导致的并受到平衡选择。同RSE1基因一样，Tajima’s D检测结果显示RSE2基因在野生稻群体中受到平衡选择而在栽培稻群体中受到定向选择。

为验证Tajima’s D检测结果，我们使用MEGA分别检测了RSE1基因和RSE2基因在栽培稻群体和野生稻群体中的核酸多样性，结果见表2。

表2、RSE1基因和RSE2基因的核酸多样性分析

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其中：M，序列数；S，多态性(分离)位点数；ps，S/n，n为序列长度；Π，核酸多样性。

表2中Π^W代表野生稻群体的核酸多样性，Π^C代表栽培稻群体的核酸多样性。计算结果显示，RSE1基因的Π^W/Π^C＝7.765，而RSE2基因的Π^W/Π^C＝9.5348，都显著高于常用的Π^W/Π^C阈值3或3.5。上述结果说明，从野生稻群体到栽培稻群体RSE1基因和RSE2基因的核酸多样性都发生了显著下降，都受到强烈的驯化选择。

综上所述，RSE1基因和RSE2基因都受到强烈的人工选择、是驯化基因。

上述实验结果表明，RSE1或RSE2基因提高了栽培稻GLA4的柱头外露水平，提示它们能够用于提高栽培稻群体遗传多样性和杂交稻制种成功率，从而提高杂交水稻的结实率和产量，改良现有的栽培稻品种，应用前景广阔。

参考文献

Huang,X.,et al.A map of rice genome variation reveals the origin ofcultivated rice[J].Nature,2012,490(7421):497-501.

Huang,X.,et al.Natural variation at the DEP1 locus enhances grainyield in rice[J].Nat Genet,2009a,41(4):494-7.

Huang,X.Y.,et al.A previously unknown zinc finger protein,DST,regulates drought and salt tolerance in rice via stomatal aperture control[J].Genes Dev,2009b,23(15):1805-17.

Miyata,M.,et al.Marker-assisted selection and evaluation of the QTLfor stigma exsertion under japonica rice genetic background[J].Theor ApplGenet,2007,114(3):539-48.

Purugganan,M.D.,and D.Q.Fuller.The nature of selection during plantdomestication[J].Nature,2009,457(7231):843-8.

Song,G.S.,et al.Comparative transcriptional profiling and preliminarystudy on heterosis mechanism of super-hybrid rice[J].Mol Plant,2010,3(6):1012-25.

Song,Xian-Jun,et al.A QTL for rice grain width and weight encodes apreviously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase[J].Nature Genetics,2007,39(5):623-630.

Wing,Rod A.,Michael D.Purugganan,and Qifa Zhang.The rice genomerevolution:from an ancient grain to Green Super Rice[J].Nature ReviewsGenetics,2018,19(8):505-517.

Yan,W[J].G.,et al.Association mapping of stigma and spikeletcharacteristics in rice(Oryza sativa L.)[J].Mol Breed,2009,24(3):277-292.

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 调控水稻柱头外露的基因及其应用

<130> SHPI2010673

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9033

<212> DNA

<213> Oryza rufipogon W1943

<400> 1

cgcgctcgcg ctctcgctgt gaattacggt gtgtgtggcc gcgtcgcgcg cgcgccgctg 60

cccgtgcccg gcagcacatg gcgctgcact gctgctgatg ctggtggtgg tggaatcgtt 120

gtcgtcgcgt cgggctgaga gggattgttg atagattccg tgtaatatgc caggacaaaa 180

ttttgtcacc gctgctgctg cccatgcagc tggatcggct cggctactct caccacctat 240

actgtatctt tcactggcat ctgctcgccg ttttggaatc tctgcggtgt ggggttgcct 300

cttgcatgta cacatgtttt tcatgtatcg atccatgcct cctccatgga atctaatggg 360

aatccatcat cgttcatgct ggatggatgg atggatgtag tgaatggtag tttttcttat 420

ttttgttgga gatggatatt ttttacttta catctaatcg gatatatgtt gccttttaaa 480

ttgagaattt agctactcaa acaatccatt ctgaaattcg ttcaaacgaa gatttgaact 540

tagtatctta ggctgcgttc ggcagaccag gctcccaact cctccttatt ttccgcgcgc 600

acgcttttca aactattaaa cggtgcgttt ttgcaaaaag tttctatacg aaagttgttt 660

aaaaaattaa attaatctat ttttgaaaaa aatagctaat atttaattaa atcacgcgct 720

aattgctact ccgttttgcg tgccggggag taaggattcc ccgaacacag actagagtgt 780

tattcagatc gctgcaatct acatgccctt tcgcaaagtg aacggtatag ttctagtggt 840

aaattggtaa ttggtccctc tctgcatctg ctatgcatgc atgcatttgc ttgatagtat 900

gtttttgtgc gttgatgtgc ataggtcagt tttgttcatt tgaggtttca tgccagggaa 960

aatcgatcat gcactacatc ctttattatt gccgtaagta cgattgatta tgtaatcgac 1020

atattcatca atcctcccat gatccaaaaa aacgttccat gccggtgtga tcgtggtgat 1080

ttggttgatt tgaaaggaac gtaatgattg aatttttttt atgggaaggc caacttcggt 1140

agaacacttg tgtgcagcca tcaaagacga gtggaaactt gcaatgcggc attcctctta 1200

accgattgag gtcagttgca gcccatcgcg cagtggtgta atcagcagtg ttttaaatag 1260

cgggtttaaa acgtttagtt ggttttctca aacagttata gcgggctaaa tagagctata 1320

acggctaaaa ttgtataaga gagtaaatat ctataccctt ctcagacagt tatagtcaaa 1380

gatagtggca gctatagccg gaaatttaaa acctggtaac cagtaacggc tcgacactag 1440

caccgttctt acgaggtctg gttttgagtt ggcggcgacc cctccatttc ccaattgcta 1500

aataatctgt ttttccttgc tcaaatcttc gataacatat tacttcgccc aatgttttcc 1560

catgaggcca cgatatccct ctaattcaca tctcaccatt tttttccaga gcaaatgttc 1620

atgtttttag aaaaaaaata gggataaatc cacatcgcag attgcacccc ttaattgttg 1680

gaattgccta aaaactcctc tcaactaggg gtgtaagtgg ctaacccgcg aaacccactt 1740

atagactaaa aaataagcca cgaacccgct tattttgacc tataagttgg ttcccggctg 1800

acccacgtac acccctactc tcaactatgg ccctctttgg ccaccattgt tgctacagtg 1860

taccaaaact gataagtaca atcacagcta gcacaaatgc acaatcgatc acctcatgta 1920

aaaccggata taggctgcgt tcttttcagg ctattactcc tcgttttccg ttagcacgct 1980

tttcaaacta ctaaacggtg catttttttg taaaaagttt ctatatgaaa gttacttaaa 2040

aaaatcatat tagtccattt ttttttaaaa aaatagcaga tacttaatta atcatgtgct 2100

aatggatcgc tccgttttcc gtgagcactg ttgggggtgg gaaagaacgc agccatagtg 2160

taatatagaa ttctccaaga aggatagcta gggtcttggg aacatcgtac catccggtag 2220

tttatgattc tcgcaataga gatttgtttt cccattcatc gtagtgggcc gtcgcgatcc 2280

ctggttgtgc atcgtaaatt cgtaatgggc cctccaaatc ctacaccaat acaccatctt 2340

ccacgcatgt tgcatgctca aggttaatgg gccgtgtact ttcttcactc ttatcggttg 2400

gccatatgtt tatggtccat gagatatcgg cccacgtagc atttgggctt gtagccccca 2460

cctcgctccc atccataacc gcccaacctg tgcggctcct tttgtcgttg cgcgcgacgc 2520

acctcattgc ctcggtcccc cacctctctc ctcatcggac ggcgccacgc cacccaagtc 2580

cagatccaac gatcagaacg acagccaata gtagggatgg cagtattgcc cgtgggttcg 2640

ggtatccgcg gatacctggc ccgataggca tgggcgtggc accttttttt aacccgtggg 2700

catgtttgat ccgatgcccg agaacttagt gggtatacat gggtttatat tttgctcgtc 2760

gataacctat gcttgactaa aaaatttttt agcccatgta tatctttcat gccttcaata 2820

gttaacctct cctcaaaacc caatagccca tttagcccat ttgtatatag caatatatgt 2880

gttcactcaa cgaaacccta gccttatcct tttccccacc accacctctc aatcatctat 2940

tcctctacgc ggcggcggcg cacgagaaag aagcaggagg tggctggtgg cgcgacgcaa 3000

cggcgcggcg cgagctagcg acacgacggc gatggctagc gcacggctgg cggtgcacaa 3060

gcgtgggcgg cagcaggctc gtggccggcg gcacatgagc gtggagcgcg acgggcaact 3120

tagcggtgag ggcgacaacc ggtgaccggt gatgcggttg cgcacaagcc gcgactggcg 3180

gcgcggcggg cggcggcaca tggcaggtaa gcccagtggg tacccgtcaa gcatacccgt 3240

gcccgacagg catgggcata ggcatgagat tttgcccgat aggttttgcg ggcgtgggtc 3300

aggcacgagc acgtggatct cgggcgggac aaggttttgc tatgcacatg cccgacccga 3360

cccgttgccc tccctaccct ataggctata gctcacacca aacccgccct ctctctctct 3420

ctcttcccgt ggagccccaa ctacgccgcc agcccgccat ctcatccccc ggcgagcgac 3480

acggtcgcat cccacctgag ctccgaccgc cgcagcggcg gtcgcctcgc cggagcagaa 3540

gccgcgcgtg ggggggaagg cggaggaggg gaggggttca atggagacgg aggtgttccc 3600

cgtggttgac ctccgcgtgc tcacgcagtc cgatctggac gagctcgccg ccgcctccgc 3660

ccacgccgtg gacccgcgga gcagctgccc cgaccgcgcc gtcttcaacg agagcgccgg 3720

ctcgcgtaag cagaccttct cccgcgtccg cttcgtcccc gccgccgccg ccgccgctgc 3780

cgccgcctcc gcctccgccg ccgccgccgc caagctgccc aggggcaacg acaaggagga 3840

cagcttcatc gcctaccacc tccgccgcct cttcgcgccc gacgacccct ccctcaccga 3900

gaacccctcc tttccccaaa cccaaaccct agctcggtcg ccgtctcccg accccgacca 3960

gttgaccacc aactccaggg gggtctccgt tgatctggtg agcctctcac ggcttgccga 4020

cccgtacgac gcggagctcg ggaagcggac tgccaggatg accacggagg aggagctcat 4080

gggctttatc tctagcctcg cgggtcagtg ggtgaaccag aggatgcgga ggaagttagt 4140

tgatgcgtcc ttcttcgggg atcacctccc cagcgggtgg aggctgcagc ttgggatcga 4200

gcggaaggac cgcaaggcct gggtgaactg cttcagttat gtgaggtgag cctcatcatc 4260

ctttccttgc aaatgctgca atgctatggg atccgttgtt agtaactgga atgggggtta 4320

taacttgcaa taagctagag ggctggatgc ttgctatgat gtttagagat gcggtaatgt 4380

gtgacttata gatgcaatgg atgtgtggtg gatttggttt gtgaagattg ttttatactc 4440

ttttagtgta gtcaactgtt gctaatcaat catgcacaag tttatcagat cagttcttgg 4500

tagttttgaa tgattgattt ttttttcaac atggccttca tgctgtcatt ctgtggattg 4560

cctattttcc atggaagaat aaatcttatt tgttaacaat attattatgc aaacatacaa 4620

taactgaata cccccaggac gagctgtttc atgacgaggg ggatgctatg gctggacatt 4680

atggtatagt atatatagta gtggtgtcgg tatgacaagg cctcaggatt agcatgtgct 4740

gcagcaattg gagaatcata gtagacaaat agatattcta ctccttattt ctccattaga 4800

gtttcctagt tttgtcattg gagtcctagt agtattagat actagtttgt ttcctttgcc 4860

ttatctagag gcacctcaat atacaaaggt agcctagtac tggattatgc cttgagcaat 4920

aagaaatatc taaaggggat tgacccaaaa gcccagtcat ttcaatgaca tactagttaa 4980

atgataatgc tgaataatct ggggggcaaa gacaagactt ttgcctacca tagtataaga 5040

gcagcgtgga gcggtattgc tttaagataa tgagttttgt tttattcctt tgatatttgc 5100

ttttccgcac ttcatttgat ctgtagtttt aaggcatgca aatgcgattg cagcagcatt 5160

atttagcaat ggcttgattg atgcttactg ctacctccgt ttcaggttat aagactttct 5220

aaaatctaga aagtcttata atatgaaaca gaggaagtat atgataggtt aaacataaag 5280

atagatttgt atggcgcata tcatatctca agtatataac ataacacatg tatgtgtaaa 5340

tttgcttctc ctgccgagtt ctcactgata cacaggtcct aatccaacct gtcaatgaga 5400

accagtggat aaagtgaatt aaggacatgg catggtgtct aaaatgtcta aaataaacag 5460

taattttcat ttgctttatt taactgcaat gcctatttga agtagtgcct agagcacatg 5520

agcatttcaa tcattatctc gaatgttcct cagaactcag gtgttccacc atatatgctc 5580

agatttatca tctgtcgtag atgaataatt ttgttgtaat aacagtaaag atcacttctc 5640

atcactataa gttcgaaagt atctgttaag ataacaaatt cctatttatc tgcttcacct 5700

ttatctatca tgtgtgctac tcatcagcga acatatgttg tggatggctg catcatttca 5760

gcgcaataat tttgttcgtc acatttttcc cctgtactaa atgggcatgt tgtactttcc 5820

agccccaagg gacagagttt tgctacttgc caagaggttt ctgcatacct catgtcactt 5880

cttgggtatc cggagttcaa aacggataat attgagtatg gtagcacaca acaacatggc 5940

ttgtgtgctg acgatggtgt taatgtaagt tgaaagtgta tgtcacttta tcttgtgaac 6000

ttgagtttgt ctagtttaat ttttgggttt gtggcaggtt ttaggtgttc aacaccaaat 6060

tggtacaagt atggacagtc aaagtaattt gccagttgct tctgctactt tttatagtca 6120

ttcaagagat caagacgaaa cggttgcaga tgatataaat tcttatgaat gtcaacaatg 6180

caatttaact tttcatggtc agagtgccta tgcgcatcac ctgatcactt ttcacaaagt 6240

gagttctaag aggcgtaaga gtaacaaggt tagcaaattt ggtgagccag tgataggcaa 6300

agatgggaaa tttgaatgcc cagtatgtaa caagacgttt gaggaacagt cacggtactt 6360

tggtcacatt ggatcccatg caaagtatca ggggctgact cctgaagcat tcctacaaac 6420

cttttcagga aaggttggta acaattcttt tgcaggtttg tcatctagcc ttcaagtatt 6480

ggtcggatca ccacaactga atgagaagac tactgcttgt gaagcacgat cacagcatca 6540

cgattgttca actaaacatg gaggcaatag tacaagaggt atagaccttt ttaactcaaa 6600

tcatcctgct aacttcaatg ggcataatca atcttggtgt agatctgatg aaattcctcc 6660

caccacagaa gctcaaagca catggactta tagaaataat gagatgaact gtgctgatag 6720

aactgttccg agaacagtac ctcagcccaa tgatcacgag gattgcaggg ttagtggctt 6780

tgctgaagca actaatttta atgatcaagc aggaagacac caaggtttta gacctttctc 6840

ctttggaact accaaccatt gtcaaggcca gataattgat catgcagtag ctgcttccaa 6900

gcatgctgag gttaataata gtatgaaatc aagagatgtc aacctcaatt cacgcctgaa 6960

cacaatatcc tttcctattg caactgcaaa caatgaaaca tcgactgccc ttaatgacgt 7020

gaatcggtca tgcattactg gaaaaggttt tagtggaagt ttcagtaaca atgatggtgc 7080

tgcatctatc gtgttgccca gttctggatt aaacaataaa atttctagct ccctcggtgt 7140

agctgacaga tcatctattg ctgccagatc cttcaatgct ggttatgctt atgaaaatgg 7200

cgcttctgaa gctaacaata ttggcaacaa aaacaatacc atggtgtatc aaacaagttt 7260

ggccatgcgt ccactctctc ctgtaagtaa catggattgc ttcacgtttt gttcagtgca 7320

tttaaaaata gcaactgaca tctattgatg cttataataa taacatggat agcatagaaa 7380

acaaaacaag taactaagct agattttctg ttgatgctta taataatatc ttgactggca 7440

atgtcactga aaggagtcta cccagtgtaa ttgcaactcc agtcacttag ggcctaatat 7500

ttcaagccat aattcacttc ctaaatcaag cacactagcg accagtaact taagcaaggg 7560

gagtgatgtc aactggaaag ttgttttaaa aatcatatta atccatttgt taaaaaaata 7620

actaatactc cctcgtttaa ggttataaga cgttttgact ttggttgaaa tcaaactact 7680

ctaagttttt ctaagtttga ctaactctat agacaaaagt agtagtaata tttacaacac 7740

tagcatagtt tcattaaacc tataattgaa taaattttca taatatattt atgttgggtt 7800

aaatatatta ctactttttt ctacaaaatt agtcaaactt aagagtagtt tgactttgac 7860

caaagtcaaa aatgtcttac tacctgaaac ggagggagta cttaattaat cttgcgctag 7920

ccatcgcttc gttttgtgcg cactcccgac ctcagccctg tagcggctcg acgctagcat 7980

tgttcatatg aggtaaataa tagggaaaat tccatctata ccacaaagat tttagcagta 8040

ccaaataata ccaccagatt ttttctcctt gttgtttaaa aaaaaaggat ttttcctcct 8100

tccaaaaata ccacaaactt cacggagaac cgacagagta agtaagtaga tgaaactgcc 8160

ctcacatctc tcgttctctc atctctttaa gtgatagggt tggcaatctc tgctcagcga 8220

tagggattga atagtttcat taaacatata ataattgaat aatctctgca tcgcgtctgg 8280

gacgaaggag atcgccgctg gtccggcccg cgtggaggca cttttctgct tatgccgccg 8340

cggtgttgtg tccgggcagg agaccccact ggtccagcac tccggctccg gcggtttggc 8400

cccgtccggc cgtcccccgt acggaggcac ttttatgctc cgtcgctggt gtttgcgctt 8460

cctccgattt tctaacccat tgccgtgcga agcagggcaa acaaagcagc ggcgttgctt 8520

cgagaaggac agccgctgtg gtgtccgagc ggcatggagg ccaagttgtg agacacccac 8580

ggactgcttc atcagtttac atgcctgagc aaggtcctgg atggttgtga gctccaccag 8640

ctaatcacca aaggcagctt atgcatcatg cagctggatt ggagaactcc taaagctgaa 8700

ggccacgatg ggattggaga actcctaaat cttgttcaca cagggtacct cagtactctt 8760

cttttcaaac acaggtaacg gagacaaatt agtttgtatg agattgggta acgtctgttg 8820

aaatatgtgg tattcttaaa agaaacgttg ttgcactgtg gtattgagtg gagatgaaag 8880

aatcttgtgg tattatttgg ttggtcaaat ctttgtggta tagttggaat tttcatataa 8940

taatatattt ttccttggtc aaatcttcga taacatttta ctttgcccga tgttttccca 9000

tgatatccct cttagtcaca tcccaccatt tct 9033

<210> 2

<211> 13149

<212> DNA

<213> Oryza rufipogon W1943

<400> 2

gtcgacgagg cttccgtgga gccattcgtg tgcagcggcg atgcgcatat ggtactacct 60

gcaccggtgg ttgagctgac caagtattct caaccaaatc tcatcatgaa tcccaggagt 120

tctgaaccgg aggcaagcaa caaagagacc acaacgattc acaaggtgag ctagtttatt 180

ttctgcaaca aggaaaccac atggtttctg atttttgtgt gttgattcga atgaggagtg 240

gtggtgtact atctcatttt ttttcttaga cactgtgctt tcagatctga gacaagggtg 300

atttgtggaa tgaacaaagt catatgtctt tcttagacac catgcttttc agatctgagc 360

aagggtcatt tttgtggaat gaacaaagcg atatgtcttc ttagacattt tgtttgcaga 420

tgtaagcaag ggtgatttgg catgaacaac cgtgtgcact tttctgattt tgtgatgtca 480

gtttaacact tagattttcc agttttcaga aatgcctact gttttgtgcc tgttgtggaa 540

tttgtggaaa tatgcagtca tggtttgttt gctagttgag ttaggatttg tctgaagaat 600

actgtacaac aacataactg cagaagcgaa atatgtatgc caaattttaa tttcaggcac 660

caccagacaa tttgtatgca ctctgggctt atctgaatgt tgtaggggtt tatcttaatg 720

ttgtagattt tttttcacac aatggtctga atactgtaga taagcagaac tagtagtagc 780

agaatgcttg aatcgtatgt aaatatgagg cgcatctggg gctactacta ttgttactca 840

gacttaaaat ggatgtatgg aaacaagttc aagcctgcat ttgtctattc aacttgttac 900

aaaatgatca tgtcagtagt tttagtgtga aatttgaaat ttgaaattca tgttgctgaa 960

tttttctgaa ccctacttat gtaattctga actttgctgt caaaggaatg catggcgtgc 1020

tgtggcagtt ttggtccctt ttttttttgt ttgttctaga ttttccagtt tttgtaaatt 1080

ttgtcaaaag aattgtaatt tattatctct ctgtgtttgt ccaacctgaa acacaatttg 1140

ttagttttga aataacaaaa acttttacaa ctatattttg taattttgtc agttttgaaa 1200

attttgtcaa aaaaatgtaa tttattatct ctatgctttg tccaacctaa aacacgattt 1260

gttagttttg taattacaaa aacttttaca actatatttt gtaaatttgt cagttttgta 1320

aattttgtca aaaaaatgta atttattatc tctatccttt gtccaacctg aaacacaatt 1380

tgttattttc tttaacttct caaaataagt tatttcttca tatttgtatt ttgtttttgt 1440

cagttttttt taaaacttct caaaataagt ggttttgtca tatttgtatt tttgtctttt 1500

gtttttgtca gttttttaac ttctcaaaat aagtggtttt gtcatatttg tattttgttt 1560

ttgtcagttt tttaaacttc tcaaaataag tggttttgtt atttttgtat cttgtttttg 1620

tcagtttttt aaattaatgc atgtgttcct caggtctgtt gtagatctcc tccaccgttc 1680

atccttagcc cgacgccgat gccactgcca cctgccattc cctcctcacc aaggtaaaag 1740

cctggctgac ttccatatag ctctgagcta gtaacagtac ttccaaaagg gccataaaat 1800

caagctacaa tgtttcagac ttccaactgc tattaacagt acttacttcc aaagtgccat 1860

tacagtcttc cagcagctac catgtttcaa aataaagagc tcagtacaaa ttcatctgac 1920

ttttttttta actactatac tgtgtcaggt tactgtccgt tgtaaaaaat tgtaatttat 1980

tatctctctg ctttgtccaa cccgaaacat aatttgtatg tttggtttta tcaattttgt 2040

tagttttgta aaccagctgt agaaaagatt gatagaaata ttgcatgctt cataccatgt 2100

ttcatatttg tcagaaatag tttatgaatg atcgtgctct ttgttatctc ctacttttgt 2160

cagttttgta aaagaatttt gtaatttatt atctctctgt gtttgttcaa cctgaaacac 2220

aatttatatg tttagttttg tcagttttgt aaagttttta gttttataaa ccagctgtag 2280

aaaaaaatac aacaaaaaga ttacatgctt cacaccaggc aaaatgtaac cacaactata 2340

tctagttttt cttagggcct catcgtttgt ttttttttct aataagccaa aacggcttat 2400

tagagaataa aaataaattc gtaggtaaaa cttttatata tgtgttttcg gtgacttaaa 2460

agccaatgct gaaaaagaaa ctacgttgaa aatatctcaa aatcaatgtc aaaattaagt 2520

ttaaagattt aaattttagc tttttcttta gttgaatagg ccatccgaat ggagcttcga 2580

ataccttgag taatatcaac tccttcagcc ttccttttgc caagatcaca cacctgcgcc 2640

tctcctgaaa atttaattaa gtacaacaga ttatattttt gtcatctaat agccattcat 2700

agttcaacat attttgttca taagccccct tatctgaaca cctagagcta gtatttaaag 2760

tgggacaaac aagcagtagc tttgtgtttt gtaatttgtt agcaattttc agttgttttc 2820

agtgagaact gaacatctta gaggcaatgt tgttaagata aatcgtcgtg tattttttct 2880

tatatttttc ggtgggctgt gagagacaaa cctaagccca taaaaaagga gtgggatttg 2940

tttctcaaag cgctacgcgc tctgttattt tattgcacgc agggggaggg ggagggatgg 3000

acgacgcgtg tatcaatcgc acggcgcaaa aaacggctga aagcccaaaa tttttcagcc 3060

gtttgtcaca tagagtccct ttttttaagt gtccagagca attgttcatt tttttaaaaa 3120

aaatataggg ataaatccac attgcagatt gcaccctctt aattgttgga tttgcctaaa 3180

aactcctctc aactatggcc ctctttgggt accattgttg ctacaatgta ccaaactaat 3240

aggtacaatc atagctagca caatcgatca cctcctgtaa aaccggatat agtgtaatat 3300

agaattatcc aagaaggatg gctagggaac atcataccat ccattagttt acgatcctcg 3360

caagcgaaaa gtacaccgaa ggtcggtcct acaacttata atcgagttac aaaatcgttc 3420

ttaaaccgta aaaccggata aaatgcatcc ctcaacttgc aaaaccagtg caaactaggt 3480

ctctcggcgg ttttgactcc ggttttgtct gatgtggcag tggattcaat gcgggaccca 3540

cgtgggcctc acacgtcagc ctcttcttcc cctcccctct ccacctctct tcctctctcc 3600

tttcctctcc acggcggcga ccggcaggct gggcgcagta ggttggtgcg gcgggcgtag 3660

ccagtggcta gcggggaagg aactgtgcgc cagcgacaca gagctcgact ggcgtcgtag 3720

agagaggggt cgccgccgtg tgaagagatg cagtcgccgg catcgctctt cccctccact 3780

ctcctcgctc tcttccctga gttcgatgcg gagcgtcgtt tccgtccagg tcgccaccta 3840

ggtgccacga gcccgacgtg tagtgccgca tccatcaaca tgtcgtcgtc gtcgtcgccg 3900

ctgcatccat ctctttctct ctcgtcacca tcgtcctcgt cactgctgcg ggacaaagcc 3960

gctcatcggc caccgactgc acccgactca ctctccggaa tcacactata catggcgttg 4020

gtgaggcgtc gccgcctcac tacctacggg cctccttcgc tcctgccgct cctacctctc 4080

ttcgttggca atcgcggtcg ccggtgagct cacaggagct tggggcatct ggcggtggtg 4140

gcgacattgg cgtggggagg gccatgaagc ggcaagactc gcggttcttc caccgactag 4200

agttgcagct ggtgtggggt gtccccttct cccccgtcgc cgccgccaaa ccttctcctc 4260

tgccgcctcg ccccaccgac ctccttccca tccgtcggcc tgccgcgctc agcttttccc 4320

tcgccggtca ccgctcgtgg agaggggagg agagagagag aggaagagag atgaagaggg 4380

gaggggaaga agaggctgac gcgtggggcc cacgtgggtc ccacaccgac tcagctgcca 4440

cataagacaa aactggagtc aaaaccacca aaggacctaa agtgaatggt tttgtaagtt 4500

aagggatgtc atatatctgg ttttacagtt aggggatgat tttgtaactc gatgacaagc 4560

tgagggtttc gatatacttt ttccttctcg caatagcaat ttttcccacg cgtaagtggg 4620

ccgtctcgat ccccttgtcg tgcgtcaaag gaaaaagtac accgaaggtc cctcaacttg 4680

tcattgagtt acaaaatcgt ccctgaaccg caaaaccaga cttatgatat cccttaacaa 4740

aaccatttac tttaggtcct tcggtggttt taaccccagt tttgtccgac gtggcggctg 4800

agttagcgtg ggacccatgt gggccccaca tgtcaggatg ccacctcatc tcttccctct 4860

tatttcccct tttctgcctt tctctctctc acttttctca ggccggacag gcagcgctgt 4920

ggggaggagg ccgccggggg gaggggagag gaggaggtct ggcagccggt gtcgcgccgg 4980

cggaggcaac cccgccgtcc gcatccttgt tgccgcgccg tggcacagcg ccgcctgtcg 5040

ccagccgctt tgccactgct gactccgccg cctccacata ctcgccgcgc tctgccgagg 5100

acatgcggag agagaggtcg gagccgtgct ggccggagga gcacgacggc tgccatggtg 5160

actcaccgga ggagcacgac ggctgccatg gtgcgcacct gacctaccca tcccgaactc 5220

ttgctcttac gatggcggcg acaacgcgct ccctcacgtc gctctcgtcc gcctccgcat 5280

ctgtcggcct cgtgcgcacc tccatcagcg gtggcggtgt ggcgcttggt gagggagcct 5340

aggacggtga ggcgggtgaa gagcttgagg aggcggcggc gcggcgcaca gagcatgtgg 5400

cggcgcctgg tggagaccgg ctctgcgcca ccgcgctcgc ccgctgacgc cgcctcgccc 5460

tgccgatgcc gcctctccgt caagctcgcc tgcgccctag ccacggccaa gaaaagtgag 5520

agagagagag gatgaaggga gaagagggaa aataagagag aggtgatgag gtggcatcct 5580

aacatgtggg gcccacgtgg gtcccacgct gacttagccg ccaagtaaga caaaaccggg 5640

atcaaatccg ccgagggact tattgtgacc ggttttgatt agttaaggga cgcaggatat 5700

ctggttttgc ggtttgagga caattttgta actcgatgac aagttgaggg accttcggtg 5760

tactttttcc gcgtcgtaat gggccctact gatcccaagc atcacaatgg ggcaatgggc 5820

cctcctaatc ctacaccatc ttcccctcat gtcggatgcg caaggttaat gggccgagta 5880

ctttcttcac tctgtttatt ggtcagccca tatgtttatg gtccatgaga tatcggccca 5940

gtagcattta cgcttgtagc ccccaccccg ctcccatcaa taaccgccca agtcaagctt 6000

gggcggctcc attttgtcgt tgcgcgcgac gcgcctcact ccccccggtc cccccacctc 6060

tctcctcatc ggacggcgcc gcgccaccca agcccagatc caacggtcag aacgacagcc 6120

tatagctcac accaaaccac tctctctctc tctctctctc tctcctcgtg gagccaaccc 6180

aactacgccg ccgccacctc atccccccgg cgagcgacac ggtcgcatcc caccggagct 6240

ccgaccgccg cagcggcggt cgcctcgccg gagaagaagc cgcgtggggg ggaaggcgga 6300

ggaggggggg gggtgggggt gcaatggaga cggaggtgtt ccccgtggtt gacctccgcg 6360

tgctctcgca gtccgacctg gacgcgctcg ccgccgcctc agcccacgcg gtggccccgg 6420

ggggcagctg ccccgacgcc gaccaactcc cgccgctgaa gatcgaccgc gccgtcttca 6480

acgagagcgc cggctcgcgc aagcagacct tctcccgcgt ccgcttcggc gccgccgccg 6540

ccgtcgccgc ctccccttcc tccccctccc cctccgccgc cgccaagctg cccaggggca 6600

acgacaagga ggacagcttc atcgcctacc acctccgccg cctcttcgcg cccgacgacc 6660

cctcctctcc ccaaacccaa accctagctc tacccgcgcc gccgtctccc gaccccgacc 6720

agttgaccac caactccaag ggggtctccg ttgatctggt gagcctctca cggcttgccg 6780

acccgtacga cgcggagctc gggaagcgga ctgcggggat gaccacggag gaggagctga 6840

tgggcttcat ctctagcctc gcgggtcagt gggtgagcca gaggatgcgg aggaagttag 6900

ttgatgcgtc cttcttcggg gatcacctcc ccagcgggtg gaggctgcag cttgggatca 6960

agcggaagga ccgcaaggcc tgggtgaact gcttcagtta tgtgaggtga gcctcatcat 7020

cctttactga caaatgctgc aatgttaggg gatctgttgt tagtaactgg aatgggggtt 7080

atatattgca ataagctagc tgcctggatg cttgctatga tgtttagaga tgcggttatg 7140

tgtgactata gatgcaaact tgcaaaggat gtgtggtgga tttggtttgt gaagattgtt 7200

ttatactctt ctagcgtagt caactgatgc taatcaatcc gtgcacaagt ttatcagatc 7260

agttcttgac agttttgaat gattgatttt ttttttcaac atggccttct tgctgtcatt 7320

ctgtggattg cctactttct aaggaagaat aaatcttatt ggttaacaat aactgaatac 7380

cccctaggat gagctgtttc atgacgaggg ggaaatgcta tggctggcct caggattagc 7440

atgtgctgca gcaattggag aatcatagta gacaaataga tattctactc cttatttctc 7500

cattagagtt tcctagtttt gtcattggag tcctagtagt attagatact agtttgtttc 7560

ctttgcctta tctagaggca cctcaatata caaaggtagc ctagtactgg attatgcctt 7620

aagcaataag aaatatctaa aggggattga cccaaaagcc cagtcgtttc aatgacatac 7680

tagttaaatg ataattctga atattctggg gggcaaagac atgacttttg ccttccatag 7740

tataagagca gcgtggagtg ttattgcttt aagataatga gttttgtttt attcctttga 7800

tatttgtttt tcggcacttc atttgatctg tgcttttaag gcatgcatgt tatgcgattg 7860

cagcagcatt atctagcaat ggcttgattg atgcttacta tatcataggt taaacattaa 7920

gatagattcg tatggcacat atgatatctc aagtacataa cataacacat gtatgtgtaa 7980

atttgcttct cctgccgagt tctcactgat acacaggtcc taatccaact tgtcaatgag 8040

aaccagtgga taaagtgaat taaggccatg gcatggtgtc taaaacaata attaattttc 8100

atttgcttta tttaactgca atgcctattt gaagtagtgc ctagagcaca tgagcatttc 8160

aatcattatc ttgaatgttc cacagaactc aggtgttcca ccatatatgc tcagatttat 8220

catctgtcgt tgatgaataa ttttgttgta ataatagtaa agatcacttc tcatcactat 8280

tagtttgaaa gtacgtgtta agatacatgc ctatttatct gctcagtgaa catatgttgt 8340

gaatggctgc atcatttcag cgcaataatt ttgtttgtcg cattttttcc cctgtactaa 8400

atgggcatat tgtactttcc agccccaagg gacagagttt tgctacttgc caagaggttt 8460

ctgcatacct catgtcactt cttgggtatc cggagttcaa aacggataat attgagtatg 8520

gtagcacaca acaacatggc ttgtgtgctg acgatggtgt taatgtaagt tgaaagtgta 8580

tgtcacttta tcttgtgaac ttgagtttgt ctagtttaat ttttgggttt gtggcaggtt 8640

ttaggtgttc aacaccaaat tggtacaggt atggacagtc aaagtatttt gccagttgct 8700

tctattacct tttctagtca ttcaagagat caagacgaaa cagatgcaga tgatataaat 8760

tcttatgaat gtcaacaatg caatttaact tttcatggtc agagtgccta tgcgcatcac 8820

ctgatcactt ttcacaaaat gggttctaaa aggcgtaaga ttaacaaggt tggcaaattt 8880

ggtgagccag tgataggcaa agatgggaaa tttgaatgcc cagtatgtaa taagacgttt 8940

gaggaacagt cacggtactt tggtcacgtt ggatcccatg caaagtatca cgggctgact 9000

cctgaagcat tcctacaaac cttgtcagga aaggttggta acgattcttt tgcaggtttg 9060

tcatgtagcc ttcaagattt ggtcggatca ccacaactga atgagaagac tactgctagt 9120

gaagcacgat cacagcatca caattgttca actaaacatg gaggcaatag tacaagaggt 9180

atagaccttt ttaactcaaa ttgtccagct aacttcaatg ggcataatca aacttggtgt 9240

agacctgatg aaattcctcc caccacagat gctccaagca catggactta tagaaataat 9300

gtgacgaact gtgctgatag aactgttccg agaacagcac ctcagcccaa tgatcacatg 9360

gattgcaggg ttagtggctt tgctgaagca actaatttta acgatcaagc aggaagacac 9420

caaggtttta gaccttcctc ctttggaact accaaccatt gtcaaggcca gataattgat 9480

catgcagtag ctgcttccaa gcatgctgag gttaataata gtatgaaatc aagagatgtc 9540

aacctcaatt cacgcctgaa cacaatatcc tttcctattg caactgcgaa caatgaaaca 9600

tcgactgccc ttaatgacgt gaatcggtca tgcattactg gaaaaggttt tagtggaagt 9660

ttcagtaaca atgatggtgc tgcatctatc gtgttgccca gttctggatt aaacaataaa 9720

attcctagct ccctcggtgt agctgacaga tcatctattg ctgcaagatc cttcaatgct 9780

ggttatgtta atgaaaatgg tgcttctgaa gctaacaata ttggcaacaa aaacaatacc 9840

atggtgtatc agacaagttt ggccatgcgc ccagtctctc ctgtaagtaa catggattgc 9900

ttcatttcct gttcagtgca tttaaaaata gcaacagaca tctgtatgat acaaatgaat 9960

gaatggatag catacaaaac aaaactagta actaagctag attttctgtt gatgcttata 10020

ataataaaat attgactggc agtgtcactg aaaggagtct acccagtgta atagaaactc 10080

cagtcacgta ggacctaata tttcaagcca cgattcatca cttcctaaat caagcacact 10140

agcagccagt aacttaagca aggggagtga tgtcaactgg aaggtttctt ttgttaatag 10200

aagcaattcc aactgcataa tgggctcttt tgttacccac tagtttctgc ttgaggtttt 10260

gggaaggact agtagtgtta tgcaaaatcg atacaatgat tgtgccactg cttgtaactt 10320

gctcgcttca gcaagtacta gccagaatgc caacaatctt atgcctatgt aggacaattt 10380

tggtcatgtg tagtttacgc tctggtttgt tctgttggtg atgttccaat cagcagcaca 10440

accagagatc aggtagactg catcaaacat tctttttagt ctgatcactc ctgtgatgtt 10500

taaaaatgct ttcgatattt tatttttgta aatctagtgg aacccagtaa tataatgcct 10560

ctttaggtca gttcatttga cataaatcaa ccagtataat tagactatgc aataggaaag 10620

gaggaaatga acattgtgtt tctcaagact attgcttata agttgttttg cttttgtcat 10680

tgttaccagt tttgttaaag tgtgcataga gtgaatggtt ttttcctctc atgaacgact 10740

atgacatttc atgctgagtg tcctacatgc tgatttgatc ttatttttcc tacacagtgt 10800

gatctgcaac ttggatttag tggtcagaag cagcagatat tgcctggtta tggagaactt 10860

agaccagctg cgtctgggtc ccctcagctt gggggcatgg cagcaaacag ttcaattccc 10920

accagaccct ctcagccgca gtttgggagt atggccagaa ccgatgcttt gcctactgga 10980

ccctctcaac cagggagctt ggccagacct aattttgtgc ccacaggatt ttctcagttt 11040

gcaagcaggc cacctacttc tgtaccacca gccgattcct ctcagtttgc agggggcatg 11100

gccaggcaaa acattccgac catgtctgaa ccaactctag tattgggcta tactcctcag 11160

atggtcaatg gccctccagc ccagctagga tgggatctat ctttgtcaag gatggtcagt 11220

gaaggcatgc tcccagtgtt atgtatatgg tgcaacagcc aattccacca ttttggcccc 11280

attgatgcac agcaatctgg ttcgtttggt ttcatttgcc cagcttgcaa ggagaagatg 11340

tcaggcaatc ctaatgcgcc caataacggt ccatggcaac catgataact gttgtggctg 11400

gtctacaatc atttctgttg ctggatcttt ggtctaaggt tagctgcggt gtgcctgcac 11460

cccagagttt tagtagggta tctaggaacg atgtctgtat tttgtggact ctcttctgta 11520

cgtacttctg ttgaaatgtg aagaaaaccc caagagaaaa acccactgaa tgttgtactt 11580

ttggcaggat ggatctccag taagattcaa gggttgtacg cagccatcat ccaaaaagag 11640

tttatgagat agattttgat gtagtattat tgtttggcaa caaaggtaca agttgatcgc 11700

acgctgatcg cgtgatagac ctggtactgg tagaatccat acgacaacga tttggacgaa 11760

tcttctttca tgacgaacat tcactatcat catctgatac aaaagttctc tttttttttt 11820

tcagccttac agccttagaa cctttggtgt ttctactaat tatatattcc aggcttccag 11880

cagataaaaa tacatcaata catgcatgct gaacattaat tcactaaacc attgtgggaa 11940

cttcttttat ttaacgatga cataaccgct aggataaaca gaacccaaca ttattatatt 12000

cctttctttt atttaacgat gacataaccg ctagggttaa cagaacccaa cattattaca 12060

ttcctcttat atttttcttc caggaacatt attgcgttat attactactg aaaatctgaa 12120

atatctatcc ttcttgggtt cttgcctcga cgtggcaaat gtgatgacta taataataat 12180

tatatggtct actccctccg tttcacaatg taagtcattc tagtattttc cacatttata 12240

ttgatgttaa tgaatctaga tacattgatg ttaatgtgga aaatactaga atgacttaca 12300

ttgtgaaatg gaggaagtag ctccgaaact ctacggacat cccctgaaag aaaaagagga 12360

gatgaaatgc accacattca tgtggaaaat ctcaaacaca atatattttt ttttatatta 12420

agatagcttg aaaaaaagct accacatcca ctatagaggc caactggtca agtaattaac 12480

acactaatta aagaaaagga aaaatatctg caacgtttga ttatggtggg ttcagattat 12540

aacaatatag attgattgat ataattgtat acaacgtaaa aataaactta gagtgaattt 12600

tattctggac cattttttat taccaatgtt ttcctttgga tcatatttta accaatgttt 12660

ttactttgga ccgggtattc aatatttttt attggatcgg acaattttac ctttataaca 12720

ctcaaatcac tcttttgctt ctccgttgtt tttattttcc taaagggcca tgtaagactc 12780

tttttctcct aatatatccg acaaatctcc tgccgtttaa tgtttaaaaa aaatactgta 12840

gaccactctc cactctttat ccatctacat ttaacttcat attaaaaaga tgaccttaca 12900

tatagccgtg agagtttatt aacgagtaga agcgaaaatt cagttagaaa cattttcttc 12960

cagaaatcga aagcgaaaat gcaggaaata attatatcga gtgtggccag agccgggggc 13020

gtactatacg tacgttgggt tgtaggtgat cctgatgacg ccggcgtcga ggttggcgat 13080

cttggcgaag gcctccctgg agaggtcgat ggtgctcgtg cacccgtcgc tgctggcgca 13140

gttgtcgac 13149

Claims (6)

1.一种调控水稻柱头外露的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO: 2。

2.包含如权利要求1所述基因的载体。

3.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体的骨架质粒为pCAMBIA系列。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体的骨架质粒为pCAMBIA1300。

5.一种农杆菌，其特征在于，所述农杆菌转化了如权利要求2-4中任一项所述的载体。

6.如权利要求1所述的基因、如权利要求2-4中任一项所述的载体、或者如权利要求5所述的农杆菌在水稻杂交育种中的用途，所述用途中采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术将如权利要求1所述的基因整合入栽培稻的基因组中；所述水稻杂交育种用于提高柱头外露水平。