CN114740125A - 一种基于lc-ms的10种心血管药物血清的检测方法及其试剂盒 - Google Patents

一种基于lc-ms的10种心血管药物血清的检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于LC‑MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒，包括混标储备液；所述10种混标储备液的溶质分别为氯吡格雷、利伐沙班、阿哌沙班、达比加群、替格瑞洛、瑞舒伐他汀、去羟乙氧基替格瑞洛、阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀。本发明的各化合物色谱干扰峰较少可得到基线分离，专属性强、重现性好，选择性好；前处理方法简单容易操作，节省时间，远优于现有技术。

Description

一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测方法及其试 剂盒
技术领域
本发明属于，具体涉及一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测方法及其试剂盒。
背景技术
心血管类血药浓度易受遗传、食物、合并用药等多种因素的影响，与疗效及毒性密切相关，血药浓度过高将引起肝、肾毒性及神经***损害和感染，过低则发生排异反应和诱发自身免疫性疾病，且其肾脏毒性反应与肾移植术后的排异反应难以区别，故监测心血管类血药浓度对于指导临床合理用药具有重要的意义。
目前常用的心血管等几种血药浓度的测定方法主要是酶免法等，高效液相色谱法以及LC-MS/MS法。酶免法存在交叉干扰问题，高效液相色谱法存在前处理复杂，最低定量下限较大，分析时间长，消耗大量有机溶剂等问题。Dorota Danielaka等人报道一种利用液质联用的方法同时测定人血浆中替格瑞洛及其代谢产物和阿托伐他汀及其代谢产物的方法。但是阿托伐他汀的代谢产物只测了邻羟基阿托伐他汀，并且前处理过程加入内标，每个样本采集需要10分钟，费时费力。G.SRINIVAS REDDY等人报道了一种测定人血浆中利伐沙班的检测方法，该方法采用固相萃取等复杂的前处理步骤大大增加了实验成本及时间。
综上所述，现有技术中关于抗心血管药物检测的过程主要缺陷在于：
第一，成本高，目前大多数HPLC-MS/MS的方法都采用氘代等内标用来校正基质效应等影响，此类内标成本较高，会直接导致整个检测过程的成本较高；
第二，通量低，现有方法多为一种或几种药物同时测定，但是极少涉及到十几种，影响了检测的效率；
第三，灵敏度低，在同时检测多种药物的过程中，存在多种目标物灵敏度相对较低的问题，影响检测的准确度，
第四，分析时间长，现有技术的测量方法当中LC部分分析时间占绝大部分比例，导致药品检测时间长，一般分析时长都大于5分钟。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测方法及其试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：
本发明的第一方面在于提供一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒，包括混标储备液；所述混标储备液由10种不同浓度的单标储备液制备而成；所述10种单标储备液的溶质分别为氯吡格雷、利伐沙班、阿哌沙班、达比加群、替格瑞洛、瑞舒伐他汀、去羟乙氧基替格瑞洛、阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀。
所述检测试剂盒还包括空白基质；所述空白基质为过滤人血清；
所述检测试剂盒还包括沉淀剂；所述沉淀剂为甲醇；
所述检测试剂盒还包括流动相；所述流动相包括流动相A液和流动相B液；
所述流动相A液为含0.1％甲酸的1mM-5mM甲酸铵水溶液；所述流动相B液为含0.1％甲酸的1mM-5mM甲酸铵甲醇溶液；
所述检测试剂盒还包括质控品；所述质控品包括高质控品、中质控品和低质控品；
本发明的第二方面在于提供一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1，混合标准工作液的制备：
(1)单标储备液的配制(以氯吡格雷为例)：
称取氯吡格雷标准品10mg，用甲醇定容至10mL，得到1mg/mL的氯吡格雷单标母液；后取氯吡格雷单标母液50μL并用甲醇稀释至1mL，得到49.7250μg/mL的氯吡格雷单标储备液；其他单标母液的制备过程同上，分别得到10种心血管药物对应的单标储备液。具体见下表：
Figure BDA0003641250770000021
Figure BDA0003641250770000031
(2)混标储备液(M0)的配制
配制方法见下表，配制后密封保存于-80℃冰箱备用。
Figure BDA0003641250770000032
(3)混合标准工作液的配制
空白基质为过滤人血清
用3800μL的空白基质稀释200μL的M0得到W1，并用100μL的空白基质稀释400μL的W1得到W2，用200μL的空白基质稀释300μL的W1得到W3，用300μL的空白基质稀释300μL的W1得到W4，用300μL的空白基质稀释200μL的W1得到W5，用400μL的空白基质稀释100μL的W1得到W6，用900μL的空白基质稀释100μL的W1得到W7，用300μL的空白基质稀释300μL的W7得到W8，用400μL的空白基质稀释100μL的W7得到W9，用450μL的空白基质稀释50μL的W7得到W10，密封保存于-80℃冰箱；
S2，质控品的制备：
分别取50μL，150μL，400μL标准品溶液W1，用空白基质定容至500μL，混匀，分别得到低中高三个质控品。
S3，待测样本的处理：
精密移取生物样本和空白基质置于洁净的离心管中，加入甲醇，涡旋震荡5min；并离心5min；使用移液器转移上清液到96孔进样板内置于-20℃冷冻供质谱进样。
S4，将待测样本进行检测。
一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒的检测方法，还包括将混合标准工作液和质控品进行检测并绘制标准曲线的步骤：以混合标准工作液的目标物峰面积作为标准曲线图的纵坐标y，以混合标准工作液中浓度作为标准曲线图的横坐标x，得到标准曲线方程。
所述待测样本的检测条件如下：
色谱条件如下：
流动相A液为含0.1％甲酸的1mM-5mM甲酸铵水溶液，所述流动相B液为含0.1％甲酸的1mM-5mM甲酸铵甲醇溶液；
流速为0.2-0.4mL/min，柱温为20-40℃，进样1-10μL；
采用梯度洗脱方式。
其中洗脱梯度如下：在0-0.3min，流动相B液的体积为2％；在0.3-2.0min，流动相B液的体积升高到98％；在2.0-3.5min，流动相B液的体积维持98％；在3.6min，流动相B液的体积降到2％，并维持在2％到4.0min；
串联-质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾毛细管电压：1.0-3.5KV；脱溶剂气温度：400-500℃；脱溶剂气流速：800-1000L/Hr；离子源温度：130-150℃；脱溶剂气压力：8bar；碰撞气压力：0.7bar；扫描模式：多反应监测。
其中，多反应检测的定量分析离子对如下：氯吡格雷定量分析离子对m/z 322.0→211.9，利伐沙班定量分析离子对m/z 435.0→144.8，阿哌沙班定量分析离子对m/z 460.1→443.2，达比加群定量分析离子对m/z 472.2→289.1，替格瑞洛定量分析离子对m/z523.1→152.9，瑞舒伐他汀定量分析离子对m/z 481.5→258.1，去羟乙氧基替格瑞洛定量分析离子对m/z 479.1→152.9，阿托伐他汀定量分析离子对m/z 559.5→440.1，邻羟基阿托伐他汀定量分析离子对m/z 574.9→440.1，对羟基阿托伐他汀定量分析离子对m/z 574.7→440.2。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
.本发明的各化合物色谱干扰峰较少可得到基线分离，专属性强、重现性好，选择性好；前处理方法简单容易操作，节省时间，远优于现有技术。
本发明检测速度快，检测时间为4.0min，比现有技术快，适合大批量临床研究样品分析；
本发明减少了有机溶剂的用量进而降低对环境的污染。
本发明利用LC-MS建立一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测方法及其试剂盒；
本发明运用外标法，解决了成本高的问题。
本发明通过两点取样药时曲线AUC的监测，更准确定量。
附图说明
图1示出了氯吡格雷标准品的MRM谱图；
图2示出了利伐沙班标准品的MRM谱图；
图3示出了阿哌沙班标准品的MRM谱图；
图4示出了达比加群标准品的MRM谱图；
图5示出了去羟基乙氧基替格瑞洛标准品的MRM谱图；
图6示出了瑞舒伐他汀标准品的MRM谱图；
图7示出了替卡格雷标准品的MRM谱图；
图8示了出阿托伐他汀标准品的MRM谱图；
图9示出了邻羟基阿托伐他汀标准品的MRM谱图；
图10示出了对羟基阿托伐他汀标准品的MRM谱图；
图11示出了氯吡格雷的标准曲线图；
图12示出了利伐沙班的标准曲线图；
图13示出了阿哌沙班的标准曲线图；
图14示出了达比加群的标准曲线图；
图15示出了去羟基乙氧基替格瑞洛的标准曲线图；
图16示出了瑞舒伐他汀的标准曲线图；
图17示出了替卡格雷的标准曲线图；
图18示了出阿托伐他汀的标准曲线图；
图19示出了邻羟基阿托伐他汀的标准曲线图；
图20示出了对羟基阿托伐他汀的标准曲线图
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
本发明的第二方面在于提供一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1，混合标准工作液的制备：
(1)单标储备液的配制(以氯吡格雷为例)：
称取氯吡格雷标准品10mg，用甲醇定容至10mL，得到1mg/mL的氯吡格雷单标母液；后取氯吡格雷单标母液50μL并用甲醇稀释至1mL，得到49.7250μg/mL的氯吡格雷单标储备液；其他单标母液的制备过程同上，分别得到10种心血管药物对应的单标储备液，见表1。
表1
Figure BDA0003641250770000081
(2)混标储备液(M0)的配制
配制方法见表2，配制后密封保存于-80℃冰箱备用。
表2混标储备液(M0)的配制
Figure BDA0003641250770000082
Figure BDA0003641250770000091
(3)混合标准工作液的配制
空白基质为过滤人血清
用3800μL的空白基质稀释200μL的M0得到W1，并用100μL的空白基质稀释400μL的W1得到W2，用200μL的空白基质稀释300μL的W1得到W3，用300μL的空白基质稀释300μL的W1得到W4，用300μL的空白基质稀释200μL的W1得到W5，用400μL的空白基质稀释100μL的W1得到W6，用900μL的空白基质稀释100μL的W1得到W7，用300μL的空白基质稀释300μL的W7得到W8，用400μL的空白基质稀释100μL的W7得到W9，用450μL的空白基质稀释50μL的W7得到W10，密封保存于-80℃冰箱；各混合标准工作液的浓度见表3。
表3混合标准工作液工作液的浓度
Figure BDA0003641250770000092
Figure BDA0003641250770000101
S2，质控品的制备：
分别取50μL，150μL，400μL标准品溶液W1，用空白基质定容至500μL，混匀，
分别得到低中高三个质控品。
S3，待测样本的处理：
(1)精密移取生物样本和空白基质200μL置于洁净且编号的1.5mL离心管中(使用橙色96孔离心管架)；
(2)加入1mL甲醇溶液，使用MTV-100多管漩涡混合器2000rpm条件下涡旋震荡5min；
(3)使用Sigma离心机(24/48孔)在8℃且转速不低于13000rpm条件下离心5min；
(4)使用移液器转移150μL上清液到96孔进样板内(注意移液器吸头没入溶液深度，防止吸入沉淀)，置于-20℃冷冻供质谱进样。
质控品的处理：同于样品溶液的处理；
标准品溶液的处理：同于样品溶液的处理。
数据处理：
实验采用MRM模式监测10种药物的离子对(Q1/Q3)，选择不同离子对的CE等进行优化，从优化色谱图中即可看到离子最高信号强度所对应的最佳结果，其他的参数可根据仪器提供的参考值范围选择合适的数值，以保证较强的信号强度。获取标准品的离子色谱图：并绘制外标曲线：
采用外标定量法，以标准品的浓度为X轴，以标准品溶液的峰面积为Y轴，建立外标标准曲线，10种药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数基本都在0.99以上，曲线谱图图11到图20所示，具体参数如表4所示：
表4：10种药物线性回归方程及线性相关系数：
Figure BDA0003641250770000111
S4，将待测样本1-7分别进行检测：检测结果见表5
检测条件如下：
色谱条件如下：
流动相A液为含0.1％甲酸的1mM-5mM甲酸铵水溶液，所述流动相B液为含0.1％甲酸的1mM-5mM甲酸铵甲醇溶液；
流速为0.2-0.4mL/min，柱温为20-40℃，进样1-10μL；
采用梯度洗脱方式。
其中洗脱梯度如下：在0-0.3min，流动相B液的体积为2％；在0.3-2.0min，流动相B液的体积升高到98％；在2.0-3.5min，流动相B液的体积维持98％；在3.6min，流动相B液的体积降到2％，并维持在2％到4.0min；
串联-质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾毛细管电压：1.0-3.5KV；脱溶剂气温度：400-500℃；脱溶剂气流速：800-1000L/Hr；离子源温度：130-150℃；脱溶剂气压力：8bar；碰撞气压力：0.7bar；扫描模式：多反应监测。
其中，多反应检测的定量分析离子对如下：氯吡格雷定量分析离子对m/z 322.0→211.9，利伐沙班定量分析离子对m/z 435.0→144.8，阿哌沙班定量分析离子对m/z 460.1→443.2，达比加群定量分析离子对m/z 472.2→289.1，替格瑞洛定量分析离子对m/z523.1→152.9，瑞舒伐他汀定量分析离子对m/z 481.5→258.1，去羟乙氧基替格瑞洛定量分析离子对m/z 479.1→152.9，阿托伐他汀定量分析离子对m/z 559.5→440.1，邻羟基阿托伐他汀定量分析离子对m/z 574.9→440.1，对羟基阿托伐他汀定量分析离子对m/z 574.7→440.2。
表5，实际检测结果
Figure BDA0003641250770000121
Figure BDA0003641250770000131
均在线性范围内。
准确度验证
准确度实验：组间准确度，通过分析至少三天两个不同浓度样品(每个浓度点做6个平行样品)来得到，见表6；合格的标准要求平均测量的每一个水平的浓度在15％理论值以内，即准确度的范围在85％-115％之间。质控：LQC低浓度质控；MQC中浓度质控；HQC高浓度质控
表6：质控样检测三天的准确度数据
Figure BDA0003641250770000132
Figure BDA0003641250770000141
Figure BDA0003641250770000151
精密度验证
精密度：一次测定三个不同浓度的QC，每个浓度的样本数量要求不小于5个(n＝6)，合格的标准要求每一个水平的浓度QC样品的CV≤15％，如表7：
表7：精密度验证结果
Figure BDA0003641250770000152
Figure BDA0003641250770000161
注：LQC为低浓度质控品；MQC为中浓度质控品；HQC为高浓度质控品。
本发明采用LC-MS方法同时检测10种抗心血管药物的方法。本发明采用外标法进行定量测量，即，不需要昂贵的内标物降低检测成本。在短时间(4min)内即可高通量高灵敏度地同时检测到10种药物，鉴于考察本发明的结果精准度和可重复性，比对精密度与准确度数据，可知该方法的精准度且可重复性均很高。总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理步骤简单，在4min之内可同时完成10种药物的分离和检测，且采用外标法的方式简单地实现有机酸的定量，可重复性高且成本低下，精密度和可重复性均符合基本要求。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒，其特征在于，包括混标储备液；所述10种单标储备液的溶质分别为氯吡格雷、利伐沙班、阿哌沙班、达比加群、替格瑞洛、瑞舒伐他汀、去羟乙氧基替格瑞洛、阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀。
2.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括空白基质；所述空白基质为过滤人血清。
3.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括沉淀剂；所述沉淀剂为甲醇。
4.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括流动相；所述流动相包括流动相A液和流动相B液；
所述流动相A液为含0.1％甲酸的1mM-5mM甲酸铵水溶液；所述流动相B液为含0.1％甲酸的1mM-5mM甲酸铵甲醇溶液。
5.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括质控品；所述质控品包括高质控品、中质控品和低质控品。
6.一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，混合标准工作液的制备：通过用甲醇分别制备10种浓度不同的单标储备液，后分别取不同体积的单标储备液制备成不同浓度的混标储备液；将混标储备液用空白基质逐级稀释，分别得到W1-W9的混合标准工作液；
S2，质控品的制备：将混合标准工作液W1通过用空白基质稀释，分别得到低中高三种质控品；
S3，待测样本的处理：精密移取生物样本和空白基质置于离心管中，加入甲醇溶液，涡旋震荡，并离心，后置于-20℃冷冻；
S4，将待测样本进行检测。
7.根据权利要求6所述的一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，还包括将混合标准工作液和质控品进行检测，并绘制标准曲线的步骤：以混合标准工作液的目标物峰面积作为标准曲线图的纵坐标y，以混合标准工作液中浓度作为标准曲线图的横坐标x，得到标准曲线方程。
8.根据权利要求6所述的种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述待测样本的检测条件如下：
色谱条件如下：
流动相A液为含0.1％甲酸的1mM-5mM甲酸铵水溶液，所述流动相B液为含0.1％甲酸的1mM-5mM甲酸铵甲醇溶液；
流速为0.2-0.4mL/min，柱温为20-40℃，进样1-10μL；
采用梯度洗脱方式；其中洗脱梯度如下：在0-0.3min，流动相B液的体积为2％；在0.3-2.0min，流动相B液的体积升高到98％；在2.0-3.5min，流动相B液的体积维持98％；在3.6min，流动相B液的体积降到2％，并维持在2％到4.0min；
串联-质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾毛细管电压：1.0-3.5KV；脱溶剂气温度：400-500℃；脱溶剂气流速：800-1000L/Hr；离子源温度：130-150℃；脱溶剂气压力：8bar；碰撞气压力：0.7bar；扫描模式：多反应监测。
9.根据权利要求8所述的一种基于LC-MS的10种心血管药物血清的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，多反应监测的定量分析离子对如下：氯吡格雷定量分析离子对m/z322.0→211.9，利伐沙班定量分析离子对m/z 435.0→144.8，阿哌沙班定量分析离子对m/z460.1→443.2，达比加群定量分析离子对m/z 472.2→289.1，替格瑞洛定量分析离子对m/z523.1→152.9，瑞舒伐他汀定量分析离子对m/z 481.5→258.1，去羟乙氧基替格瑞洛定量分析离子对m/z 479.1→152.9，阿托伐他汀定量分析离子对m/z 559.5→440.1，邻羟基阿托伐他汀定量分析离子对m/z 574.9→440.1，对羟基阿托伐他汀定量分析离子对m/z574.7→440.2。
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