CN114729940A - 抗体分型和量化的lc-ms方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了基于免疫捕捉和/或液相色谱‑质谱(LC‑MS)分析的抗体分型和量化的方法和***。通过施用药品来诱导这些抗体。所述免疫捕捉方法包括使样本与固相载体接触，其中，所述药品已经与固相载体直接交联。所述MS分析包括进行肽图分析、选择唯一肽和碎片离子产生MRM(多反应监测)跃迁、优化碰撞能量以及确定LLOQ(定量下限)。

Description

抗体分型和量化的LC-MS方法

发明领域

本发明一般涉及抗体(由施用药品诱导)分型和量化的方法和***。这些方法和***是基于免疫捕捉和/或液相色谱-质谱分析。

背景技术

由于施用药品会诱导抗体，例如，诱导抗药抗体(ADA)，因此存在药物功效和患者安全问题，因为ADA会导致一些临床后果，例如，降低药物功效、与内源性蛋白质发生交叉反应或改变治疗性蛋白的药代动力学。FDA建议采用基于风险的方法来评估并减轻与治疗性蛋白产品相关的不良免疫相关反应的免疫反应，这些不良免疫反应会影响产品的安全性和功效。(行业指南：治疗性蛋白产品的免疫原性评估，2014年8月，美国卫生与公众服务部，食品药品监督管理局)

为了评估和报告包括单克隆抗体、酶产物、细胞因子、生长因子和毒素在内的免疫原性数据，对121种FDA批准生物制品的处方信息和FDA临床药理学综述进行了审查。报告频率最高的是免疫原性事件。ADA的临床意义尚不清楚。总体来说，产品全身清除率提高与ADA相关功效降低之间存在明显的一致性。(Wang等人，从临床药理学角度评估和报告生物制品的免疫原性影响。美国药学科学家协会(AAPS)杂志。2016年；18(2)：395-403)。

免疫反应的生物复杂性为量化ADA对药代动力学的影响带来了挑战，因为在评估ADA效应时，药代动力学暴露可能比功效终点更敏感。

应理解的是，需要一些方法对ADA进行表征，例如，确定ADA的同种型并进一步量化ADA是否存在。这些方法可提供与施用药物(例如，施用生物制品)的药代动力学、功效和安全性相关的临床药理学中免疫原性影响的宝贵信息。

发明内容

蛋白药品的免疫原性事件越来越需要表征是否存在由施用蛋白药品所诱导的抗体，例如，抗药抗体(ADA)。ADA的表征数据可用于了解蛋白药品的免疫原性，从而提高药物的安全性。

本发明所述的示例性实施例通过提供用于表征、识别和/或量化由施用药品诱导的抗体的方法和***，满足了上述需求。本发明中的方法和***使用免疫捕捉和/或液相色谱-质谱(LC-MS)方法提供了ADA的分型和量化。

本发明至少部分提供了一种识别样本中至少一种肽或蛋白的方法，包括：使样本与固相载体接触，其中，在固相载体上已附着至少一种药品；使用至少一种流动相溶液清洗所述固相载体，获得至少一种洗脱液；从洗脱液中分离出至少一种肽或蛋白；用变性溶液和/或酶消化反应处理分离肽或蛋白质，形成分离肽或蛋白的成分；使用质谱仪识别所述分离肽或蛋白的成分。

在某些示例性实施例中，识别样本中至少一种肽或蛋白的方法能够确定分离肽或蛋白的同种型或亚类。

在某些示例性实施例中，识别样本中至少一种肽或蛋白的方法能够使用质谱仪量化分离肽或蛋白。

在其他示例性实施例中，本发明所述方法中的药品可以是一种药物、化合物、核酸、毒素、肽、蛋白、融合蛋白、抗体、抗体片段、抗体Fab区、抗体-药物偶联物或蛋白药品。

在某些方面，本发明所述方法中至少一种肽或蛋白可以是抗体，所述抗体可选择性与附着在固相载体上的药品结合。

在某些方面，当本发明所述方法中至少一种肽或蛋白可以是人类抗体时，所述人类抗体的同种型可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgM或IgE。

在其他方面，当本发明所述方法中至少一种肽或多肽可以是哺乳动物类抗体时，所述哺乳动物类抗体的同种型可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM或IgA。

在其他方面，当本发明所述方法中至少一种肽或蛋白可以是人类抗体时，所述分离肽或蛋白成分的氨基酸序列可以是GPSVFPLAPSSK、GLPAPIEK、WYVDGVEVHNAK、GLPSSIEK、DASGVTFTWTPSSGK、DASGATFTWTPSSGK、VSVFVPPR或DFTPPTVK。

在其他方面，当本发明所述方法中至少一种肽或蛋白可以是哺乳动物类抗体时，所述分离肽或蛋白成分的氨基酸序列可以是GPSVFPLAPSSR、GPSVFPLASCSR、GPSVFPLVSCSR、GPSVFPLASSSR、QIEVSWLR或DPSGATFTWTPSSGK。

在某些示例性实施例中，本发明所述方法中的样本可以在接触固相载体之前，经过溶液处理达到约0.1-4.5的pH值范围，其中，所述溶液包含乙酸。

在某些示例性实施例中，本发明所述方法中的样本可与固相载体在室温下培养约1小时。

在某些方面，本发明所述方法中的样本进一步包含盐和表面活性剂。

在其他方面，本发明所述方法中的样本进一步包含BSA(牛血清白蛋白)、HEPES(4-(2-羟乙基)-l-羟乙基哌嗪乙磺酸)、氯化钠、EDTA(乙二胺四乙酸)和Tween-20(聚山梨醇酯20)，其中，所述样本的pH值范围约为6-9。

在某些示例性实施例中，可使用包含盐或表面活性剂的至少一种流动相溶液和至少另一种pH值范围在0.1-4.5之间的后续流动相溶液清洗本发明所述方法中的固相载体。

在某些方面，本发明所述方法中至少一种流动相溶液包含BSA(牛血清白蛋白)、HEPES(4-(2-羟乙基)-l-羟乙基哌嗪乙磺酸)、氯化钠、EDTA(乙二胺四乙酸)和Tween-20(聚山梨醇酯20)，并且pH值范围约为6-9。

在某些示例性实施例中，本发明所述方法中的变性溶液包含约5-10M的尿素。

在某些示例性实施例方面，本发明所述方法中的酶消化反应的酶为胰蛋白酶。

在某些示例性实施例中，可使用一级胺-环氧反应或使用生物素-链亲和素相互作用在固相载体上附着本发明所述方法中的药品，其中，可使用药品的赖氨酸残基进行一级胺-环氧反应通过交联在固相载体上附着所述药品。

在某些示例性实施例中，本发明所述方法中的质谱仪可以是电喷雾电离质谱仪、纳升电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪，其中，所述质谱仪可与液相色谱***连接。

在某些方面，本发明所述方法中的质谱仪能够进行LC-MS(液相色谱-质谱法)或LC-MRM-MS(液相色谱-多反应监测-质谱法)分析。

在某些示例性实施例中，本发明所述方法中分离肽或蛋白的成分至少约为0.01ng、0.1ng、0.2ng或0.3ng。

在某些示例性实施例中，识别样本中至少一种肽或蛋白的方法能够使用质谱仪量化分离肽或蛋白，其中，所述方法进一步包括以下步骤：对分离肽或蛋白进行肽图分析，选择分离肽或蛋白的唯一肽和碎片离子产生MRM(多反应监测)跃迁，选择唯一肽的前两种或前三种跃迁，优化唯一肽的碰撞能量，然后生成一个校准曲线，以及根据校准曲线确定LLOQ(定量下限)。

本发明至少部分提供了一种识别或量化样本中至少一种肽或蛋白的***，包括：一种固相载体，其中，在所述固相载体上已附着一种药品；至少一种流动相溶液，用于清洗固相载体并能够提供用于分离至少一种肽或蛋白的至少一种洗脱液(包含至少一种肽或蛋白)；一种变性溶液和/或酶消化溶液，能够形成分离肽或蛋白的成分；以及一个质谱仪，能够识别或量化分离肽或蛋白的成分。

在某些方面，本发明所述***中的质谱仪能够识别或量化所述分离肽或蛋白的同种型或亚类。

在某些示例性实施例中，本发明所述***中的药品可以是一种药物、化合物、核酸、毒素、肽、蛋白、融合蛋白、抗体、抗体片段、抗体Fab区、抗体-药物偶联物或蛋白药品。

在某些示例性实施例中，本发明所述***中的至少一种肽或蛋白可以是抗体，所述抗体可选择性与附着在固相载体上的药品结合。

在某些方面，当本发明所述***中至少一种肽或蛋白可以是人类抗体时，所述人类抗体的同种型可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgM或IgE。

在某些方面，当本发明所述***中至少一种肽或多肽可以是哺乳动物类抗体时，所述哺乳动物类抗体的同种型可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM或IgA。

在其他方面，当本发明所述***中至少一种肽或蛋白可以是人类抗体时，分离肽或蛋白成分的氨基酸序列可以是GPSVFPLAPSSK、GLPAPIEK、WYVDGVEVHNAK、GLPSSIEK、DASGVTFTWTPSSGK、DASGATFTWTPSSGK、VSVFVPPR或DFTPPTVK。

在其他方面，当本发明所述***中至少一种肽或蛋白可以是哺乳动物类抗体时，分离肽或蛋白成分的氨基酸序列可以是GPSVFPLAPSSR、GPSVFPLASCSR、GPSVFPLVSCSR、GPSVFPLASSSR、QIEVSWLR或DPSGATFTWTPSSGK。

在某些示例性实施例中，本发明所述***中的样本可在接触固相载体之前，经过溶液处理达到约0.1-4.5的pH值范围，其中，所述溶液包含乙酸。

在某些方面，本发明所述***中的样本可与固相载体在室温下培养约1小时。

在某些方面，本发明所述***中的样本进一步包含盐和表面活性剂。

在其他方面，本发明所述***中的样本进一步包含BSA(牛血清白蛋白)、HEPES(4-(2-羟乙基)-l-羟乙基哌嗪乙磺酸)、氯化钠、EDTA(乙二胺四乙酸)和Tween-20(聚山梨醇酯20)，其中，所述样本的pH值范围约为6-9。

在某些示例性实施例中，可使用包含盐或表面活性剂的至少一种流动相溶液和至少另一种pH值范围在0.1-4.5之间的后续流动相溶液清洗本发明所述***中的固相载体。

在某些方面，本发明所述***中至少一种流动相溶液包含BSA(牛血清白蛋白)、HEPES(4-(2-羟乙基)-l-羟乙基哌嗪乙磺酸)、氯化钠、EDTA(乙二胺四乙酸)和Tween-20(聚山梨醇酯20)，并且pH值范围约为6-9。

在某些示例性实施例中，本发明所述***中的变性溶液包含约5-10M的尿素。

在某些示例性实施例方面，本发明所述***中的酶消化反应的酶为胰蛋白酶。

在某些示例性实施例中，可使用一级胺-环氧反应或使用生物素-链亲和素相互作用在固相载体上附着本发明所述***中的药品，其中，可通过使用药品的赖氨酸残基进行一级胺-环氧反应通过交联在固相载体上附着所述药品。

在某些示例性实施例中，本发明所述***中的质谱仪可以是电喷雾电离质谱仪、纳升电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪，其中，所述质谱仪可与液相色谱***连接。

在某些方面，本发明所述***中的质谱仪能够进行LC-MS(液相色谱-质谱法)或LC-MRM-MS(液相色谱-多反应监测-质谱法)分析。

在某些示例性实施例中，识别或量化样本中至少一种肽或蛋白的***能够：对分离肽或蛋白进行肽图分析，选择分离肽或蛋白的唯一肽和碎片离子产生MRM(多反应监测)跃迁，选择唯一肽的前两种或前三种跃迁，优化唯一肽的碰撞能量，然后生成一个校准曲线，以及根据校准曲线确定LLOQ(定量下限)。

结合以下说明和附图，将更好地理解本发明的这些方面及其他方面。以下说明虽规定了各个实施例及其许多具体细节，但仅用于说明目的，不应视为对本发明的限制。在本发明范围内可进行多种替换、修改、添加或重新布置。

附图说明

本专利或专利申请文件包含至少一幅彩图。专利局将根据申请并在支付必要的费用后提供本专利或专利申请出版物的副本与彩图。

图1显示了示例性实施例所述的从猕猴IgG1替代肽中选择产物离子。

图2A和2B显示了示例性实施例所述的从猕猴IgG1替代肽中选择的前2种跃迁和碰撞能量的优化。图2A显示了示例性实施例所述的产物离子的峰面积。图2B显示了示例性实施例所述的选择的碰撞能量。

图3显示了示例性实施例所述的使用三重四极杆LC-MS确定仪器检测限。对不同量的免疫球蛋白肽进行了测试，包括0.3ng、0.9ng、3ng、9ng、30ng、90ng和300ng。根据示例性实施例对猕猴IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM和IgA进行了测试。

图4显示了示例性实施例所述的使用生物素化药物微珠或交联药物微珠的ADA的回收率。

图5A和5B显示了示例性实施例所述的在进行酶消化之前，存在变性溶液(溶解干燥ADA)时使用药物A或药物B捕捉ADA。图5A显示了使用药物A捕捉ADA，而无需使用变性溶液来溶解干燥ADA。图5B显示了存在变性溶液(溶解干燥ADA)时使用药物A或药物B捕捉ADA。

图6显示了示例性实施例所述的存在猕猴血清时的非特异性相互作用。

图7显示了示例性实施例所述的免疫捕捉培养条件的优化，包括培养条件，其中包括在室温下培养1小时或在4℃下隔夜培养。

图8显示了示例性实施例所述的使用IgG2作为噪声指示剂优化免疫捕捉的培养条件。

图9显示了示例性实施例所述的在酸性条件下通过中断血清中的相互作用来优化免疫捕捉。条件1：在49μL猕猴血清中加入1μL 5M乙酸，培养1小时(最终乙酸浓度为300mM)。条件2：在50μL猕猴血清中加入50μL 600mM乙酸，培养1小时(最终乙酸浓度为300mM)。

图10显示了示例性实施例所述的使用IgG药物的Fab部分捕捉ADA以便优化ADAIgG4的分型和量化。仅包含Fab的药物能消除血清IgG4与IgG4药物Fc区的相互作用。对于IgG1，完整抗体和仅Fab非特异性结合较低。

图11显示了示例性实施例所述的使用IgG药物的Fab部分捕捉ADA以便对IgM ADA进行分型和识别。结果表明，血清IgM和药物Fab区之间的相互作用会导致高IgM背景。

图12显示了示例性实施例所述的用于ADA分型和量化的优选免疫捕捉、酶消化和LC-MC方法。

图13显示了示例性实施例所述的在制定免疫捕获方法前后使用药物A或B生成校准曲线并确定检测限或定量限的ADA测试范围。

图14显示了示例性实施例所述的不同浓度的药物A或B对ADA定量和检测的影响。

图15显示了示例性实施例所述的在临床前毒理学研究中猕猴A或B血清样本中药物B的浓度。

图16显示了示例性实施例所述的在猕猴A和B中测量的ADA总量。根据示例性实施例，使用本发明所述的免疫捕捉-LC/MS方法测量猕猴A和B中的ADA总量，如图16A所示。根据示例性实施例，使用配体结合法分析(LBA)测量猕猴A和B中的ADA总量，如图16B所示。

图17A和17B显示了示例性实施例所述的ADA同种型的相对定量，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgA的数量。图17A显示了示例性实施例所述的猕猴A的定量。图17B显示了示例性实施例所述的猕猴B的定量。

图18显示了示例性实施例所述的在临床前药代动力学研究中监测到的猕猴A、B或C血清样本中药物A的浓度。

图19显示了示例性实施例所述的使用药物A的猕猴的临床前药代动力学研究中，用本发明所述的用于ADA分型和定量的免疫捕捉-LC/MS方法测量的猕猴A、B和C中的ADA总量。

图20显示了示例性实施例所述的使用药物A的猕猴的临床前药代动力学研究中，ADA同种型的相对定量，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgA。

具体实施方式

由于蛋白药品的免疫原性事件，人们对药物功效和患者安全性的担忧日益增加，导致对抗药物抗体(ADA)表征的需求不断增加。例如，了解ADA对降低药物功效、与内源性蛋白交叉反应或改变药品药代动力学的影响需要对ADA进行表征。ADA的表征数据可为药品免疫原性提供宝贵信息，从而提高给药的安全性。

本发明通过提供用于表征、识别和/或量化由施用药品诱导的抗体的方法和***来满足上述需求的方法和***。本发明中的方法和***使用免疫捕捉和/或液相色谱-质谱(LC-MS)方法提供了ADA的分型和量化。这些方法和***可用于临床前毒理学或药代动力学研究，以便通过ADA分型和量化在施用药品前后一段时间内监测ADA。

已经报道了有关ADA中和活性的事件，例如临床药理学中与药代动力学、疗效和安全性有关的免疫原性影响。在药物治疗过程中形成ADA可能会导致患者体内药物浓度下降，从而降低疗效。患者体内可能存在各种能与药物不同位点结合的ADA，例如，中和或非中和ADA。中和ADA能够与药物分子的活性位点结合，例如，药物分子中与药物靶标结合的结合位点，或抗体药物的可变区。当中和ADA与药物的活性位点结合时，它会使药物失去活性。非中和ADA能够与药物分子的非活性位点结合，例如，抗体药物分子的恒定区或支架。虽然药物在非中和ADA的结合下仍然具有活性，但存在非中和ADA可能会导致临床药理学的某些变化。

免疫原性是指治疗性产品对自身和相关蛋白产生免疫反应的倾向，例如，诱导免疫相关的不良临床事件。相关的免疫原性信息包括诱导结合抗体、诱导中和抗体、改变药代动力学、降低功效和安全性问题。但是，ADA的临床意义尚不清楚。此外，有限的可用数据可能无法确定ADA的影响。ADA可能与药品的全身清除率增加和功效降低之间的一致性有关。一些药品具有药物维持的ADA可能会降低清除率，这可能是由于形成了ADA药物复合物，例如，药物的ADA结合。(Wang等人，从临床药理学角度评估和报告生物制品的免疫原性影响。美国药学科学家协会(AAPS)杂志。2016年；18(2)：395-403)

免疫球蛋白是由两条重链和两条轻链组成的异源二聚体蛋白。免疫球蛋白具有结合抗原的可变结构域和规定效应子功能的恒定结构域。重链恒定结构域主要有五类。每类定义了IgM、IgG、IgA、IgD和IgE的同种型。IgG可分为四个亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgA可分为IgAl和IgA2。不同的ADA同种型可引起不同的免疫反应。

7天首次药物暴露可产生ADA的IgM同种型,血清中浓度为1.5mg/mL。IgM的功能包括初次应答和固定补体。IgM单体可作为B细胞受体。25-35天第二次药物暴露可产生ADA的IgG同种型,血清中浓度为0.5-9mg/ml。IgG的功能包括提供主要血抗体、中和毒素和调理作用。ADA的IgA同种型在血清中的浓度为0.5-3mg/ml。IgA可分泌为粘液、眼泪和唾液。ADA的IgE同种型在血清中的浓度为0.05mg/ml。IgE提供过敏和抗寄生虫活性。IgD同种型可提供B细胞受体。(Schroder WH，Cavacini L。免疫球蛋白的结构与功能。过敏与临床免疫学杂志。2010年；125(202)：S41-S52)

FDA建议开发ADA分型分析了解潜在的患者免疫反应，特别是ADA诱导事件以及ADA反应对治疗性蛋白产品安全性和有效性的影响。有用的表征分析包括分型、表位作图和评估交叉反应性区分抗体同种型。(FDA行业指南：治疗性蛋白产品免疫原性测试的分析开发和验证，草案，2016年)。

在某些示例性实施例中，本发明提供使用免疫捕捉和液相色谱-质谱(LC-MS)方法对ADA进行分型和量化的方法和***。这些方法和***满足了长期以来对施用药物或蛋白药品诱导的抗体进行表征的需求，可用于临床前或临床毒理学和药代动力学研究。

在某些示例性实施例中，免疫捕捉方法与LC-MS分析相结合，对ADA进行分型和量化。免疫捕捉方法包括使用酸解离处理含有ADA的血清样本，其中，向血清样本添加酸性溶液来防止血清样本中各种成分之间的聚集或结合，例如，内源性血清抗体、蛋白药品、抗体药物、已存在药物或ADA。血清样本的酸解离处理为后期的LC-MS分析提供了降低背景噪声的绝佳优势。然后，由可与固相载体偶联的药品捕获血清样本中的ADA，例如药物偶联微珠或药物微珠，其中ADA可选择性与药品结合，其中药品可以是给药后诱导ADA的药品。

在某些方面，通过药物偶联微珠和含有ADA的血清样本的培养，由药物偶联微珠捕捉ADA。然后，将微珠分离，例如，使用磁体分离药物偶联磁珠。清洗分离微珠。然后进行洗脱分离ADA。分离的ADA经过酶消化，例如，胰蛋白酶消化。使用LC-MS或LC-MRM-MS(液相色谱-多反应监测-质谱法)方法识别和量化每个ADA同种型/亚类的唯一肽。

在某些示例性实施例中，制定了从猕猴或人类血清样本中分离ADA的免疫捕捉方法，包括优化免疫捕捉提高ADA的回收率、尽量减少非特异性相互作用引起的背景噪声、生成量化标准曲线，以及确定定量下限(LLOQ)。

在某些示例性实施例中，可制定ADA分型和量化的LC-MRM-MS方法，包括为猕猴或人类抗体的每个同种型或亚类选择唯一替代肽，为MRM(多反应监测)定量选择量化和确定肽，制定三重四极杆质谱仪的MRM方法，以及确定仪器检测限。

在某些示例性实施例中，所述分离ADA经过酶消化得到肽组合。通过制定的LC-MS或LC-MRM-MS方法分析肽的组合，以识别和量化ADA的同种型。在某些示例性实施例中，制定的LC-MS或LC-MRM-MS方法进一步包括以下步骤：为每个同种型选择唯一替代肽，进行肽图分析，选择肽和碎片离子生成MRM跃迁，选择唯一肽的前两种或前三种跃迁，优化唯一肽的碰撞能量，然后生成一个校准曲线，以及根据校准曲线确定仪器检测限。在某些方面，在QEplus(赛默飞世尔科技公司的Q Exactive^TM Plus轨道阱LC-MS/MS***)上进行肽图分析，在三重四极杆质谱仪上选择前两种或前三种跃迁。

可采用LC-MS方法识别和量化本发明中的抗体同种型，并且考虑到分析的灵敏度，在不同的肽水平上进行识别和量化，包括基于从靶向抗体衍生的选定特征唯一肽，对靶向抗体进行酶消化和量化。

本发明所述方法或***提供了生成数据集的优势，这些数据集允许在多个样本中对ADA的同种型进行一致的识别和精确的量化。在某些示例性实施例中，本发明所述方法或***提供了一种基于MRM的方法，以可靠量化复杂混合物中低丰度ADA的同种型。在MRM方法中，通过三重四极杆仪器的两个质量过滤器选择预定义的前体离子及其一种碎片。随着时间的推移生成和监测一系列前体和碎片离子对，例如，跃迁。当一系列跃迁与靶向肽的保留时间相结合时，它可以为精确量化提供明确的分析。它可以在单次LC-MS实验中对大量肽进行量化。

考虑到现有方法的局限性，使用基于免疫捕获和LC-MS的方法制定了一种有效、灵敏的ADA识别和量化方法。

除非另有说明，否则本发明所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域普通技术人员公知的相同含义。虽然在实践或测试中可使用与本发明所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现在仅描述特定方法和材料。本发明提及的所有出版物通过本发明的引用，成为本发明的一部分。

术语“一个(a)”应理解为“至少一个”；术语“大约(about)”和“大约(approximately)”应理解为允许本领域普通技术人员理解的标准偏差；只要提供了范围，即包含端点。

在本发明中，术语“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”是非限制性的，并分别理解为“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”。

在某些示例性实施例中，本发明提供了一种识别和/或量化样本中至少一种肽或蛋白的方法，包括：使所述样本与固相载体接触，其中，在固相载体上已附着至少一种药品；使用至少一种流动相溶液清洗所述固相载体，获得至少一种洗脱液；从洗脱液中分离出至少一种肽或蛋白；用变性溶液和/或酶消化反应处理分离肽或蛋白质，形成分离肽或蛋白的成分；使用质谱仪识别所述分离肽或蛋白的这些成分。

在本发明中，术语“肽”或“蛋白”包括任何共价连接的酰胺键的氨基酸聚合物。蛋白包含一种或多种氨基酸聚合物链，在本领域通常称为“肽(peptide)”或“多肽(polypeptide)”。蛋白可包含一种或多种多肽，从而形成单一功能的生物分子。在某些示例性实施例中，所述蛋白可以是抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、宿主细胞蛋白或其组合。

在本发明中，至少一种“药品”包括完全或部分具有生物性质或具有药物活性的活性成分。在某些示例性实施例中，所述药品可包括药物、肽、蛋白、融合蛋白、抗体、抗体片段、抗体Fab区、抗体-药物偶联物、抗体Fc区、酶产物、细胞因子、生长因子、蛋白药品、毒素、核酸、DNA、RNA、化合物、细胞、组织或能够诱导受试者中抗体的任何药物成分。

在本发明中，“变性溶液”包括碱性溶液、酸性溶液或含有尿素、盐酸胍、氧化剂、还原剂或有机溶剂的溶液。

在某些示例性实施例中，本发明所述的药品可以是一种药物、化合物、核酸、毒素、肽、蛋白、融合蛋白、抗体、抗体片段、抗体Fab区、抗体-药物偶联物或蛋白药品。

在本发明中，“蛋白药品”包括完全或部分具有生物性质的活性成分。在某些示例性实施例中，蛋白药品可包括肽、蛋白、融合蛋白、抗体、抗原、疫苗、肽-药物偶联物、抗体-药物偶联物、蛋白-药物偶联物、细胞、组织或其组合。在其他示例性实施例中，蛋白药品可包括肽、蛋白、融合蛋白、抗体、抗原、疫苗、肽-药物偶联物、抗体-药物偶联物、蛋白-药物偶联物、细胞、组织或其组合的重组、改造、修饰、突变或截短版本。

在本发明中，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的示例包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fc片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双特异抗体、dAb片段、Fd’片段、Fd片段和独立互补性决定区(CDR)，以及三特异性抗体、四特异性抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链可变区的组合，ScFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接基团连接。可通过不同方法产生抗体片段。例如，可通过完整抗体的片段化以酶促或化学方式产生抗体片段，和/或可由编码部分抗体序列的基因重组产生抗体片段。可替代地或另外，可完全或部分合成产生抗体片段。抗体片段可选包含单链抗体片段。可替代地或另外，抗体片段可包含多个例如通过二硫键连接在一起的链。抗体片段可选包含多分子配合物。

在本发明中，术语“抗体-药物偶联物”或“ADC”是指通过具有不稳定键的连接基团连接到生物活性药物上的抗体。ADC可包含多个生物活性药物分子(或有效载荷)，这些分子可以共价连接到抗体氨基酸残基的侧链上(Siler Panowski等人，用于癌症治疗的位点特异性抗体药物偶联物，6mAbs 34–45(2013))。用于ADC的抗体能够以足够的亲和力结合，在靶位点选择性积累并持久保留。大多数ADC的Kd值都在纳米摩尔范围内。有效载荷的效力可在纳米摩尔/皮摩尔范围内，并且可在ADC分布到靶组织后达到可实现的细胞内浓度。最后，在有效载荷和抗体之间形成连接的连接基团能够在循环中保持充分稳定，以利用抗体部分的药代动力学特性(如长半衰期)，并允许有效载荷在分布到组织上时附着在抗体上，并且在ADC被吸收到靶细胞后，允许有效释放生物活性药物。连接基团可包括在细胞加工中不可裂解的连接基团以及ADC到达靶位点后就可以裂解的连接基团。对于不可裂解的连接基团，在细胞内释放的生物活性药物包括有效载荷和仍然附着在抗体氨基酸残基上的连接基团的所有构件(一般为赖氨酸或半胱氨酸残基)，随后ADC在溶酶体内经过完全蛋白质降解。可裂解连接基团是指在有效载荷和抗体上胺基酸连接位点之间存在裂解位点的连接基团。裂解机制可包括酸性细胞内区室中酸不稳定键的水解、通过细胞内蛋白酶或酯酶对酰胺键或酯键进行酶裂解、通过细胞内还原环境对二硫键进行还原裂解。

在某些方面，本发明的样本中至少一种肽或蛋白可以是抗体，所述抗体可选择性与附着在固相载体上的药品结合。

在本发明中，“抗体”是指由四条多肽链、两条重链(H)和两条轻链(L)组成的免疫球蛋白分子。每个重链具有一个重链可变区(HCVR或VH)和一个重链恒定区。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每个轻链具有一个轻链可变区和一个轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH和VL区域可进一步细分为称为互补性决定区(CDR)的高可变性区，以及散布的称为框架区(FR)的更保守区域。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端的排列顺序如下；FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包括但不限于通过重组方法制备、表达、创造或分离的抗体，如从转染后表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。IgG包括一个亚群的抗体。

在某些方面，本发明所述方法和***可用于识别或量化样本中至少一种肽或蛋白，所述方法进一步包括以下步骤：对分离肽或蛋白进行肽图分析，选择分离肽或蛋白的唯一肽和碎片离子产生MRM(多反应监测)跃迁，选择唯一肽的前两种或前三种跃迁，优化唯一肽的碰撞能量，然后生成一个校准曲线，以及根据校准曲线确定LLOQ(定量下限)。

在本发明中，“肽图分析”是指一种确定蛋白一级结构的技术，例如氨基酸序列。肽图分析可用于识别、一级结构表征和质量保证/质量控制(QA/QC)。可将未知相关蛋白先裂解成更小的肽，可用质谱仪准确测量其绝对质量，例如，将液相色谱与串联质谱(LC-MS/MS)的肽图平台连接，确认蛋白的一级结构。

在某些方面，本发明所述方法或***中的质谱仪可以是电喷雾电离质谱仪、纳升电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪，其中，所述质谱仪可与液相色谱***连接，其中，所述质谱仪能够进行LC-MS(液相色谱-质谱法)或LC-MRM-MS(液相色谱-多反应监测-质谱法)分析。

在本发明中，“质谱仪”包括一种能够识别特异性分子种类并测量其准确质量的装置。此术语旨在包括任何分子检测器，其中，可对多肽或肽进行洗脱，从而进行检测和/或表征。质谱仪可包括三大部分：离子源、质量分析器和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或团簇可转移到气相中，同时(与电喷雾电离一样)进行电离。离子源的选择主要取决于具体应用情况。

在本发明中，术语液相“色谱法”是指一种工艺，其中，由于化学实体的分布不同，当它们在稳定液相或固相周围或上方流动时，液体或气体所携带的化学混合物可分成各组分。色谱法的非限制性示例包括传统的反相色谱法(RP)、离子交换色谱法(IEX)、混合模式色谱法和正相色谱法(NP)。

在本发明中，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指喷雾电离工艺，其中溶液中的阳离子或阴离子通过在大气压下形成和去溶高电荷液滴流而转移到气相，而高电荷液滴流是在含有溶液的电喷雾针尖和对电极之间施加电位差产生的。采用溶液中的电解离子产生气相离子一般有三个主要步骤，包括：(a)在ES输注尖端产生带电液滴；(b)带电液滴通过溶剂蒸发和反复的液滴分解而收缩，形成能产生气相离子的高电荷小液滴；(c)从非常小的高电荷液滴产生气相离子的机制。通常在仪器的大气压力区进行阶段(a)-(c)。在某些示例性实施例中，所述电喷雾电离质谱仪可以是纳升电喷雾电离质谱仪。

在本发明中，术语“三重四极杆质谱仪”是指一个由两个串联四极杆质量分析器组成的串联质谱仪，其中，它们之间的(非质量解析)射频(RF)四极杆对细胞作用进行碰撞诱导解离。在三重四极杆质谱仪中，将肽样本注射到与MS仪器连接的LC中。第一个四极杆可用作质量过滤器，用于分离具有靶向m/z的肽。第二个四极杆用作将肽分解成片段的碰撞池。第三个四极杆可以用作第二个质量过滤器，用于过滤来自初始亲本肽的特定m/z片段。在本发明中，术语“串联质谱法"包括一种可采用多个阶段的质量选择和质量分离获得样本分子结构信息的技术。一个先决条件是可将样本分子转移到气相中，并完好无损地电离，并且可在第一个质量选择步骤后以某种可预测和可控的方式将其诱导分离。只要可获得有意义的信息或碎片离子信号可检测，即可通过以下步骤执行多级MS/MS或MSⁿ：首先选择并分离前体离子(MS²)，使其裂解，分离主要碎片离子(MS³)，使其裂解，分离二级碎片(MS⁴)。已使用各种分析器组合成功执行串联MS。将何种分析器组合用于某种应用可由多个不同的因素决定，如灵敏度、选择性和速度，以及尺寸、成本和可用性。两大类的串联MS法为空间串联和时间串联，但也可混合使用，即时间串联分析器在空间上连接或与空间串联分析器连接。空间串联质谱仪包括一个离子源、一个前体离子激活装置以及至少两个非捕获质量分析器。可设计特定的m/z分离功能，以便在仪器的一个部分中选择离子，在中间区解离，然后将产物离子传输到另一个分析器进行m/z分离和数据采集。在时间串联质谱仪中，可在相同的物理装置中对离子源中产生的离子进行捕获、分离、裂解和m/z分离。

质谱仪识别的肽可用作完整蛋白及其翻译后修饰的替代代表。将实验和理论MS/MS数据(后者由蛋白序列数据库中的可能肽产生)相互关联，可用于蛋白表征。所述表征包括但不限于蛋白片段的氨基酸测序、确定蛋白测序、确定蛋白从头测序、定位翻译后修饰、识别翻译后修饰、可比性分析或其组合。

在某些示例性实施例中，确定了所述分离肽或蛋白的同种型或亚类。

在本发明中，术语“同种型”或“亚类”是指不同同种型的免疫球蛋白。免疫球蛋白是由两条重链和两条轻链组成的异源二聚体蛋白。免疫球蛋白具有结合抗原的可变结构域和规定效应子功能的恒定结构域。重链的Fc部分定义了抗体的分类，其中，哺乳动物分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。这些分类在其生物学特性(又称效应子功能)和功能定位方面有所不同，确保对给定抗原的适当免疫反应。重链恒定结构域主要有五类。每类定义了IgM、IgG、IgA、IgD和IgE的同种型。IgG可分为四个亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgA可分为IgAl和IgA2。当抗体为人类抗体时，人类抗体的同种型可以为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgM或IgE。当抗体为猕猴抗体时，猕猴抗体的同种型可以为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM,或IgA。

示例性实施例

本发明所述实施例提供了使用免疫捕捉和质谱方法对同种型和亚类抗体进行识别和量化的组合物、方法和***。

在某些示例性实施例中，本发明提供了一种识别和/或量化样本中至少一种肽或蛋白的方法，包括：使所述样本与固相载体接触，其中，在固相载体上已附着至少一种药品；使用至少一种流动相溶液清洗所述固相载体，获得至少一种洗脱液；从洗脱液中分离出至少一种肽或蛋白；用变性溶液和/或酶消化反应处理分离的肽或蛋白质，形成分离肽或蛋白的成分；使用质谱仪识别所述分离肽或蛋白的这些成分。

在某些方面，本发明所述方法或***中的样本可在接触固相载体之前，经过酸性溶液处理达到约0.1-4.5的pH值范围。在某些示例性实施例中，所述酸性溶液的pH值范围约为3.6、0.1-3.6、1.0-4.0、2.0-4.0、3.0-4.0、1.5-4、2.5-4或3.5-4。在某些方面，所述酸性溶液包括乙酸、磷酸、硼酸、柠檬酸、碳酸、盐酸、硝酸、硫酸、氢氟酸或草酸。

在其他方面，本发明所述方法或***中的样本可与固相载体在室温(环境温度)下培养约1小时、约5-60分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约0.5-6小时、约0.5-1.5小时、约1.5小时、约2小时、约3小时、约6小时、约12小时或隔夜。在某些示例性实施例中，本发明所述方法或***中的样本可以与固相载体在4-30℃下培养约1小时、约5-60分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约0.5-6小时、约0.5-1.5小时、约1.5小时、约2小时、约3小时、约6小时、约12小时或隔夜。在某些示例性实施例中，本发明所述方法或***中的样本可以与固相载体在4℃下培养约1小时、约5-60分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约0.5-6小时、约0.5-1.5小时、约1.5小时、约2小时、约3小时、约6小时、约12小时或隔夜。

在某些方面，本发明所述方法或***中的固相载体可以是微珠、磁珠、色谱树脂、聚合物或色谱基质。

在其他方面，本发明所述方法或***中的样本进一步包含盐和表面活性剂。在其他方面，本发明所述方法或***中的样本进一步包含BSA(牛血清白蛋白)、HEPES(4-(2-羟乙基)-l-羟乙基哌嗪乙磺酸)、氯化钠、EDTA(乙二胺四乙酸)和Tween-20(聚山梨醇酯20)，其中，所述样本的pH值范围约为6-9。

在某些方面，本发明所述方法或***中的固相载体可使用包含盐或表面活性剂的至少一种流动相溶液和至少另一种pH值范围在0.1到4.5之间的后续流动相溶液清洗。在其他方面，本发明所述方法或***中至少一种流动相溶液包含BSA(牛血清白蛋白)、HEPES(4-(2-羟乙基)-l-羟乙基哌嗪乙磺酸)、氯化钠、EDTA(乙二胺四乙酸)和Tween-20(聚山梨醇酯20)，并且pH值范围约为6-9。

在某些示例性实施例中，本发明所述方法或***中的变性溶液包含约8M、约5-10M、约7-9M、约6-9M或约3-10M的尿素。在某些方面，所述变性溶液可以是碱性溶液或酸性溶液。在其他方面，所述变性溶液包括尿素、盐酸胍、氧化剂、还原剂或有机溶剂。

在某些示例性实施例中，本发明所述方法或***中分离肽或蛋白的成分至少约为0.01ng、0.1ng、0.2ng，或至少约为0.3ng、0.01-1.0ng、0.2-0.4ng、0.2-0.5ng或0.2-0.6ng。

在某些示例性实施例中，本发明提供了一种识别或量化样本中至少一种肽或蛋白的***，其中包括：一种固相载体，其中，在所述固相载体上已附着一种药品；至少一种流动相溶液，用于清洗固相载体并能够提供用于分离至少一种肽或蛋白的至少一种洗脱液(包含至少一种肽或蛋白)；一种变性溶液和/或酶消化溶液，能够形成分离肽或蛋白的成分；以及一个质谱仪，能够识别或量化分离肽或蛋白的成分。在某些示例性实施例中，所述***中的质谱仪能够进行LC-MS(液相色谱-质谱法)或LC-MRM-MS(液相色谱-多反应监测-质谱法)分析。在某些示例性实施例中，所述***能够：进行肽图分析，选择唯一肽和碎片离子产生MRM(多反应监测)跃迁，选择前两种或前三种跃迁，优化碰撞能量，然后生成一个校准曲线，以及根据校准曲线确定LLOQ(定量下限)。

在某些方面，LLOQ包括检测限(LOD)或定量限(LOQ)。在其他方面，识别或量化样本中肽或蛋白的LOD约为40ng/mL、10-80ng/mL、20-50ng/mL、30-60ng/mL或35-45ng/mL。在其他方面，识别或量化样本中肽或蛋白的LOQ约为120ng/mL、80-160ng/mL、100-140ng/mL或110-130ng/mL。

应理解的是，所述***不限于上述任何药品、肽、蛋白、抗体、抗体抗体、抗原-抗体复合物、蛋白药品、色谱柱或质谱仪。

本发明所述方法步骤的连续标记与数字和/或字母并不意味着将所述方法或任何实施例限制为特定显示顺序。

本说明书引用了各种出版物，包括专利、专利申请、已发表的专利申请、登录号、技术文献和学术文献。这些参考文献通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。

参考以下示例可更充分了解本发明，提供这些示例是为了更详细地描述本发明。这些示例旨在对本发明进行说明，不应视为限制本发明的范围。

示例

材料和试剂制备

1.1抗体药物捕捉ADA。使用数种抗体药物捕捉人类或猕猴血清样本中的ADA，如表1所示。

表1.捕捉ADA的抗体药物

2.1.将抗体药物与磁珠偶联。使用两种偶联方法将抗体药物合并到固相载体上，例如磁珠。在第一种方法中，使用生物素化试剂盒(例如，EZ-Link SulfoN-HS-LC生物素化试剂盒)对抗体药物进行生物素化。(Chen等人，为同步ADA分型和半定量制定免疫捕捉-LC/MS分析，免疫学研究杂志，2016卷，文章ID 7682472，14页；Roos等人，使用免疫捕捉-LC/MS检测食蟹猴抗蛋白XYZ抗体，应用生物分析杂志，2016年10月，第2卷第4期，第117页-第128页)生物素化药物随后与链霉亲和素包被的磁珠结合。在第二种方法中，使用一级胺-环氧反应通过药物的赖氨酸残基使抗体药物与磁珠直接交联。使用生物素化药物或交联药物捕捉和分离人类或猕猴血清样本中的ADA。使用磁体移除血清样本中的磁珠。

3.1ADA阳性对照。使用猕猴IgG1单克隆抗人κ轻链抗体作为ADA阳性对照(例如，ADA-Std)，以便为ADA分型和量化制定免疫捕捉和LC-MS分析。ADA-Std可与人IgG结合。

用于肽识别和量化的仪器。用于肽识别或量化的质谱仪为电喷雾电离质谱仪或纳升电喷雾电离质谱仪。所述质谱仪连接到液相色谱***。所述质谱仪能够进行LC-MS(液相色谱-质谱法)或LC-MRM-MS(液相色谱-多反应监测-质谱法)分析。在某些示例性实施例中，所述质谱仪为三重四极杆质谱仪。

示例1选择唯一替代肽识别和量化ADA同种型

考虑到检测的灵敏度，通过LC-MS识别和量化ADA的同种型是根据ADA的唯一替代肽，而不是其整个分子。每个ADA在胰蛋白酶消化后产生肽组合。每个ADA仅针对几个代表性肽来推断ADA的存在并确定同种型的量化。(V.Lange，P.Picotti，B.Domon和R.Aebersold，定量蛋白组学的选择反应监测：教程-分子***生物学，第4卷，文章222，2008年)

通过识别每个抗体同种型特有的适当肽，定量测量依赖于ADA与其替代肽之间存在的定量关系。为了为每个抗体同种型选择合适的替代肽,每个同种型的替代肽应来自抗体的恒定区。虽然相同同种型的ADA在可变区有不同的氨基酸序列形式，但它们具有相同的恒定区。此外，选择的替代肽对每个ADA同种型都是唯一的，在任何其他同种型中不应存在。(Chen等人，为同步ADA分型和半定量制定免疫捕捉-LC/MS分析，免疫学研究杂志，2016卷，文章ID 7682472，14页)此外，替代肽不用包含ADA同种异型多态残基的氨基酸(M.-P.Lefranc和G.Lefranc，人类Gm、Km和Am同种异型及其分子特征：多态性的显着证明，分子生物学方法，第882卷，第635页-第680页，2012年)。由于许多同种型共享同一轻链(κ和λ)，在选择替代肽时排除轻链。

关于替代肽的选择有几个考虑因素。避免使用具有氧化倾向的含蛋氨酸的肽。避免含有精氨酸-精氨酸(RR)和赖氨酸-赖氨酸(KK)的肽序列，它们会产生不一致的胰蛋白酶消化。含有精氨酸-脯氨酸(RP)和赖氨酸-脯氨酸(KP)的肽序列非可取选项，因为它们难以通过消化分解。优选肽长度在6-20个氨基酸之间，以最大限度地减少电离电荷态的数量，实现有效的MS/MS裂解和高灵敏度，并获得理想的色谱保留。还要避免含有糖基化位点的肽序列。(S.T.Wu，Z.Ouyang，T.V.Olah和M.Jemal，聚乙二醇蛋白药物的液相色谱/串联质谱定量策略-在血浆中使用水溶性有机溶剂沉淀的血浆蛋白后进行胰蛋白酶消化以生成用于检测的替代肽，质谱学快报，第25卷第2期，第281页-第290页，2011年)

为了识别每个抗体同种型的替代肽，对IgG亚类进行了氨基酸序列比对。这些序列经过计算机模拟胰蛋白酶消化的预测，识别唯一肽。

免疫球蛋白溶液经过酶消化，产生的胰蛋白酶肽通过LC-MS使用信息依赖采集(IDA)方法进行分析和筛选。IDA设置包括基于计算机模拟预测对胰蛋白酶肽形成进行MRM测量，然后通过增强的产物离子扫描来确认肽特性。通过色谱法实现肽分离。进一步评估具有良好LC-MS灵敏度的胰蛋白酶肽。通过解释每个抗体同种型中的计算机模拟胰蛋白酶肽，识别特定肽。选择每个ADA同种型前1-3个最灵敏的肽作为唯一肽候选，并进行进一步的方法制定。在MS/MS中的碰撞活化后，多个带电母离子***成单个带电b离子和y离子，选择最敏感的y离子。

选择特定的产物离子作为替代肽。图1显示了从猕猴IgG1替代肽中选择产物离子。图2和表2显示了从猕猴IgG1替代肽中选择的前两种跃迁和碰撞能量的优化。图2A显示了产物离子的峰面积。图2B显示了选择的碰撞能量。

表2.猕猴IgG1替代肽的前两种跃迁与产物离子和碰撞能量

对于人类抗体，用于识别抗体同种型的唯一替代肽的氨基酸序列：IgG1为GPSVFPLAPSSK、IgG2为GLPAPIEK、IgG3为WYVDGVEVHNAK、IgG4为GLPSSIEK、IgAl为DASGVTFTWTPSSGK、IgA2为DASGATFTWTPSSGK、IgM为VSVFVPPR或IgE为DFTPPTVK。对于猕猴抗体，用于识别抗体同种型的唯一替代肽的氨基酸序列：IgG1为GPSVFPLAPSSR、IgG2为GPSVFPLASCSR、IgG3为GPSVFPLVSCSR、IgG4为GPSVFPLASSSR、IgM为QIEVSWLR或IgA为DPSGATFTWTPSSGK。

示例2制定LC-MRM-MS方法，识别和量化ADA同种型

制定了基于LC-MS的MRM(多反应监测)方法(例如，LC-MRM-MS方法)进行ADA的分型和量化，包括为猕猴或人类抗体的每个同种型或亚类选择唯一替代肽、在三重四极杆质谱仪上制定MRM方法以及确定仪器检测限。

成功制定了识别和量化人类或猕猴ADA同种型的LC-MRM-MS方法。用LC-MS进行肽筛选后，为MRM定量选择定量肽和确认肽。为每个完整ADA的量化选择定量肽。选择同一ADA中不同位置的其他肽(例如，确认肽)来确认定量肽的数据准确性和样本蛋白一级结构的完整性。报告了基于定量肽的衍生数据用于ADA同种型的量化。基于确认肽的衍生数据用于评估定量肽和确认肽之间的数据一致性。根据产物离子光谱(选择了最突出的产物离子)确定每个肽的MRM离子跃迁。通过采用每个MS参数的不同值分析胰蛋白酶肽来优化MS参数(气体流速、温度、电喷雾电压、去簇电压、碰撞能量和碰撞室出口电压)。(Jiang等人，在免疫原性分析研究中创新使用LC-MS/MS同步定量中和抗体、残留药物和人免疫球蛋白G，分析化学，2014年，86，第2673页-第2680页)

为每个抗体同种型/亚类识别一个定量肽和一到两个确认肽。选择了四十种人类ADA跃迁，三十种猕猴ADA跃迁。表3、表4和表5显示了用于猕猴ADA分型的LC-MRM-MS方法的优化，包括每个抗体同种型的唯一替代肽和确认肽的氨基酸序列、前体离子、产物离子、碰撞能量和随时间的监测。

表3.分型猕猴ADA优化LC-MRM-MS方法的唯一肽列表。

表4.分型猕猴ADA优化LC-MRM-MS方法的确认肽列表。

表5.猕猴ADA分型中不同时间点的多反应监测。

表6和7显示了用于人类ADA分型的LC-MRM-MS方法的优化，包括每个抗体同种型的唯一替代肽的氨基酸序列、前体离子、产物离子、碰撞能量和随时间的监测。

表6.分型人类ADA优化LC-MRM-MS方法的唯一肽列表。

同种型	唯一肽(人类)	前体离子	产物离子	碰撞能量
					IgG1	GPSVFPLAPSSK	593.8270	699.4036	22.4
IgG2	GLPAPIEK	412.7475	654.3821	13.8
					IgG3	WYVDGVEVHNAK	472.9017	697.3628	18.2
IgG4	GLPSSIEK	415.7345	660.3563	13.9
					IgAl	DASGVTFTWTPSSGK	770.8675	475.2511	27.9
IgA2	DASGATFTWTPSSGK	756.8519	863.4258	21.5
					IgM	VSVFVPPR	450.7687	615.3613	15.0
IgE	DFTPPTVK	452.7424	541.3344	15.0

表7.人类ADA分型中不同时间点的多反应监测。

示例3确定仪器检测限

使用三重四极杆LC-MS确定仪器检测限，例如，安捷伦科技公司的6495C三重四极杆LC/MS。在BSA(牛血清白蛋白)基质中稀释猕猴IgG、IgM,或IgA。对不同量的免疫球蛋白肽进行了测试，包括0.3ng、0.9ng、3ng、9ng、30ng、90ng和300ng。图3显示了猕猴IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM和IgA的线性度和仪器检测限的测试结果。可在15分钟内优化LC方法。确认肽的结果与其相应替代肽的一致性良好，表明使用LC-MRM-MS方法可获得准确的定量以及在样本储存和处理过程中蛋白一级结构保持良好的完整性。制定的LC-MRM-MS方法能够在三重四极杆LC-MS(例如，安捷伦科技公司的6495C三重四极杆LC/MS)上对每个ADA同种型检测低至0.3ng的定量肽。

示例4使用抗体药物对ADA进行免疫捕捉

使用抗体药物制定两种从血清样本中分离ADA的免疫捕捉方法，其中，ADA能与抗体药物特异性结合。在第一种方法中，抗体药物经过生物素化。使用与链霉亲和素包被的磁珠结合的生物素化抗体药物捕捉人类或猕猴血清样本中的ADA。在第二种方法中，使用一级胺-环氧反应通过药物的赖氨酸残基使抗体药物与磁珠直接交联。

使用药物微珠(例如，生物素化药物微珠或交联药物微珠)在培养步骤中从人类或猕猴血样样本中捕捉ADA，其中，在培养缓冲液中用含ADA的血清样本培养药物微珠以捕获ADA。随后用磁体分离磁珠。再用清洗液清洗分离的磁珠。然后，将分离的微珠放在洗脱液中，将ADA从药物微珠中分离出来。

将猕猴IgG1单克隆抗人κ轻链抗体ADA-Std用作优化ADA免疫捕捉的ADA阳性对照。在猕猴血清中稀释ADA-Std，模拟含有ADA的血清样本。但是，为了制定针对从猕猴血清样本中捕捉ADA的MS方法，使用小鼠血清稀释ADA-Std，从而降低非特异性相互作用。

对使用生物素化药物微珠和交联药物微珠的ADA回收率进行了比较。令人意想不到的是，使用交联药物微珠从血清样本中捕捉ADA的回收率高达83-98％左右。相反，使用生物素化药物微珠从血清样本中捕捉ADA的回收率仅为52-54％左右。在这些实验中，将图4中显示为输入的ADA-Std作为比较的阳性对照。如图4所示，使用交联药物A微珠时，ADA的回收率为98％。使用交联药物B微珠时，ADA的回收率为83％。但是，使用生物素化药物A微珠时，ADA的回收率为52％。使用生物素化药物B微珠时，ADA的回收率为54％。因此，使用交联药物微珠从血清样本中捕获ADA可以实现较高的ADA回收率，这是一个意想不到的优势。

示例5优化酶消化方法

优化酶消化方法，从而提高ADA识别和量化的线性度和一致性。对通过免疫捕捉方法从血清样本中分离的ADA进行干燥，例如，使用SpeedVac干燥。将干燥的ADA在悬浮液中溶解，然后进行酶消化(例如，胰蛋白酶消化)，以使用LC-MS进行量化。使用不同的悬浮液优化酶消化方法，包括使用变性溶液，例如，8M尿毒溶液。

如图5所示，使用变性溶液悬浮分离的ADA进行酶消化可明显提高ADA识别和量化的一致性和线性度，这是一个意想不到的优势。采用纯化ADA-Std作为这些实验的阳性对照。将干燥的ADA-Std直接溶解在悬浮液中，然后进行酶消化，而无需进行免疫捕捉步骤。在图5中，ADA-Std显示为输入。图5A显示了使用药物A捕捉ADA，而无需使用变性溶液来溶解干燥的ADA。图5B显示了存在变性溶液(溶解干燥ADA)时使用药物A或药物B捕捉ADA。如图5B所示，在酶消化前先用变性溶液溶解干燥的ADA，使用药物A或药物B捕捉ADA时，ADA捕捉定量显示出一致性和线性度明显提高。如图5A所示，当不使用变性溶液时，并未观察到一致性和线性度。

示例6观察非特异性相互作用

为了提高ADA免疫捕捉的灵敏度和线性度，以便使用LC-MS进行分型和量化，设计了实验来观察血清中的非特异性相互作用。使用猕猴IgG1单克隆抗人κ轻链抗体(例如，ADA-Std)作为ADA阳性对照，制定和优化用于ADA分型和量化的免疫捕捉和LC-MS分析。在小鼠血清中稀释ADA-Std，测试范围为1.5ng/ml至10μg/ml，三倍稀释。在猕猴血清中稀释ADA-Std，模拟含有ADA的血清样本。ADA-Std经过酶消化和LC-MS分析，而无需进行免疫捕获步骤。

免疫捕捉方法中使用药物A或药物B从猕猴血清样本中分离ADA。在小鼠或猕猴血清中稀释分离的ADA，然后进行酶消化和LC-MS分析。如图6所示，添加猕猴血清会引起非特异性相互作用和较高背景噪声，降低定量化的一致性和线性度。测试结果表明小鼠血清中的线性度良好。

在猕猴血清中稀释ADA-Std，模拟含有ADA的血清样本。检测IgG1信号可以是ADA-Std信号和猕猴血清中内源性IgG1的组合。相比之下，检测到的任何其他抗体同种型可以是猕猴血清非特异性结合产生的内源性抗体。

示例7优化免疫捕捉的培养条件

由于猕猴血清中的某些成分可能会引起非特异性相互作用，从而导致较高背景噪声，因此对免疫捕捉方法进一步优化，提高使用LC-MS分析对ADA进行分型和量化的灵敏度和一致性。在不同培养条件下培养用于捕捉ADA的药物与含有ADA的猕猴血清样本，包括在室温下培养1小时或在4℃下隔夜培养。令人惊讶的是，在室温下培养1小时可明显降低背景噪声。在室温下培养1小时，背景噪声低，一致性和线性度得到改善，因此增强了LC-MS分析中ADA的信号。

如图7A所示，当药物B或药物C与猕猴血清样本在4℃下隔夜培养时，ADA-IgG1的定量缺少线性度和一致性。如图7B所示，当药物B或药物C与猕猴血清样本在室温下培养1小时时，ADA-IgG1的定量显示出线性度和一致性良好。在这些实验中，ADA-Std用作阳性对照，并在图7中表示为ADA输入。图8显示了使用IgG2作为噪声指示剂优化免疫捕捉的培养条件。如图8所示，使用药物B或药物C从猕猴血清样本中捕捉ADA，与4℃下隔夜培养相比，在室温下培养1小时为IgG2分型和量化提供了较少的噪声。

示例8通过中断血清中的相互作用来优化免疫捕捉

血清成分中存在不同的特异性或非特异性相互作用，例如，抗原和抗体结合或蛋白聚集。为了降低较高的背景噪声，进一步优化免疫捕捉方法，从而降低血清中的非特异性或特异性相互作用。令人意外的是，在血清样本中添加酸性溶液后进行免疫捕捉可明显降低使用LC-MC分析对分离ADA进行识别和分型的背景噪声。

通常，血清样本的pH值范围大约为pH 8.0。在血清样本中添加酸性溶液(例如300mM乙酸)实现酸性pH值范围，以便在血清成分之间进行酸解离，例如大约pH 3.6。然后将酸性血清样本的pH值调整至pH 4.5左右，以便使用药物微珠进行免疫捕捉，如通过添加HBST缓冲液调整pH值，例如，10mM HEPES(4-(2-羟乙基)-l-羟乙基哌嗪乙磺酸)、150mM氯化钠、3mM EDTA(乙二胺四乙酸)和0.2％Tween-20(聚山梨醇酯20)，pH 7.4。

血清样本的酸解离处理在明显降低背景噪声方面提供了意想不到的优势。使用两种酸性条件1和2进一步优化酸解离。酸性条件1方法包括将1μl的5M乙酸加入49μL的猕猴血清样本中，使乙酸的最终浓度为300mM并培养1小时。酸性条件2方法包括将50μl的600M乙酸加入50μL的猕猴血清样本中，使乙酸的最终浓度为300mM并培养1小时。

如图9所示，使用药物A或药物B捕捉ADA。与酸性条件1相比，酸性条件2在IgG2、IgG3和IgA的ADA分型和量化方面明显降低了背景噪声。酸性条件2是使用药物A或B进行酸解离以便对ADA的同种型IgG2、IgG3和IgA进行免疫捕捉的优选条件。但是，两种酸性条件1和2在IgG4的分型和量化方面没有明显降低背景噪声。这表明需要进一步优化以降低IgG4分型和识别的高背景噪声。结果还表明血清中的非特异性相互作用对IgG4分型和量化的高背景噪声没有明显影响。

示例9使用IgG药物的Fab进行免疫捕捉

9.1.分型和量化ADA的IgG4同种型。使用仅包含IgG Fab部分的抗体药物捕捉ADA，研究血清中的非特异性相互作用，优化免疫捕捉方法。如表1所列，药物A-E包含整个IgG分子，而药物F-J仅包含IgG分子的Fab部分。如图10所示，仅包含Fab的药物能消除血清IgG4与IgG4药物Fc区的相互作用。对于IgG1，完整的抗体和仅包含Fab的抗体的非特异性结合较低。使用IgG药物的Fab部分捕捉ADA明显降低IgG4 ADA分型和识别的背景噪声。特别是，使用药物A、药物B和药物C相比，当使用药物F、药物G和药物H对ADA进行免疫捕捉以便对IgG4ADA进行分型和量化时，背景噪声明显降低。

药物A、药物B和药物C包括IgG4的完整分子。药物F、药物G和药物H只包括IgG4的Fab部分。测试结果表明，猕猴血清样本中的内源性IgG4抗体可能是造成较高背景噪声的重要原因。猕猴血清样本中的内源性IgG4抗体可能与药物A、药物B和药物C的Fc区相互作用，因为这些药物包括IgG4的整个分子。猕猴血清样本中的内源性IgG4抗体可能与IgG4药物(例如，IgG4中的L445残基)的Fc区相互作用。因此，在使用药物F、药物G和药物H时，背景噪声降低或消除，因为这些药物仅包含IgG4的Fab区，不包含Fc区。根据药物D和药物E的测试结果，猕猴血清样本中的内源性IgG4抗体不能与IgG1药物的Fc区相互作用。

9.2.分型和量化ADA的IgM同种型。

使用仅包含IgG分子Fab部分的抗体药物捕捉ADA，研究血清中的非特异性相互作用，优化免疫捕捉方法。如表1所列，药物A-E包含整个IgG分子，药物F-J仅包含IgG分子的Fab部分。如图11所示，使用IgG药物的Fab部分捕捉ADA不能明显降低IgM ADA分型和识别的背景噪声。结果表明，血清IgM和药物Fab区之间的相互作用会导致较高IgM背景噪声。特别是，使用药物A、药物B、药物C、药物D和药物E相比，当使用药物F、药物G、药物H、药物I和药物J对ADA进行免疫捕捉以便对IgM进行分型和量化时，背景噪声较高。

药物A、药物B、药物C、药物D和药物E包含IgG(例如，IgG1或IgG4)的整个分子。药物F、药物G、药物H、药物I和药物J仅包含IgG分子的Fab部分。测试结果表明，猕猴血清样本中的内源性IgM抗体可能通过与IgG1药物和IgG4药物的Fab部分结果导致较高背景噪声。这表明需要进一步优化以降低IgM分型和识别的高背景噪声。

示例10确定定量下限(LLOQ)

10.1.优选免疫捕捉和酶消化方法

使用优选免疫捕捉和酶法根据ADA浓度确定肽量化的定量下限(LLOQ)。用于生成LLOQ校准曲线的优选免疫捕捉和酶消化方法包括用酸性溶液处理含ADA的血清样本使血清中的成分酸解离，然后将血清样本与直接交联到微珠上的药物一起培养进行ADA的免疫捕捉，分离微珠，用清洗溶液清洗分离的微珠，随后用洗脱液从微珠中分离ADA，对分离的ADA进行酶消化，从而产生肽组合。对肽组合进行LC-MS分析以便对ADA进行分型和量化。图12举例说明了优选免疫捕捉和酶法。

例如，将50μL的600mM乙酸添加到50μL的血清样本中，并在室温下培养1小时，进行酸解离。然后，将药物微珠与血清样本在室温下培养1小时。例如，将40μL的50μg/mL交联药物添加到血清样本中，在400μL 3％BSA(牛血清白蛋白)的HBST缓冲液中稀释血清样本。然后分离微珠。用至少一种0.5mL的清洗液清洗分离的微珠，例如，HBST缓冲液和/或3％BSA的HBST缓冲液。然后，用洗脱液将ADA与微珠分离。例如，用200μL洗脱溶液(例如，0.1％甲酸/50％乙腈)来洗脱微珠上的ADA。使用SpeedVac等方式干燥分离的ADA。将干燥的ADA悬浮在8M尿素等变性溶液中。然后，对分离的ADA进行酶消化(例如，胰蛋白酶消化)和LC-MS分析以便对ADA进行分型和量化。

10.2.生成校准曲线

使用上述优选免疫捕捉和酶消化方法获得的ADA肽生成用于ADA同种型检测和量化的校准曲线。ADA-Std用作阳性对照，在猕猴血清中稀释后用于检测和量化。如图13所示，ADA的测试范围为1.5ng/mL至10μg/mL，三倍稀释。药物A或药物B用于ADA的免疫捕捉。在LLOQ样本中观察到充分的色谱响应(信噪比)，在相应的保留时间内没有出现干扰峰。当药物A或药物B用于ADA的免疫捕捉时，检测限(LOD)确定为40ng/ml ADA，如图13所示。当药物A或药物B用于ADA的免疫捕捉时，定量限(LOQ)确定为120ng/ml ADA，如图13所示。使用本发明所述的免疫捕捉和LC-MS方法为ADA的分型和量化确定了ADA的LLOQ为120ng/mL。

示例11确定药物耐受限度

非临床猕猴血清样本中存在的治疗性药物可能会与免疫捕捉试剂竞争与ADA的结合，也称为药物干预。为了评估血清样本中药物A和药物B的分析耐受性，在不同浓度的药物A或药物B(范围为0.38ng/mL-10μg/mL)存在的情况下，对含500ng/mL ADA-PC的猕猴血清样本进行测试，确定何种浓度的药物会影响ADA的定量和ADA的检测。

在药物浓度达到195ng/mL之前，ADA-PC的定量不受药物A或药物B的影响，如图14所示。当药物浓度高于195ng/mL时，分析中检测到的ADA-PC浓度开始下降，表示药物在血清中对ADA结合的竞争效应。

配体结合ADA分析为非定量分析，非临床研究中的ADA浓度报告为阴性或阳性，并具有提供抗体反应相对定量的滴度(稀释)值。在药物耐受性实验中，即使药物A或药物B的浓度为3.1μg/mL，仍然可检测到ADA-PC，在该药物浓度下，ADA-PC信号是分析背景的3倍。

示例12猕猴临床前毒理学研究中ADA的分型和量化。

本发明所述的免疫捕捉和LC-MS方法用于猕猴(药物B)临床前毒理学研究中ADA的分型和量化。猕猴每周接受1mg/kg的药物B。随时间监测猕猴血清样本中的药物B浓度，从而获得猕猴A、B和C的毒代动力学，如图15所示。表8总结了猕猴A和猕猴B的药物水平、所有ADA同种型的质谱峰面积、转换ADA浓度和信噪比。信噪比表示给定样本的峰面积与给药前阴性猕猴血清样本的比。猕猴A在60天内药物B浓度迅速衰减。猕猴B血清样本中的药物B浓度在170天内逐渐衰减。猕猴C血清样本中的药物B浓度稳定，并没有随时间出现明显下降。

表8.药物B水平、所有ADA同种型的质谱峰面积、转换ADA浓度和信噪比汇总表。

使用本发明所述的免疫捕捉和LC-MS方法，对猕猴A、B和C的血清样本进行药物BADA的分型和量化。猕猴C的ADA测试结果为阴性，这表明猕猴C不存在ADA。使用本发明所述的免疫捕捉-LC/MS方法测量猕猴A和B的ADA总量，如图16A所示。根据示例性实施例，使用配体结合法分析(LBA)测量猕猴A和B中的ADA总量，如图16B所示。

免疫捕捉-LC/MS方法和LBA的测试结果具有可比性，随着时间的推移，ADA的数量呈现类似趋势。猕猴A的免疫捕捉-LC/MS方法和LBA的测试结果具有可比性，随着时间的推移，ADA的数量也呈现类似的增长趋势，如图16A和16B所示。这些测试结果与猕猴A在60天内药物B浓度的快速衰减一致，如图15中猕猴A的毒代动力学研究所示。使用LBA测量猕猴B中的总ADA无法随着时间的推移检测ADA数量，如图16B所示。但是，免疫捕捉-LC/MS方法测量猕猴B中的ADA总量可量化170天内ADA浓度逐渐升高的情况，如图16A所示，这与图15所示的猕猴B的毒代动力学研究一致。

使用本发明所述的免疫捕捉-LC-MS方法，对猕猴A和B的血清样本进行ADA的分型和量化。这些方法能够确定ADA同种型的相对定量，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgA的数量，猕猴A如图17A所示，猕猴B如图17B所示。

示例13猕猴临床前药代动力学研究中ADA的分型和量化。

采用本发明所述的免疫捕捉和LC-MS方法进行猕猴(药物A)临床前药代动力学研究中ADA的分型和量化。猕猴在药代动力学研究中接受单剂量的药物A。猕猴A接受15mg/kg的药物A。猕猴B接受5mg/kg的药物A。猕猴C接受1mg/kg的药物A。随时间监测猕猴A、B和C的血清样本中药物A的浓度，如图18所示。使用本发明所述的免疫捕捉-LC/MS方法测量猕猴A、B和C中的ADA总量，如图19所示。测试结果表明，总ADA水平具有更强的依赖性。

使用本发明所述的免疫捕捉-LC-MS方法，对猕猴A、B和C的血清样本进行ADA的分型和量化。这些方法能够确定ADA同种型的相对定量，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgA的数量，如图20所示。测试结果表明，ADA的IgG1亚型是30天后猕猴B中总ADA水平升高的原因。

Claims (52)

1.一种识别样本中至少一种肽或蛋白的方法，包括：

使样本与固相载体接触，其中，在固相载体上已附着至少一种药品；

使用至少一种流动相溶液清洗所述固相载体，获得至少一种洗脱液；

从洗脱液中分离出至少一种肽或蛋白；

用变性溶液和/或酶消化反应处理分离肽或蛋白质，形成分离肽或蛋白的成分；

使用质谱仪识别分离肽或蛋白的成分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，确定了所述分离肽或蛋白的同种型或亚类。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，使用质谱仪量化所述分离肽或蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述药品为一种药物、化合物、核酸、毒素、肽、蛋白、融合蛋白、抗体、抗体片段、抗体Fab区、抗体-药物偶联物或蛋白药品。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本中至少一种肽或蛋白为抗体，所述抗体可选择性与附着在固相载体上的药品结合。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本中至少一种肽或蛋白为人类抗体，其中，人类抗体的同种型为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgM或IgE。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本中至少一种肽或蛋白为哺乳动物类抗体，其中，所述哺乳动物类抗体的同种型为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM或IgA。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本中至少一种肽或蛋白为人类抗体，其中，所述分离肽或蛋白成分的氨基酸序列为GPSVFPLAPSSK、GLPAPIEK、WYVDGVEVHNAK、GLPSSIEK、DASGVTFTWTPSSGK、DASGATFTWTPSSGK、VSVFVPPR或DFTPPTVK。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本中至少一种肽或蛋白为哺乳动物类抗体，其中，所述分离肽或蛋白成分的氨基酸序列为GPSVFPLAPSSR、GPSVFPLASCSR、GPSVFPLVSCSR、GPSVFPLASSSR、QIEVSWLR或DPSGATFTWTPSSGK。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，在接触固相载体之前，所述样本经过溶液处理达到约0.1-4.5的pH值范围。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述溶液包含乙酸。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本与固相载体在室温下培养约1小时。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本进一步包含盐和表面活性剂。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本进一步包括BSA(牛血清白蛋白)、HEPES(4-(2-羟乙基)-l-羟乙基哌嗪乙磺酸)、氯化钠、EDTA(乙二胺四乙酸)和Tween-20(聚山梨醇酯20)。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述样本的pH值范围约为6-9。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，使用包含盐或表面活性剂的所述至少一种流动相溶液和至少另一种pH值范围在0.1-4.5之间的后续流动相溶液清洗所述固相载体。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述至少一种流动相溶液包含BSA(牛血清白蛋白)、HEPES(4-(2-羟乙基)-l-羟乙基哌嗪乙磺酸)、氯化钠、EDTA(乙二胺四乙酸)和Tween-20(聚山梨醇酯20)，并且pH值范围约为6-9。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述变性溶液包含约5-10M的尿素。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶消化反应中的酶为胰蛋白酶。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，使用一级胺-环氧反应或使用生物素-链亲和素相互作用在固相载体上附着所述药品。

21.根据权利要求1所述的方法，其中，使用药品的赖氨酸残基在固相载体上附着所述药品。

22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述质谱仪为电喷雾电离质谱仪或纳米电喷雾电离质谱仪或纳升电喷雾电离质谱仪。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述质谱仪与液相色谱***连接。

24.根据权利要求1所述的方法，其中，所述质谱仪能够进行LC-MS(液相色谱-质谱法)或LC-MRM-MS(液相色谱-多反应监测-质谱法)分析。

25.根据权利要求1所述的方法，其中，所述质谱仪为三重四极杆质谱仪。

26.根据权利要求3所述的方法，其中，所述分离肽或蛋白的成分至少约为0.01ng、0.1ng、0.2ng或0.3ng。

27.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：

对分离肽或蛋白进行肽图分析，

选择分离肽或蛋白的唯一肽和碎片离子产生MRM(多反应监测)跃迁，

选择唯一肽的前两种或前三种跃迁，

优化唯一肽的碰撞能量，

然后生成一个校准曲线，以及

根据校准曲线确定LLOQ(定量下限)。

28.一种识别或量化样本中至少一种肽或蛋白的***，包括：

一种固相载体，其中，在所述固相载体上已附着一种药品；

至少一种流动相溶液，用于清洗固相载体并能够提供用于分离至少一种肽或蛋白的至少一种洗脱液(包含至少一种肽或蛋白)；

一种变性溶液和/或酶消化溶液，能够形成分离肽或蛋白的成分；以及

一个质谱仪，能够识别或量化分离肽或蛋白的成分。

29.根据权利要求28所述的***，其中，所述质谱仪能够识别或量化所述分离肽或蛋白的同种型或亚类。

30.根据权利要求28所述的***，其中，所述药品为一种药物、化合物、核酸、毒素、肽、蛋白、融合蛋白、抗体、抗体片段、抗体Fab区、抗体-药物偶联物或蛋白药品。

31.根据权利要求28所述的***，其中，所述样本中至少一种肽或蛋白为抗体，所述抗体可选择性与附着在固相载体上的药品结合。

32.根据权利要求28所述的***，其中，所述样本中至少一种肽或蛋白为人类抗体，其中，所述人类抗体的同种型为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgM或IgE。

33.根据权利要求28所述的***，其中，所述样本中至少一种肽或蛋白为哺乳动物类抗体，其中，所述哺乳动物类抗体的同种型为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM或IgA。

34.根据权利要求28所述的***，其中，所述样本中至少一种肽或蛋白为人类抗体，其中，所述分离肽或蛋白成分的氨基酸序列为GPSVFPLAPSSK、GLPAPIEK、WYVDGVEVHNAK、GLPSSIEK、DASGVTFTWTPSSGK、DASGATFTWTPSSGK、VSVFVPPR或DFTPPTVK。

35.根据权利要求28所述的***，其中，所述样本中至少一种肽或蛋白为哺乳动物类抗体，其中，所述分离肽或蛋白成分的氨基酸序列为GPSVFPLAPSSR、GPSVFPLASCSR、GPSVFPLVSCSR、GPSVFPLASSSR、QIEVSWLR或DPSGATFTWTPSSGK。

36.根据权利要求28所述的***，其中，在接触固相载体之前，所述样本经过溶液处理达到约0.1-4.5的pH值范围。

37.根据权利要求36所述的***，其中，所述溶液包含乙酸。

38.根据权利要求28所述的***，其中，所述样本在室温下在固相载体上培养约1小时。

39.根据权利要求28所述的***，其中，所述样本进一步包含盐和表面活性剂。

40.根据权利要求28所述的***，其中，所述样本进一步包含BSA(牛血清白蛋白)、HEPES(4-(2-羟乙基)-l-羟乙基哌嗪乙磺酸)、氯化钠、EDTA(乙二胺四乙酸)和Tween-20(聚山梨醇酯20)。

41.根据权利要求40所述的***，其中，所述样本的pH值范围约为6-9。

42.根据权利要求28所述的***，其中，使用包含盐或表面活性剂的所述至少一种流动相溶液和至少另一种pH值范围在0.1-4.5之间的后续流动相溶液清洗所述固相载体。

43.根据权利要求42所述的***，其中，所述至少一种流动相溶液包含BSA(牛血清白蛋白)、HEPES(4-(2-羟乙基)-l-羟乙基哌嗪乙磺酸)、氯化钠、EDTA(乙二胺四乙酸)和Tween-20(聚山梨醇酯20)，并且pH值范围约为6-9。

44.根据权利要求28所述的***，其中，所述变性溶液包含约5-10M的尿素。

45.根据权利要求28所述的***，其中，所述酶消化溶液中的酶为胰蛋白酶。

46.根据权利要求28所述的***，其中，使用一级胺-环氧反应或使用生物素-链亲和素相互作用在固相载体上附着所述药品。

47.根据权利要求28所述的***，其中，使用药品的赖氨酸残基在固相载体上附着所述药品。

48.根据权利要求28所述的***，其中，所述质谱仪为电喷雾电离质谱仪或纳米电喷雾电离质谱仪或纳升电喷雾电离质谱仪。

49.根据权利要求28所述的***，其中，所述质谱仪与液相色谱***连接。

50.根据权利要求28所述的***，其中，所述质谱仪能够进行LC-MS(液相色谱-质谱法)或LC-MRM-MS(液相色谱-多反应监测-质谱法)分析。

51.根据权利要求28所述的***，其中，所述质谱仪为三重四极杆质谱仪。

52.根据权利要求28所述的***，其中，所述***能够：

对分离肽或蛋白进行肽图分析，

选择分离肽或蛋白的唯一肽和碎片离子产生MRM(多反应监测)跃迁，

选择唯一肽的前两种或前三种跃迁，

优化唯一肽的碰撞能量，

然后生成一个校准曲线，以及

根据校准曲线确定LLOQ(定量下限)。

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