CN114712386A - 高聚原花青素组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种药物组合物,其特征在于所述组合物包括有效量的原花青素,该原花青素的单体具有式(I)的化学式,以及药学上可接受的载体或盐类;其中所述原花青素为高聚原花青素,其聚合度介于50~65,具有良好的抗氧化压力,可用于治疗或预防由活性氧化物过多的生成所导致的脑疾病、老化相关疾病或者用于预防及治疗衰老,还可以用于治疗及预防肝病、肿瘤、肌少症等疾病。
Description
技术领域
本发明涉及抗氧化领域,具体的涉及高聚原花青素的组合物,及其在治疗抗氧化压力相关疾病领域中的应用。
背景技术
原花青素也叫前花青素,英文名是Oligomeric Proanthocyanidins简称OPCs或OPC,是一种在热酸处理下能产生花色素的多酚化合物,是目前国际上公认的清除人体内自由基有效的天然抗氧化剂,具有非常强的体内活性。一般为红棕色粉末,气微、味涩,溶于水和大多有机溶剂。原花青素是由儿茶素((+)-catechin)、表儿茶素((-)-epicatechin)或表儿茶素没食子酸酯((-)-epicatechin-3-gallate)等单体通过C4→C8或C4→C6键的连接方式缩合而成的多酚类物质,根据缩合数量及连接的位置而构成不同类型的聚合物,如二聚体、三聚体、四聚体……十聚体等,据聚合度的不同,原花青素又分为低聚原花青素(oligomeric proathocyanidin,OPC)和高聚原花青素(polymeric proathocyanidin,PPC)。同时研究表明,随着原花青素聚合度的增加,其溶解性相应降低,且高聚物在人体肠道内很难被吸收,故相比较而言,低聚原花青素具有更强的生理活性。原花青素能清除体内过剩的自由基,提高人体的免疫力,可作为防癌、抗突变、防治心血管疾病药物的主要有效成分和用作安全无毒的天然抗氧化剂等,在医药、保健、食品、日用化工等领域具有广泛的用途。
活性氧化物质(reactive oxygen species;ROS)是由内源性和外源性过程产生的,其负面作用可被抗氧化剂的防御作用所抵消。氧化压力(Oxidative Stress)是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态,倾向于氧化,导致中性粒细胞炎性浸润,蛋白酶分泌增加,产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用,并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。衰老是以组织和器官功能逐渐丧失为特征的过程。衰老的氧化应激理论基于以下假设:与年龄相关的功能损失是由于ROS诱导的损伤的积累所致。同时,氧化应激涉及几种与年龄相关的疾病(例如,心血管疾病CVDs,慢性阻塞性肺疾病,慢性肾脏疾病,神经退行性疾病和癌症),包括肌肉减少症和虚弱。鉴于氧化应激在许多临床疾病和衰老的发病机理中的重要作用,抗氧化剂治疗可以积极影响几种疾病的自然病程(Ilaria Liguori,et.al.,Clinical Interventions in Aging 2018,13:757–772)。已有文献指出,与衰老相关的慢性炎症状态称为炎性衰老(inflammaging),与老年人群中普遍观察到的多种疾病状态有关。炎性衰老与细胞中活性氧化物过多有关,可导致细胞成分氧化和损伤,炎症增加以及细胞死亡活化途径(Li Zuo,et.al.,Int.J.Mol.Sci.2019,20:4472)。动脉粥样硬化是与氧化应激和内皮功能障碍有关的慢性血管炎性疾病。多种因素会加速动脉粥样硬化过程,例如炎症趋化因子和细胞因子的释放,活性氧化物(ROS)的生成,生长因子以及血管平滑肌细胞的增殖。炎症和免疫是动脉粥样硬化发展和并发症的关键因素(Patricia Marchio,et.al.,Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume2019,Article ID 8563845,32pages)。
活性氧化物(ROS)生成和清除的平衡在活细胞中起着重要的作用,并且具有致DNA损伤和致癌效应,即与肿瘤的发生、发展密切相关(Guo C,et.al.,Oncotarget,2017,8:75767-75777)。现在已经公认,合适水平的ROS是多种细胞功能(包括基因表达)所必需的。由于代谢率增加,基因突变和相对缺氧,导致肿瘤细胞中ROS的产生增加,过量的ROS被同一细胞中抗氧化剂酶和非酶途径的增加而猝灭。ROS的增加可能导致多种病理状况,其中包括肿瘤的促进和进展,因为它们参与不同的信号传导途径并诱导DNA突变。ROS也能够触发程序性细胞死亡(PCD)。基于调节ROS水平以治疗癌症的机制的治疗策略是有用的(Perillo,et al.Experimental&Molecular Medicine,2020,52:192–203)。现有研究还表明,程序性细胞坏死(necroptosis)和活性氧化物(ROS)之间存在密切的相关性,程序性细胞坏死和ROS在人类生理条件下(例如炎症调节和癌症生物学)均起着重要作用,实验中使用几种小分子通过调节ROS含量和程序性细胞坏死来消除癌细胞(Sheng-Kai Hsu,et.al.,Cancers,2020,12:2185)。
目前对于原花青素的研究主要聚焦在低聚原花青素,即聚合度为2-4的低聚黄酮类物质,原因是因为有大量研究表明,低聚原花青素具有比单体和高聚体更优异的生理学活性,比如作为具有紫外损伤修复作用的添加剂用于食品、药品、化妆品等领域;作为活性氧化物(ROS)之抗氧化压力可用于氧化应激、肝功能与病理、及运动控制领域等。而高聚原花青素虽然更容易获得,但因其分子量较大,难以被人体吸收,且因为空间位阻效会影响酚羟基活性,导致其生物活降低等问题,使得其鲜少被人研究,甚至在业界已经被公认为是无效的存在。
而本申请在研究中意外的发现了一定聚合度的高聚原花青素相较于聚合度较低的原花青素能达到更好的抗氧化压力,并且在治疗及预防比如肝病、肿瘤、肌少症等领域具有显著的效果。
发明内容
本发明的目的,是提供一种药物组合物,特别是一种含有高聚原花青素的药物组合物,具有良好的抑制活性氧化物产生的能力,并且在治疗及预防比如肝病、流感、肌少症等领域具有显著的效果。
本发明公开了一种药物组合物,包括有效量的原花青素,该原花青素的单体具有下列式(I)的化学式:
其中,当R1为OCH3时,R2为OH,R3为H,当R1为OH时,R2为H,R3为H,或当R1为OH时,R2为OH,R3为H或当R1为OH时,R2为OH,R3为OH,R4为3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-sugar或3-(β)-O-sugar,该原花青素的聚合度介于50~65;以及药学上可接受的载体或盐类。
其中原花青素的单体以C4、C8碳键、C4、C6碳键或C2、C7氧键彼此相连,该原花青素的单体还包括于C2、C3或C4位置的R或S光学异构物。
该原花青素的单体包括黄酮类化合物,如没食子酸儿茶素(gallocatechin)、galloepicatechin、表没食子儿茶素(epigallocatechin)。
本发明公开的药物组合物,还可以包括儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、表阿夫儿茶精(epiafzetechin)、gallates、黄酮醇(flavonols)、黄烷双醇(flavandiols)、无色矢车菊素(leucocyanidins)或花青素(procynidins)以及黄烷-3-醇(flavan-3-ol)。
本发明公开的药物组合物,萃取自杜鹃花科(Ericaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、松科(Pinaceae)、葡萄科(Vitaceae)或荨麻科(Urticaceae)的植物,其中荨麻科(Urticaceae)的植物包括山苎麻(Boehmeria nivea L.Gaud)。
本发明公开的药物组合物中原花青素的聚合度介于50~65,优选介于55-65,更优选介于55-60。
本发明公开的药物组合物的药学上可接受的盐类包括钠盐、钾盐、胺盐、镁盐、钙盐、锌盐、铝盐、锆盐、二环己胺盐类、甲基-D-葡糖胺盐、精氨酸盐、赖氨酸盐、组氨酸盐或谷氨酰胺盐。
本发明公开的药物组合物,可用于治疗或预防有活性氧化物的生成所导致的脑疾病、老化相关疾病或者用于预防及治疗衰老。
本发明公开的药物组合物,可用于治疗及预防肝病和肌少症等疾病。
附图说明:
图1:使用多角度激光散射光谱法(MALS)作为检测器的原花青素样本1的排阻层析(SEC)图。
图2:使用多角度激光散射光谱法(MALS)作为检测器的原花青素样本1的质量分布分析图。
图3:原花青素样本1质量分布分析重复性实验分析图。
图4:原花青素样本1的不同重量分数与洗脱体积的曲线图。
图5A和5B:分别为高聚原花青素聚合物的比折光指数增量分析图。
图6:高聚原花青素聚合物在肝癌细胞(Huh7)中抑制活性氧化物产生实验图。
图7:高聚原花青素聚合物在大肠癌细胞(HRT-18)中抑制活性氧化物产生实验图。
图8:高聚原花青素聚合物与低聚原花青素聚合物大肠癌细胞(HRT-18)中抑制活性氧化物产生实验比较图。
图9:高聚原花青素聚合物改善肿瘤分泌因子(肺癌条件培养基,LLC)对抑制C2C12肌管细胞的影响。
图10A和10B:分别为高聚原花青素聚合物抑制肿瘤分泌因子(LLC)诱导C2C12肌管细胞萎缩相关基因Atrogin-1和MuRF-1的表达。
图11:高聚原花青素聚合物抑制肿瘤分泌因子(LLC)诱导C2C12肌管细胞产生IL-6。
图12:高聚原花青素聚合物改善由MnCl2诱导C2C12肌管细胞损伤。
图13A和13B:高聚原花青素聚合物抑制由H2O2诱导C2C12肌管细胞损伤相关基因Atrogin-1和MuRF-1的表达。
图14:高聚原花青素聚合物抑制由H2O2诱导C2C12肌管细胞产生IL-6。
具体实施方式
以下结合附图对本发明技术方案进行详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。本申请的范围并不受这些实施方式的限定,乃以申请专利的范围为准。
本发明中原花青素提取自植物,包括杜豆科(Leguminosae)、景天科(Crassulaceae)、使君子科(Combretaceae)、萝蘑科(Asclepiadaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、松科(Pinaceae)、唇形科(Lamiaceae)、蓼科(Polygonaceae)、葡萄科(Vitaceae)或荨麻科(Urticaceae)的植物,其中优选的为荨麻科(Urticaceae)的山苎麻(Boehmeria nivea L.Gaud)。而植物的萃取部分可包括其根、茎、叶及/或果实。
本发明中的萃取方法可以是一般所熟知的萃取方法。在一实施例中为将植物的根、茎、叶及/或果实干燥后进行切片或磨碎,然后再以萃取溶液来对此植物进行萃取。在一实施例中,以山苎麻的根及/或茎进行萃取。
萃取溶液可以选择水,或者是水及不同极性溶剂混合的溶液。不同极性溶剂可包括酒精、丙酮、甲醇和醋酸乙酯。而这些溶剂可以单独使用,混合使用,或者与水混合使用。萃取溶液与植物的比例并无特定的限制,在一实施例中萃取溶液与植物的比例为1∶10(W/W)。
因为萃取温度会随着萃取溶液不同而有一些改变。在一实施例中可以利用室温浸泡,而在另一实施例中也可加热至不同溶液的回流温度(60-100℃)。萃取的时间为约2小时至7天,视操作的萃取温度而定。于萃取操作中,可视需要将例如氯化钠、稀无机酸(如稀盐酸)或有机酸(如维他命C、酒石酸)加入萃取溶液中以调节萃取溶液的pH值。
之后将含有原花青素聚合物的活性成分的萃取物浓缩后进行干燥。或者可视需要对上述的萃取物进一步进行部分纯化或完全纯化。在一实施例中,部分纯化的方法是将干燥的萃取物以95%酒精及/或甲醇水溶液回溶,然后用不同极性的溶剂萃取以去除部分杂质。例如先以非极性的溶剂(如正已烷)去除脂质及非极性物质,再以三氯甲烷和/或乙酸乙酯,萃取去除小分子酚类化合物等,之后将经过这些溶剂萃取的水层,进行浓缩干燥后取得部分更加纯化的原花青素物质。
完全纯化的步骤包括以酒精或甲醇水溶解经部分纯化的萃取物,再将其置入分子筛管柱中,然后以不同溶液和/或混合溶液冲提,进行原花青素的纯化分离。在一实施例中,不同溶液冲提的顺序为:95%酒精,95%酒精/甲醇(1∶1,v/v),50%甲醇和50%丙酮水溶液。将每个不同溶液,所冲提出来的溶液都进行分段收集,然后以液相层析仪的254nm吸收值,检测所冲提出来的溶液中的经纯化的原花青。而收集由不同溶液所冲提出的溶液部分,可以得到含不同分子量分布的原花青素聚合物的溶液。将不同冲提部分的溶液以低于40℃的温度浓缩,并冷冻干燥。得到纯化的原花青素聚合物。在一实施例中分子筛管柱为Sephadex LH-20管柱(GE,安玛西亚股份有限公司)。
本发明经过上述纯化之后得到的原花青素,其单体具有如式(I)的化学结构。
在一实施例中,当R1为OCH3时,R2为OH,R3为H;在另一实施例中,当R1为OH时,R2为H,R3为H;在另一实施例中,当R1为OH时,R2为OH,R3为OH。上述结构式中,R4为3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-sugar或3-(β)-O-sugar,其中所述原花青素的单体以C4、C8碳键、C4、C6碳键或C2、C7氧键彼此相连形成聚合物。
原花青素的单体包括于C2、C3或C4位置的R或S光学异构体。
原花青素的单体结构中还可以包括黄酮类化合物,例如儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、表阿夫儿茶精(epiafzelechin)、没食子酸儿茶素(gallocatechin)、galloepicatechin、表没食子儿茶素(epigallocatechin)、gallates、黄酮醇(flavonols)、黄烷双醇(flavandiols)、无色矢车菊素(leucocyanidins)或花青素(procynidins)。在一实施例中,原花青素的单体可包括黄烷-3-醇(flavan-3-ol)或黄烷衍生物。
本发明的原花青素的聚合度介于50~65;平均分子量为15,000至19,500道尔顿,优选16,500至18,000道尔顿。
通过尺寸排阻色谱法使用MALS检测器(SEC-MALS)来测定。MALS检测器(多角度光散射检测器,诸如由Malvern Instruments Ltd.(Malvern,UK)所制造的)测定绝对分子量,而不是相对分子量(即,相对于标准来测定)。
本发明纯化的原花青素可以是单一聚合度的原花青素,也可以是包括不同聚合度的原花青素混合物。
药学上可接受之载体可包括,但不限定于溶剂、分散剂(dispersion medium)、包衣(coating)、抗菌试剂、抗真菌试剂、等渗透压与吸收延迟(absorption delaying)试剂或药学施用相容剂。对于不同给药方式,可利用常规方法将药物组合物配制成各种适当的剂型。
药学上可接受的盐类可包括,但不限定于无机盐类或有机盐类。无机盐类可包括例如钠、钾或胺盐的碱金族盐类,例如镁或钙盐的碱土族盐类,或例如锌、铝或锆盐的含二价或四价阳离子盐类。有机盐类可包括二环己胺盐类、甲基-D-葡糖胺或例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸或谷氨酰胺的氨基酸盐类。
本发明药物组合物的给药方式可包括口服、非口服、经吸入喷雾(inhalationspray)或经植入贮存器(implanted reservoir)的方式给药。非口服方式可包括经皮下(subcutaneous)、皮内(intracutaneous)、静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、关节内(intraarticular)、动脉(intraarterial)、滑囊(腔)内(intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)或疾病部位内(intraleaional)注射或灌注技术。
其中口服剂型可包括,但不限定于药锭、胶囊、乳剂(emulsions)、水性悬浮液(aqueoussuspensions)、分散液(dispersions)或溶液。
实施例
实施例1.高聚原花青素的制备
将清洗好的山苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)的根与茎在自然环境下干燥。干燥的山苎麻切成5mm厚的薄片,于4℃的温度下储存。之后借由研磨机将储存的山苎麻磨成粉,再使用20目(mesh)的筛过筛。收集过筛的粉末,加入95%乙醇(1:10w/v),加热回流2小时(进行两次),之后冷却至室温。将经由加热、冷却至室温所得的萃取溶液放入离心袋中以通过离心来进行过滤。通过真空蒸发器在低于40℃的温度浓缩过滤后的溶液,再经冷冻干燥机冷冻干燥,得到含有原花青素成分的混合物。
将含有原花青素的混合物溶于水/乙醇溶液,通过真空蒸发器于低于40℃的温度去除乙醇,加入己烷(1:10v/v)震荡30分钟(进行数次萃取)来移除萃取物中的脂质。将所得水相加入乙酸乙酯(水层:乙酸乙酯=1:1,v/v),并震荡30分钟(此步骤进行多次萃取)。将所得水相加入1-丁醇(1:1,v/v),震荡30分钟(此步骤进行多次萃取)。通过真空蒸发器在低于40℃的温度中浓缩得到水相溶液,再经冷冻干燥机冷冻干燥,得到经过纯化的含有原花青素的山苎麻萃取物。
借由凝胶渗透色谱(4cm直径x 45cm长的Sephadex LH-20)将前述部分纯化的含有原花青素的山苎麻萃取物分离,并使用具有不同极性比例的溶剂进行洗脱并移除杂质。将2.5g的部分纯化的山苎麻溶于0.5ml的95%乙醇,并将其加入凝胶渗透色谱柱再连续以一系列溶剂洗脱。收集以不同溶剂洗脱的洗脱液。该溶剂分别为300ml的95%乙醇、300ml的95%乙醇/甲醇(1/1,v/v)、300ml甲醇、300ml的50%甲醇水溶液及300ml的50%丙酮水溶液、300ml丙酮。除了洗脱液以300ml的95%乙醇洗脱外,所有其他的洗脱液通过真空蒸发器在低于40℃的温度中进行浓缩,再经冷冻干燥机冷冻干燥。冷冻干燥的物质储存于-20℃以待后用。分析该具有部分纯化和/或纯化的原花青素的经冷冻干燥的山苎麻萃取物的物理化学性质。经冷冻干燥的洗脱物质具有部分纯化和/或纯化的原花青素成分。
实施例2.原花青素聚合物的单体结构测定
原花青素单体的结构是以热分解气相层析质谱仪检测(Gas Chrimatograph-MassSpectrometry)。检测的方法是将固体的纯化原花青素(实施例1中纯化的样品),直接置于热分解气相层析仪,以分段温度(50℃至500℃)或单一温度的设定操作方式逐渐加温或瞬间加温,将加热分解的样品经热分解仪之特定的金属管柱分离,经质谱仪侦测器所产生的图谱,判定出原花青素聚合物的单体结构。判定出原花青素聚合物之单体结构分子式如下所示:
其中,R1为OCH3,R2为OH,R3为H;或者R1为OH,R2为H,R3为H;再或者R1为OH,R2为OH,R3为OH。因为热分解所测得的质谱显示含有配糖体讯号的峰,因此推定R4为3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-sugar或3-(β)-O-sugar。
实施例3.原花青素聚合物的分子量测定
步骤1:SEC-MALS测定平均分子量
从实施例1中获得的样品中选取三组,分别为样品1、样品2或样品3,每个样品平均分成3份后,通过使用多角度激光散射光谱仪(SEC-MALS)的大小排阻层析评估和得出原花青素聚合物的质量分布,并计算平均分子量。在本发明采用的SEC-MALS方法中,可以使用乙醇+蒸馏水的溶液作为流动相;样品的注射量为100uL,其流速为0.5mL/min,实验温度为25℃。使用SEC-MALS法直接得到原青花素的平均分子量Mw,样品1的结果如图1、2所示,所测得样品的平均分子量为16.484kDa。
将每个样品分别做3组平行实验,使用SEC-MALS法得到原青花素的平均分子量,3次平行实验的重现性很好,样品1的3次结果如图3所示。
步骤2:多分散性分析
将步骤1中的每个样品分别做3组平行实验,并根据非对称流动场(Asymmetricflow field flow fractions,AF4)分析计算得出多分散指数(polydispersity),其中表1的数据来源为样品1,具体的包括样品1A,1B和1C。
表1
由表1可知,样品1的重均分子量(Mw)集中在16.662kDa,数均分子量(Mn)集中在16.598kDa,3个样品的多分散指数为1.004,集中度非常高,即样品非常均匀。
步骤3:凝胶渗透色谱(GPC)分析原花青素聚合度
将步骤1中的每个样品分别做3组平行实验,使用AF4得到相应的谱图,样品1的3次结果如图4所示,三次结果的峰值分别为15.840kDa,16.079kDa,16.763kDa。
将样品1,2和3的3次结果数据分别进行分析,所测得样品1的平均分子量分别为16.484kDa,16.703kDa,16.799kDa;所测得样品2的平均分子量分别为15.580kDa,15.623kDa,15.383kDa。;所测得样品3的平均分子量分别为16.325kDa,16.132kDa,16.277kDa。具体如表2-1至2-3所示。
表2-1
表2-2
表2-3
由表2-1至2-3可知,样品1的聚合度集中在55-65,摩尔质量分布在16.5kDa~19.5kDa;样品2的聚合度集中在50-60,摩尔质量分布在15.0kDa~18.0kDa;样品3的聚合度集中在50-65,摩尔质量分布在15.0kDa~19.5kDa。即本发明萃取纯化得到的高聚原花青素的聚合度为50~65,优选55-60。
实施例4.比折光指数增量检测
利用装配有差示折光计(RI:Optilab T-rEX)的GPC装置,溶于乙醇:蒸馏水=1:1(体积),将样品注入到差式折射计的流动池内检测折射率,在浓度变化的区域为0.2-3.5mg/ml的范围内,样本流速为0.3ml/min,实验温度为25℃,对折射率的变化率根据稀溶液浓度的变化率求微分并测量的值。两组平行实验,得到如图5A和5B所示的结果,可知比折光指数增量(dn/dc)分别为0.2021±0.0019mL/g和0.1999±0.0015mL/g,经测试不同样品其样品与溶剂相对折射率(dn/dc)相近,显示所测试样品的特性相似。
实施例5.抑制活性氧化物产生实验
方法一:将从实施例1中的样品3,利用细胞株以MnCl2刺激诱导细胞内产生活性氧化物(ROS),加入不同浓度所分离得到的不同分子量的样品,得到抑制活性氧化物产生(抑制氧化压力)数据如下表3所示。
表3
表3中的抑制率表征的为抑制氧化压力,由其中数据可知,高聚原花青素具有良好的抑制活性氧化物产生的能力,具体的,在低浓度时已经具备一定的抑制效果,在较高浓度,即25μg/ml时,抑制率几乎到达99%。
方法二:
细胞培养:将人类肝癌细胞(Huh7)在MEM中培养。该培养基添加1%盘尼西林(Penicillin)/链霉素(Streptomycin)混合物及1%非必须氨基酸、1%GlutaMAX-I、1Mm丙酮酸钠及10%胎牛血清。细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养。
细胞中加入10mM的通用氧化应激指标CM-H2DCFDA,于37℃培养15分钟,与荧光探针共培养后,以PBS清洗细胞两次。以H2O2诱导细胞产生活性氧化物(ROS),测试样品对抑制ROS生物活性。本发明的高聚原花青素以下称BEL-X。
实验组设置:
(1)空白对照:未经任何处理;
(2)H2O2处理:添加0.5mM或1mM的H2O2培养液诱导细胞产生ROS;
(3)BEL-X和H2O2处理:0.5mM或1mM的H2O2分別添加5μg/ml或10μg/ml BEL-X至培养液。
上述各组细胞培养2小时,以分光光度计测量荧光强度,计算BEL-X对H2O2诱导细胞产生ROS的抑制效果,得到的数据如表4所示。
表4
表4中的抑制率表征为H2O2诱导细胞产生ROS测试样品的抑制效果,由其中数据可知,纯化后高聚原花青素具有良好的抑制活性氧化物产生的能力。
方法三:
细胞培养:将人类肝癌细胞(Huh7)在MEM中培养,人类大肠癌细胞(HRT-18)在DMEM中培养。上述培养基皆添加1%盘尼西林(Penicillin)/链霉素(Streptomycin)混合物及1%非必须氨基酸、1%GlutaMAX-I、1Mm丙酮酸钠及10%胎牛血清。细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养。
以MnCl2诱导细胞产生活性氧化物(ROS),测试样品对抑制ROS生物活性。
实验组设置:
(1)空白对照:细胞无任何处理;
(2)DMSO处理:添加DMSO至溶液中,DMSO含量为1.4mg/ml;
(3)BEL-X处理:将本发明样品BEL-X溶解在溶剂中,最终浓度为25μg/ml;
(4)MnCl2诱导:加入200μM的MnCl2;
(5)BEL-X和MnCl2共同处理:加入200μM的MnCl2和25μg/ml的BEL-X样品;以上5个组別细胞均在37℃、5%CO2培养箱中培养4小时;
(6)BEL-X-先处理+MnCl2:先加入25μg/ml的BEL-X样品后,培养细胞4小时,再加入200μM MnCl2培养2小时。
检测ROS的产生量:于上述细胞中加入10mM的CM-H2DCFDA,于37℃培养45分钟。使用荧光探针培养后,以PBS清洗细胞两次,以分光光度计测量荧光强度,得到ROS产生量的数据,绘制如图6-7所示。
由图6-7可知,高聚原花青素可以抑制因MnCl2诱导ROS的产生。
实施例6.不同聚合度抑制活性氧化物产生比对实验
细胞培养:将人类大肠癌细胞(HRT-18)在DMEM中培养。该培养基添加1%盘尼西林(Penicillin)/链霉素(Streptomycin)混合物及1%非必须氨基酸、1%GlutaMAX-I、1mM丙酮酸钠及10%胎牛血清。细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养。
以MnCl2诱导细胞产生活性氧化物(ROS),测试样品对抑制ROS生物活性。
实验组设置:
(1)空白对照:细胞无任何处理;
(2)DMSO处理:添加DMSO至溶液中DMSO含量为1.4mg/ml;
(3)MnCl2处理:加入200μM的MnCl2诱导细胞产生ROS;
(4)BEL-X处理:将本发明样品BEL-X溶解在溶剂中,最终浓度为25μg/ml;
(5)BEL-X和MnCl2共同处理:加入200μM MnCl2和BEL-X(25μg/ml)样品;
(6)BEL-X-分子量>3K处理:将样品BEL-X(分子量大于3kDa)溶解在溶剂中,然后稀释加入到细胞培养液中,最终浓度为25μg/ml;
(7)BEL-X-分子量>3K和MnCl2共同处理:将200μM MnCl2和25μg/ml的BEL-X(分子量大于3kDa)同时加入细胞培养液中;
(8)BEL-X-分子量<3K处理:将样品BEL-X(分子量小于3kDa)溶解在溶剂中,然后稀释加入到细胞培养液中,最终浓度为25μg/ml;
(9)BEL-X-分子量<3K和MnCl2共同处理:将200μM MnCl2和浓度为25μg/ml的BEL-X(分子量小于3kDa)同时加入细胞培养液中。
检测ROS的产生:于上述实验组的细胞中加入10mM的CM-H2DCFDA,于37℃培养45分钟。使用荧光探针共培养后,以PBS清洗细胞两次,以分光光度计测量荧光强度,得到ROS的产生情形,绘制如图8所示。
由图8可知,高聚原花青素可以非常有效的抑制因MnCl2诱导产生的ROS,而低聚原花青素则无抑制ROS产生的能力。
实施例7.高聚原花青素改善癌症引起的肌少症实验
方法一:
细胞培养:将小鼠肌母细胞培养(C2C12)在含10%FBS的DMEM培养基,37℃、CO2培养箱中培养24-72小时。
马血清诱导:将上述细胞与含2%马血清的DMEM培养基共同培养72小时,诱导肌管分化。
实验组设置:
(1)空白对照:经诱导后在DMEM培养基中培养24小时;
(2)BEL-X处理:将本发明样品BEL-X溶解在溶剂中,然后加入到细胞培养基中,BEL-X的最终浓度为50μg/ml,与细胞一起培养24小时;
(3)LLC处理:添加肺癌条件培养基(Lung cancer conditioned medium,LLC)至培养基中,使得LLC的含量为25%,与细胞一起培养24小时;
(4)LLC+BEL-X共同处理:将本发明样品BEL-X溶解在溶剂中,然后加入到含有25%LLC的细胞培养基中,BEL-X的最终浓度为50μg/m,培养24小时。
检测肌凝蛋白重链(mysoin heavy chain,MyHC):收集上述4组细胞,C2C12细胞生长并形成肌管,以磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗后,再以在-20℃预冷的100%甲醇(methanol)进行固定5分钟,之后待细胞自然干燥,保存于4℃。固定的细胞以含0.5%tween20的PBS回溶并放置冰上10分钟,进行细胞膜穿孔,再使用含0.1%tween20及0.2%BSA的PBS处理1小时,然后与MHC第一抗体(Millipore)在室温反应1小时。然后用PBS冲洗2次,使用老鼠抗MHC第二抗体(Invitrogen)反应1小时,细胞核染色则以DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)染剂处理。免疫染色的肌管以荧光显微镜进行观察,影像摄取使用ImageJ软件(NIH,Bethesda,MD,USA),每个实验组测量至少100个肌管的面积,并将每个肌管的平均面积计算为三次测量的平均值。得到的实验结果绘制如图9所示。
由图9可知,肺癌条件培养基(LLC)会诱导C2C12肌管细胞萎缩,因此将C2C12肌管细胞与LLC共同培养时,肌凝蛋白重链的表达量显著下降,而添加BEL-X后肌凝蛋白重链的表达量恢复,证明本发明的BEL-X在可以有效的抑止C2C12肌管细胞萎缩,进一步的有助于治疗及预防肌少症。
方法二:
细胞培养与实验组设置于方法一中的一致。
LLC诱导:将细胞转移至肺癌条件培养基(LLC)中,从而诱导Atrogin-1和MuRF-1基因表达,即肌肉萎缩的现象。
RT-PCR检测C2C12肌管细胞中的基因表达:使用Qiagen RNeasy kit提取RNA,使用Biora iScript试剂盒合成了单链cDNA。使用Riorad iQ SYBR green supermix进行RT-PCR。扩增条件为(1)95℃持续30min,(2)95℃持续15sec,60℃持续45sec,40个循环。以Actin基因为基准,将靶mRNA的量标准化。得到的实验结果绘制如图10A和10B所示。
由图10A和10B可知,LLC会诱导C2C12肌管细胞中Atrogin-1和MuRF-1基因表达,从而引发细胞萎缩,因此将C2C12肌管细胞与LLC共同培养时,基因表达量显著提高,而添加BEL-X后基因表达量恢复,即本发明的BEL-X在可以有效的阻止C2C12肌管细胞中Atrogin-1和MuRF-1基因表达,进一步的有助于治疗及预防肌少症。
方法三:
细胞培养、马血清诱导C2C12细胞形成肌管与实验组设置于方法一中的一致。
ELISA检测白细胞介素-6(IL-6):使用小鼠IL-6定量检测试剂盒(mouse IL-6Quantikine ELISA kit,R&D systems)并依其检测步骤进行白细胞介素-6含量检测。得到的实验结果绘制如图11所示。
由图11可知,LLC加入C2C12肌管细胞会产生大量IL-6,即LLC会诱导C2C12肌管细胞的发炎反应;但在添加BEL-X后IL-6表达量则显著下降,即本发明的BEL-X具有抗发炎作用。
实施例8.高聚原花青素改善氧化压力引起的肌少症实验
方法一:
细胞培养和马血清诱导C2C12细胞形成肌管与实施例7中的方法一中的一致。
实验组设置:
(1)空白对照:经诱导后在培养基中培养24小时;
(2)BEL-X处理:将本发明样品BEL-X溶解在溶剂中,然后加入到细胞培养基中使得BEL-X的浓度为50μg/m,与细胞一起培养24小时;
(3)H2O2处理:添加H2O2至培养基中,使得H2O2的含量为100μM,与细胞一起培养24小时;
(4)H2O2+BEL-X共同处理:将本发明样品BEL-X溶解在溶剂中,然后加入到含有H2O2的细胞培养基中使得BEL-X的浓度为50μg/m,培养24小时。
检测肌凝蛋白重链的方法与实施例7中方法一所写的一致,得到的结果绘制如图12所示。
由图12可知,首先本发明的BEL-X能增强肌管的形成,而H2O2会减少C2C12细胞肌管的形成,因此将C2C12肌管细胞培养液中添加H2O2后,肌凝蛋白重链的表达量显著下降,添加BEL-X后肌凝蛋白重链的表达量恢复,即本发明的BEL-X即能增强肌管的形成,还可以有效的防止H2O2损伤肌管,进一步的有助于治疗及预防肌少症。
方法二:
细胞培养和RT-PCR检测C2C12肌管细胞中的基因表达方法与实施例7中的方法二中的一致。
ROS诱导:将细胞转移至含有H2O2的培养基中,从而诱导Atrogin-1或MuRF-1基因表达,即肌肉损伤的现象。
实验组设置与实施例8方法一中的一致。
得到的结果绘制如图13A和13B所示。由图13A和13B可知,H2O2会诱导C2C12肌管细胞中Atrogin-1和MuRF-1基因表达,从而引发肌管损伤,因此将C2C12肌管细胞与H2O2共同培养时,基因表达量显著提高,而添加BEL-X后基因表达量恢复甚至低于对照组,即本发明的BEL-X可以有效的阻止C2C12肌管细胞中Atrogin-1和MuRF-1基因表达,进一步的有助于治疗及预防肌少症。
方法三:
细胞培养和检测白细胞介素-6的方法与实施例7中的方法三中的一致。
ROS诱导和实验组设置与实施例8中方法二中的一致。
得到的结果绘制如图14所示。由图14可知,H2O2会诱导C2C12肌管细胞中产生大量IL-6,即能诱导细胞产生发炎反应;而添加BEL-X后IL-6表达量显著下降,即本发明的BEL-X能降低H2O2诱导的IL-6的产生,具有抗发炎作用。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述原花青素的单体以C4、C8碳键、C4、C6碳键或C2、C7氧键彼此相连。
3.根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述原花青素的单体包括于C2、C3或C4位置的R或S光学异构物。
4.根据权利要求1所述的药物组合物,其中所述黄酮类化合物包括没食子酸儿茶素(gallocatechin)、galloepicatechin、表没食子儿茶素(epigallocatechin)。
5.根据权利要求1所述的药物组合物,所述药物组合物还可以包括儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、表阿夫儿茶精(epiafzetechin)、gallates、黄酮醇(flavonols)、黄烷双醇(flavandiols)、无色矢车菊素(leucocyanidins)或花青素(procynidins)。
6.根据权利要求1所述的药物组合物,所述药物组合物还可以包括黄烷-3-醇(flavan-3-ol)。
7.根据权利要求1所述的药物组合物,所述原花青素的聚合度介于55~60。
8.根据权利要求1所述的药物组合物,所述药学上可接受的盐类包括钠盐、钾盐、胺盐、镁盐、钙盐、锌盐、铝盐、锆盐、二环己胺盐类、甲基-D-葡糖胺盐、精氨酸盐、赖氨酸盐、组氨酸盐或谷氨酰胺盐。
9.根据权利要求1所述的药物组合物,其可用于治疗或预防由活性氧化物的生成所导致的脑疾病、老化相关疾病或者用于预防及治疗衰老。
10.根据权利要求9所述的药物组合物,可用于治疗及预防肝病、肿瘤和肌少症等疾病。
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