CN114703136B - 一种初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法，所述方法具体为：步骤1：从屠宰的仔猪上取出空肠前段，进行清洗；步骤2：采用消化培养基消化肠道，收集细胞沉淀；步骤3：向步骤2得到的细胞沉淀中加入胰酶消化肠道，收集细胞沉淀；步骤4：经细胞培养基重悬细胞重悬步骤3得到的细胞，并接种到用层粘连蛋白和Poly‑D赖氨酸包被的多孔细胞培养爬片上；定期更换细胞培养基，5天后收集检测，做细胞蛋白染色。该方法可成功率高的从仔猪肠道提取得到肠道神经元并原代培养。

Description

一种初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法。
背景技术
早期断奶仔猪肠道等器官尚未发育成熟，导致其消化能力和抗逆能力较差，加上心理、营养与环境的突然转变，断奶仔猪表现为采食量下降、消化功能紊乱、腹泻、生长受阻等为主要特征的“早期断奶综合症”，给生猪养殖业带来重大经济损失，成为制约生猪规模化养殖的关键问题之一。
小肠参与机体应激时的病理生理改变，被认为是“多器官功能障碍的发动机”，因此也被称为“机体应激的中心器官”。在应激反应中，动物机体为保证心、脑等重要器官的血液供应，通过复杂的神经-内分泌***介导，调节全身血流重新分配，产生选择性内脏血管痉挛，如肠道缺血、缺氧等，进一步引起肠黏膜屏障受损、肠道细菌变化、内毒素群移位、炎性反应及多种细胞因子表达升高。与身体其他器官不同，动物胃肠道具有广泛的内在神经***，其内在神经***（被称为肠神经***，也叫作“肠脑”）可独立于脑和外周自主神经***对胃肠功能进行调控，具有明显的自律性和稳定性（Vanner et al., 2016; Yoo andMazmanian, 2017）。而且研究表明肠神经***紊乱会破坏肠道黏膜稳态的平衡进而导致肠道炎症的发生。以往关于仔猪肠道健康的调控研究主要集中于对仔猪肠道屏障功能、免疫细胞、炎症因子以及炎症相关信号通路，但是针对“仔猪肠神经***-肠道功能”的研究几乎是空白。肠道神经细胞存在于消化道壁内，含量少，提取困难。本专利旨在建立一种初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法，该方法可成功率高的从仔猪肠道提取得到肠道神经元并原代培养。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法，所述方法具体为：
步骤1：从屠宰的仔猪上取出空肠前段，进行清洗；
步骤2：采用消化培养基消化肠道，收集细胞沉淀；
步骤3：向步骤2得到的细胞沉淀中加入胰酶消化肠道，收集细胞沉淀；
步骤4：经细胞培养基重悬细胞重悬步骤3得到的细胞，并接种到用层粘连蛋白和Poly-D赖氨酸包被的多孔细胞培养爬片上；
所述细胞培养基的配方为：
基础培养基：Neurobasal A 培养基；
FBS 1vol%；
双抗 适量；
100X规格的N2 1倍体积；
NeuroCult™ SM1 1倍体积；
GDNF 50ng/ml；
EGF 50ng/ml；
Recombinant bFGF 20ng/mL；
NGF 10ng/mL
定期更换细胞培养基重悬细胞，5天后收集检测，做细胞蛋白染色。
在上述的初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法中，所述步骤1具体为：
从屠宰的仔猪上取出空肠前段，使用含体积百分数为3%的双抗的PBS清洗3-5遍，直至培养基上清液清亮无杂物，将其置于具有Kerbs溶液的培养皿中，所述Kerbs溶液中含1倍体积的500X规格的Gentamicin/ Amphotericin B solution，所述Kerbs溶液通入含体积百分数为95%的氧气，体积百分数为5%的二氧化碳的混合气体以使Kerbs溶液形成氧合溶液；所述Kerbs溶液中各成分含量如下：126mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mMNaH2PO4, 1.2 mM MgCl2，pH 7.0-7.4。
在上述的初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法中，所述步骤2具体为：
取出高压灭菌后的剪刀，小心剪掉肠管浆膜层及周围***，接着用眼科剪剪碎肠组织，然后加入预热至37℃的消化培养基在37℃恒温孵箱中200 rpm消化1 h，每10min轻柔吹打一次；将100 μm的细胞过滤膜放置在50ml离心管上，将消化的组织加入100 μm的细胞过滤膜中过滤，丢弃过滤膜，过滤液4℃ 500g离心10 min，去上清收集细胞沉淀；
消化培养基的配方如下：
基础培养基为DMEM F12；
1mg/ml 胶原酶I；
1mg/ml牛血清白蛋白；
20 μg/ml DNA酶I；
1mM HEPES；
1mM Glutamax。
在上述的初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法中，所述步骤3具体为：
加入胰酶溶液，所述胰酶溶液中含有体积百分数为0.25%的胰酶，所述胰酶溶液没过细胞沉淀，移液枪轻轻吹打均匀，在37℃恒温孵箱中消化5 min，然后加入含有体积百分数为10%的FBS的DMEM终止消化；然后将70 μm的细胞过滤膜放置在50ml离心管上，将消化的组织加入70 μm的细胞过滤膜中过滤，丢弃过滤膜，过滤液4℃ 500g离心10 min，去上清收集细胞沉淀。
在上述的初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法中，所述步骤4中，层粘连蛋白和Poly-D赖氨酸包被的多孔细胞培养爬片的制备方法为：
实验前一天将-20℃储存的层粘连蛋白和Poly-D赖氨酸置于4℃缓慢解冻，实验当天将无菌的细胞爬片置于24孔板中，先用100 μg/mL Poly-D赖氨酸100 μL/每孔覆盖细胞爬片，室温孵育1h，用ddH2O清洗爬片后室温干燥1h；然后再用60 μg/mL 层粘连蛋白100 μL/每孔覆盖细胞爬片，37℃培养箱中孵育1h，吸走残留的层粘连蛋白溶液，用无菌PBS漂洗两遍，后置于37℃培养箱待用。
在上述的初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法中，在步骤4中，实验采用每两天换液，有利于及时减少细胞不良代谢产物，维持肠道神经元的充分营养，不断提高肠道神经元纯度，期间显微镜观察细胞生长状态，5天后收集检测，做细胞蛋白染色。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
①本发明提供一种初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法；
②通过上述方法分离得到的初生仔猪肠神经细胞，不仅可以为研究大型哺乳动物腹泻及肠道健康等提供了模型，也可以为机体天然神经免疫反应提供模型，还可以为深入探究营养素或相关基因在中发挥的调控作用提供研究工具。
附图说明
图1为本发明的实施例1的操作过程图；
图2为本发明实施例1提供的肠道神经细胞的marker染色结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
参考图1，本发明涉及的初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法如下：
步骤1：层粘连蛋白和Poly-D赖氨酸包被细胞培养爬片：实验前一天将-20℃储存的层粘连蛋白和Poly-D赖氨酸置于4℃缓慢解冻，实验当天将无菌的细胞爬片置于24孔板中，先用100 μg/mL Poly-D赖氨酸100 μL/每孔覆盖细胞爬片，室温孵育1h，用ddH2O清洗爬片后室温干燥1h。然后再用60 μg/mL 层粘连蛋白100 μL/每孔覆盖细胞爬片，37℃培养箱中孵育1h，吸走残留的层粘连蛋白溶液，用无菌PBS漂洗两遍，后置于37℃培养箱待用。
步骤2：仔猪肠道采集：从屠宰的仔猪上取出空肠前段，使用含体积百分数为3%的双抗的PBS清洗3-5遍，直至培养基上清液清亮无杂物，将其置于具有Kerbs溶液的培养皿中，所述Kerbs溶液中含1倍体积的500X规格的Gentamicin/ Amphotericin B solution，所述Kerbs溶液通入含体积百分数为95%氧气，体积百分数为5%的二氧化碳的混合气体以使Kerbs溶液形成氧合溶液；Kerbs溶液中含126 mM NaCl，2.5 mM KCl，2.5 mM CaCl2，1.2 mMNaH2PO4，1.2 mM MgCl2，pH 7.0-7.4。
步骤3：消化培养基消化肠道：取出高压灭菌后的剪刀，小心剪掉肠管浆膜层及周围***，接着用眼科剪剪碎肠组织，然后加入预热至37℃的消化培养基（DMEM F12、1mg/ml 胶原酶I、1mg/ml牛血清白蛋白、20 μg/ml DNA酶I、1mM HEPES、1mM Glutamax）在37℃恒温孵箱中200 rpm消化1 h，每10 min轻柔吹打一次；将100 μm的细胞过滤膜放置在50ml离心管上，将消化的组织加入100 μm的细胞过滤膜中过滤，丢弃过滤膜，过滤液4℃500g离心10 min，去上清收集细胞沉淀。
步骤4：胰酶消化肠道：加入胰酶溶液，所述胰酶溶液中含有体积百分数为0.25%的胰酶，所述胰酶溶液没过细胞沉淀，胰酶溶液用量在本实施例中一般为15-20ml即可，移液枪轻轻吹打均匀，在37℃恒温孵箱中消化5 min，然后加入含有体积百分数为10%的FBS的DMEM终止消化；然后将70 μm的细胞过滤膜放置在50ml离心管上，将消化的组织加入70 μm的细胞过滤膜中过滤，丢弃过滤膜，过滤液4℃ 500g离心10 min，去上清收集细胞沉淀。
步骤5：接种神经细胞：用神经细胞培养基重悬细胞，按照2*10^5个细胞/每孔接种到步骤（1）中用层粘连蛋白和Poly-D赖氨酸包被的24孔细胞培养爬片上，培养基配方为：Neurobasal A 培养基， 1% FBS，1 x Penicillin & Streptomycin solution（100X），1 xN2（100X），1 x NeuroCult™ SM1，50ng/ml GDNF，50ng/ml EGF，20ng/mL RecombinantbFGF，10ng/mL NGF，10mM HEPES，1mM N-acetylcysteine，1x Glutamax。
实验采用每两天半换液，有利于及时减少细胞不良代谢产物，维持神经元的充分营养，不断提高神经元纯度，期间显微镜观察细胞生长状态（图1），5天后收集检测，做细胞蛋白染色（图2）；胆碱能神经元标记物为Chat和ACE基因；神经元标志物为NeuN和MAP2。
备注：
1.本案所述实施例以及对比例中所涉及的1倍体积的含义释义如下：
1 x N2（100X）是指将商品N2稀释100倍，即在100ml基础培养基中加入1ml N2。
2.未做特殊说明的情况下，本案的mM代表毫摩尔/L；%代表体积百分比。
本实施例1经过5次重复性实验，成功5次。
对比例1
本对比例的操作步骤同实施例1的步骤1-5，不同之处在于：细胞培养基的配方为：DMEM/F12 培养基，Neurobasal A 培养基；FBS 1vol%；双抗 适量；100X规格的N2 1倍体积；NeuroCult™ SM1 1倍体积；GDNF 50ng/ml；EGF 50ng/ml；Recombinant bFGF 20ng/mL；IGF10ng/mL；HEPES 10mM；N-acetylcysteine 1mM；Glutamax 1倍体积。
本对比例1经过5次重复性实验，成功2次。
对比例2
本对比例的操作步骤同实施例1的步骤1-5，不同之处在于：细胞培养基的配方为：Neurobasal A 培养基，Neurobasal A 培养基；FBS 1vol%；双抗 适量；100X规格的N2 1倍体积；NeuroCult™ SM1 1倍体积；GDNF 50ng/ml；EGF 50ng/ml；Recombinant bFGF 20ng/mL；CNTF 10ng/mL；HEPES 10mM；N-acetylcysteine 1mM；Glutamax 1倍体积。
本对比例2经过5次重复性实验，成功2次。
对比例3
本对比例的操作步骤同实施例1的步骤1-5，不同之处在于：细胞培养基的配方为：Neurobasal A 培养基，Neurobasal A 培养基；FBS 1vol%；双抗 适量；100X规格的N2 1倍体积；NeuroCult™ SM1 1倍体积；GDNF 50ng/ml；EGF 50ng/ml；Recombinant bFGF 20ng/mL；NT3 10ng/mL；HEPES 10mM；N-acetylcysteine 1mM；Glutamax 1倍体积。
本对比例3经过5次重复性实验，成功3次。
对比例4
本对比例的操作步骤同实施例1的步骤2-7，不同之处在于：细胞培养爬片未包被。
对比例4经过5次重复性实验，成功1次。
结论：
1.细胞培养爬片经过包被利于贴壁培养；
2.NeuroCult™ SM1、GDNF、EGF、Recombinant bFGF、NGF作为神经细胞重要的营养和生长影响因子，五者缺一不可。
实验过程由同一人在相同环境下进行操作，已经排除了多种环境因素。

Claims (6)

1.一种初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法，其特征在于，所述方法为：
步骤1：从屠宰的仔猪上取出空肠前段，进行清洗；
步骤2：采用消化培养基消化肠道，收集细胞沉淀；
步骤3：向步骤2得到的细胞沉淀中加入胰酶消化，收集细胞沉淀；
步骤4：经细胞培养基重悬步骤3得到的细胞，并接种到用层粘连蛋白和Poly-D赖氨酸包被的多孔细胞培养爬片上；
所述细胞培养基的组成为：
基础培养基：Neurobasal A 培养基；
FBS 1%；
双抗适量；
100 × N2；
NeuroCult SM1；
GDNF 50ng/ml；
EGF 50ng/ml；
Recombinant bFGF 20ng/mL；
NGF 10ng/mL；
HEPES 10mM；
N-acetylcysteine 1mM；
Glutamax；
定期更换细胞培养基，5天后收集检测，做细胞蛋白染色；
所述消化培养基的组成如下：
基础培养基为DMEM/F12；
1mg/ml 胶原酶I；
1mg/ml牛血清白蛋白；
20 μg/ml DNA酶I；
1mM HEPES；
1mM Glutamax。
2.根据权利要求1所述的初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法，其特征在于，所述步骤1为：
从屠宰的仔猪上取出空肠前段，使用含体积百分数为3%的双抗的PBS清洗3-5遍，直至培养基上清液清亮无杂物，将其置于具有Kerbs溶液的培养皿中，所述Kerbs溶液中含500× 的Gentamicin/ Amphotericin B solution，所述Kerbs溶液通入含体积百分数为95%的氧气和体积百分数为5%的二氧化碳的混合气体以使Kerbs溶液形成氧合溶液；所述Kerbs溶液中各成分含量如下：126mM NaCl， 2.5 mM KCl， 2.5 mM CaCl2，1.2 mM NaH2PO4，1.2 mMMgCl2，pH 7.0-7.4。
3.根据权利要求1所述的初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法，其特征在于，所述步骤2为：
取出灭菌后的剪刀，小心剪掉肠管浆膜层及周围***，接着用眼科剪剪碎肠组织，然后加入预热至37℃的消化培养基在37℃恒温孵箱中200 rpm消化1 h，每10 min轻柔吹打一次；将100 μm的细胞过滤膜放置在50ml离心管上，将消化的组织加入100 μm的细胞过滤膜中过滤，丢弃过滤膜，过滤液4℃ 500g离心10 min，去上清收集细胞沉淀。
4.根据权利要求1所述的初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法，其特征在于，所述步骤3为：
加入胰酶溶液，所述胰酶溶液中含有体积百分数为0.25%的胰酶，所述胰酶溶液没过细胞沉淀，移液枪轻轻吹打均匀，在37℃恒温孵箱中消化5 min，然后加入含有体积百分数为10%的FBS的DMEM终止消化；然后将70 μm的细胞过滤膜放置在50ml离心管上，将消化的组织加入70 μm的细胞过滤膜中过滤，丢弃过滤膜，过滤液4℃ 500g离心10 min，去上清收集细胞沉淀。
5.根据权利要求1所述的初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法，其特征在于，所述步骤4中，层粘连蛋白和Poly-D赖氨酸包被的多孔细胞培养爬片的制备方法为：
实验前一天将-20℃储存的层粘连蛋白和Poly-D赖氨酸置于4℃缓慢解冻，实验当天将无菌的细胞爬片置于24孔板中，先用100 μg/mL Poly-D赖氨酸100 μL/每孔覆盖细胞爬片，室温孵育1h，用ddH2O清洗爬片后室温干燥1h；然后再用60 μg/mL 层粘连蛋白100 μL/每孔覆盖细胞爬片，37℃培养箱中孵育1h，吸走残留的层粘连蛋白溶液，用无菌PBS漂洗两遍，后置于37℃培养箱待用。
6.根据权利要求1所述的初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法，其特征在于，在步骤4中，实验采用每两天半换液，期间显微镜观察细胞生长状态，5天后收集检测，做细胞蛋白染色。
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