CN105219702A - 一种新生仔猪肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，属于生物技术领域。本发明的制备方法采用新生仔猪的小肠段作为材料，提供了一种快速、便捷、高效率的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，制备的猪小肠绒毛上皮原代细胞株可传代至20-30代次以上。本发明制备方法可在短时间内制备出大量健康、单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞，供细胞生物学、预防兽医学、病毒学、免疫学、动物营养学等实验研究或猪腹泻病毒类疫苗生产及抗原制备。同时，本发明首次制备出健康、单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞株，填补了生命学科研究领域缺乏单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞株的空白，具有积极的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新生仔猪肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法。
背景技术
现有细胞培养技术虽然历经几十年的发展，并且取得了长足发展，但对于一些特殊组织器官的细胞体外培养技术进展却停滞不前，截至今日仍然没有成功制备出单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞株，更不用提培育出猪小肠绒毛上皮传代细胞系了。现有的猪小肠绒毛上皮细胞制备方法通常是无菌取出胎猪小肠段后，连同小肠绒毛上皮及基底层组织一起（包含小肠平滑肌及***）用剪刀剪碎，然后通过0.025%浓度的胰酶消化、分散后进行培养，因此所获得的培养物仅含有极少量的猪小肠绒毛上皮细胞，更多的则是小肠组织细胞。这是因胎猪在出生前未吮乳，其消化道粘膜未受到食物刺激，致使小肠绒毛未完全生长和舒展所致。因此当需要对单一、纯化的小肠绒毛上皮细胞开展实验研究时，会因小肠绒毛上皮细胞量极少、且混合有小肠组织细胞，而造成实验结果的较大偏差、误差甚至错误。另外，用现有的污染控制技术，即添加双抗，几乎无法控制该培养物的污染。
在病毒学或预防兽医学等研究领域，很多腹泻病毒诸如：猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、轮转病毒、冠状病毒、博卡病毒（BOV）、库布病毒（KOV）、肠道病毒、诺如病毒、札幌病毒等的细胞受体，均位于小肠绒毛上皮细胞上。因此为了提高以上腹泻病毒的分离成功率，以及开展后续的病原学、免疫学、病理学、疫苗研发等重要研究，完全有必要研究出一种能高效、便捷地获得单一猪小肠绒毛上皮传细胞的方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种新生仔猪肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，该方法能够简易、方便、高效地制备出单一、纯化的猪小肠上皮绒毛原代细胞株，可应用于猪腹泻病毒分离、动物营养调控及机制研究或细胞生物学等领域。
本发明采用的技术方案如下：
一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取日龄为1日龄内的新生健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长5-10cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；
步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后剪下小肠绒毛，将小肠绒毛加入到新的冲洗液中，每克小肠绒毛需要15-20mL冲洗液，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；
步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到温育至37℃的胰酶消化液中，每毫升胰酶消化液中小肠绒毛组织团块的加入量为0.075-0.1g；然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，补加胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，10-15min后，取出，再向其中加入第一培养液，混匀后，将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；
其中，补加的胰酶消化液的体积是原胰酶消化液体积的4倍；第一培养液的加入体积是补加的胰酶消化液体积的1.25倍；
步骤（4），向步骤（3）得到的第一细胞团块中加入第二培养液后，将细胞团块吹散并使其悬浮，第二培养液的加入体积是步骤（3）补加的胰酶消化液体积的0.5倍；接着补加第二培养液，混匀，得到混合液，补加的体积是第一次使用的第二培养液体积的一半；然后将混合液转移到带透气膜的细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；
步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，重新加入第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养，重新加入第二培养液的体积是步骤（4）第一次使用的第二培养液体积的0.75倍；
培养3-5天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去1/2培养瓶中的培养液，再补加新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；
更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；
步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入胰酶消化液涮洗单层细胞，加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.5倍；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入胰酶消化液，重新加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.25倍，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入第二培养液，第二培养液的加入体积与涮洗单层细胞的胰酶消化液体积相同，并将单层细胞吹至悬浮后，补加第二培养液，补加第二培养液的体积是涮洗单层细胞的胰酶消化液体积的5倍；然后平均分装至两个与原培养瓶相同的培养瓶，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；
其中，步骤（4）和步骤（6）中所述的二氧化碳恒温培养箱内CO2的体积浓度为5%；
所述的冲洗液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1-3ml溶解于97-99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到97mL的MEM培养基内，即得到冲洗液；
所述的第一培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1-3ml溶解于97-99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的MEM培养基内，再加入10mL新生犊牛血清后混匀，即得到第一培养液；
所述的第二培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1-3ml溶解于97-99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的DMEM培养基内，再加入10mL胎牛血清后混匀，即得到第二培养液；
所述的胰酶消化液的制备方法如下：称取Gibic胰酶干粉（1:250）0.6克、碳酸氢钠0.64克、ETDA二钠0.224克、氯化钠8.9克、氯化钾0.44克和葡萄糖1.1克，然后将它们一起加入到1000ml纯净水内，溶解后经0.1微米滤膜过滤后，取滤液，即为胰酶消化液。。
进一步，优选的是步骤（2）所述的剪下小肠绒毛采用的是眼科剪刀。
进一步，优选的是步骤（3）中将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮、步骤（4）中将细胞团块吹散并使其悬浮、以及步骤（6）中将单层细胞吹至悬浮采用的仪器均为普通移液管。
进一步，优选的是所述的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，还包括如下步骤：
步骤（7），选取步骤（6）中得到的生长有10代次以内单层细胞的1个培养瓶倾去培养液，加入胰酶消化液涮洗单层细胞，加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.5倍；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入胰酶消化液，重新加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.25倍，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入第一培养液，第一培养液的加入体积与涮洗单层细胞的胰酶消化液体积相同，并将吹单层细胞至悬浮后，补加第一培养液，补加第一培养液的体积是涮洗单层细胞的胰酶消化液体积的3倍，混匀，离心，弃上清，得到第二细胞团块；
步骤（8），将细胞冻存液预冷至4℃，然后将步骤（7）得到的第二细胞团块加入至细胞冻存液中，将单层细胞吹至悬浮后，分装于细胞冻存管内，于4℃静置2h，再转移至冻存盒内，于-80℃过夜，最后转移至液氮长期保存；
其中，细胞冻存液的体积为步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.45-0.55倍；所述的二氧化碳恒温培养箱内CO2的体积浓度为5%；
所述的细胞冻存液的制备方法为：首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1-3ml溶解于97-99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL、二甲基亚砜10mL和胎牛血清10-20mL一起加入到的DMEM培养基内，控制总体积为100mL，混匀后，即得到细胞冻存液。
进一步，优选的是所述的离心速度为1000rpm，离心时间为5min。
进一步，优选的是所述的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取日龄为1日龄内的新生健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长5-10cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；
步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后剪下小肠绒毛，接着将1.5-2g小肠绒毛加入到30mL新的冲洗液中，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；
步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到20mL温育至37℃的胰酶消化液中，然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，补加80mL胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，10-15min后，取出，再向其中加入100mL第一培养液，混匀后，将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；
步骤（4），向步骤（3）得到的第一细胞团块中加入到40mL第二培养液后，将细胞团块吹散并使其悬浮；接着补加20mL第二培养液，混匀，得到混合液；然后将混合液转移到带透气膜的150cm2细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；
步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，重新加入30mL第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养；
培养3-5天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去15mL培养瓶中的培养液，再补加15mL新鲜的第二培养液；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入30mL新鲜的第二培养液；
更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；
步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入10mL胰酶消化液涮洗单层细胞；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入5mL胰酶消化液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层3-5min，加入10mL第二培养液，并将单层细胞吹至悬浮后，补加50mL第二培养液；然后平均分装至2个150cm2细胞培养瓶中，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；
步骤（7），选取步骤（6）中得到的生长有10代次以内单层细胞的1个培养瓶倾去培养液，加入10mL胰酶消化液涮洗单层细胞；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入5mL胰酶消化液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入10mL第一培养液，并将吹单层细胞至悬浮后，补加30mL第一培养液，混匀，离心，弃上清，得到第二细胞团块；
步骤（8），将细胞冻存液预冷至4℃，然后将步骤（7）得到的第二细胞团块加入至9-11mL细胞冻存液中，将单层细胞吹至悬浮后，按1.8mL/管分装于细胞冻存管内，于4℃静置2h，再转移至冻存盒内，于-80℃过夜，最后转移至液氮长期保存。
进一步，优选的是所述的日龄为1日龄内的新生健康仔猪为未吮乳的新生仔猪。
本发明方法培养出的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的倒置光学显微镜图如图1~图3所示，从图1中可以看出，贴壁的猪小肠绒毛组织块周边生长出小肠绒毛上皮细胞集落。从图2和图3中可以看出，本发明方法制得的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株健康、单一，且纯化，可应用于猪腹泻病毒分离、动物营养调控及机制研究或细胞生物学等领域。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
传统采集胎猪小肠剪碎、胰酶消化制备猪小肠绒毛上皮原代细胞的方法无法获得纯化、单一的小肠绒毛上皮细胞，往往造成错误的实验结果或使得实验数据偏差、误差增大。采集仔猪小肠段材料制备肠绒毛上皮细胞的话，不仅无法获得纯化、单一的小肠绒毛上皮细胞，还无法有效控制培养物的污染问题，常常严重污染导致实验失败，往往是事倍功半。
本发明提供了一种快速、便捷、高效率的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，制备的猪小肠绒毛上皮原代细胞株可传代至20-30代次以上；
本发明制备方法可在短时间内制备出大量健康、单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞，供细胞生物学、预防兽医学、病毒学、免疫学、动物营养学等实验研究或猪腹泻病毒类疫苗生产及抗原制备。
本发明在首次制备出健康、单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞株，填补了国内生命学科研究领域缺乏单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞株的空白，具有积极的效果。
附图说明
图1是本发明制备方法制备的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的倒置光学显微镜图；本图是猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代，放大100X；
图2是本发明制备方法制备的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的倒置光学显微镜图；本图是猪小肠绒毛上皮原代细胞株F6代，放大40X；
图3是本发明制备方法制备的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的倒置光学显微镜图；本图是猪小肠绒毛上皮原代细胞株F6代，放大100X。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
其中，MEM培养基（1×MEM，MinimumEssentialMedium）和DMEM培养基（1×DMEM，Dulbecco’sModifiedEagleMedium）均为美国生命科学技术有限公司Gibic品牌的液体细胞培养液。
质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液购自德国Bayer公司。
本发明所述的冻存盒内含有500ml异丙醇。
实施例1
一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取日龄为1日龄内的新生健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长5cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；
步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后用眼科剪刀剪下小肠绒毛，接着将小肠绒毛加入到新的冲洗液中，每克小肠绒毛需要冲洗液15mL，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；
步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到温育至37℃的胰酶消化液中，每毫升胰酶消化液中小肠绒毛组织团块的加入量为0.075g；然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，补加胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，10min后，取出，再向其中加入第一培养液，混匀后，将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；
其中，补加的胰酶消化液的体积是原胰酶消化液体积的4倍；第一培养液的加入体积是补加的胰酶消化液体积的1.25倍；
步骤（4），向步骤（3）得到的第一细胞团块中加入第二培养液后，将细胞团块吹散并使其悬浮，第二培养液的加入体积是步骤（3）补加的胰酶消化液体积的0.5倍；接着补加第二培养液，混匀，得到混合液，补加的体积是第一次使用的第二培养液体积的一半；然后将混合液转移到带透气膜的细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；
步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，重新加入第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养，重新加入第二培养液的体积是步骤（4）第一次使用的第二培养液体积的0.75倍；
培养3天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去1/2培养瓶中的培养液，再补加新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；
更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；
步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入胰酶消化液涮洗单层细胞，加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.5倍；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入胰酶消化液，重新加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.25倍，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入第二培养液，第二培养液的加入体积与涮洗单层细胞的胰酶消化液体积相同，并将单层细胞吹至悬浮后，补加第二培养液，补加第二培养液的体积是涮洗单层细胞的胰酶消化液体积的5倍；然后平均分装至两个与原培养瓶相同的培养瓶，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；
其中，步骤（4）和步骤（6）中所述的二氧化碳恒温培养箱内CO2的体积浓度为5%；
所述的冲洗液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1ml溶解于99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到97mL的MEM培养基内，即得到冲洗液；
所述的第一培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1ml溶解于99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的MEM培养基内，再加入10mL新生犊牛血清后混匀，即得到第一培养液；
所述的第二培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1ml溶解于99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的DMEM培养基内，再加入10mL胎牛血清后混匀，即得到第二培养液；
所述的胰酶消化液的制备方法如下：称取Gibic胰酶干粉（1:250）0.6克、碳酸氢钠0.64克、ETDA二钠0.224克、氯化钠8.9克、氯化钾0.44克和葡萄糖1.1克，然后将它们一起加入到1000ml纯净水内，溶解后经0.1微米滤膜过滤后，取滤液，即为胰酶消化液。。
其中，步骤（3）中将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮、步骤（4）中将细胞团块吹散并使其悬浮、以及步骤（6）中将单层细胞吹至悬浮采用的仪器均为普通移液管。
所述的离心速度为1000rpm，离心时间为5min。
实施例2
一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取日龄为1日龄内的新生健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长10cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；
步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后用眼科剪刀剪下小肠绒毛，接着将小肠绒毛加入到新的冲洗液中，每克小肠绒毛需要20mL冲洗液，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；
步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到温育至37℃的胰酶消化液中，每毫升胰酶消化液中小肠绒毛组织团块的加入量为0.1g；然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，补加胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，15min后，取出，再向其中加入第一培养液，混匀后，将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；
其中，补加的胰酶消化液的体积是原胰酶消化液体积的4倍；第一培养液的加入体积是补加的胰酶消化液体积的1.25倍；
步骤（4），向步骤（3）得到的第一细胞团块中加入第二培养液后，将细胞团块吹散并使其悬浮，第二培养液的加入体积是步骤（3）补加的胰酶消化液体积的0.5倍；接着补加第二培养液，混匀，得到混合液，补加的体积是第一次使用的第二培养液体积的一半；然后将混合液转移到带透气膜的细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；
步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，重新加入第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养，重新加入第二培养液的体积是步骤（4）第一次使用的第二培养液体积的0.75倍；
培养5天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去1/2培养瓶中的培养液，再补加新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；
更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；
步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入胰酶消化液涮洗单层细胞，加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.5倍；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入胰酶消化液，重新加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.25倍，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入第二培养液，第二培养液的加入体积与涮洗单层细胞的胰酶消化液体积相同，并将单层细胞吹至悬浮后，补加第二培养液，补加第二培养液的体积是涮洗单层细胞的胰酶消化液体积的5倍；然后平均分装至两个与原培养瓶相同的培养瓶，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；
其中，步骤（4）和步骤（6）中所述的二氧化碳恒温培养箱内CO2的体积浓度为5%；
所述的冲洗液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液3ml溶解于97ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到97mL的MEM培养基内，即得到冲洗液；
所述的第一培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液3ml溶解于97ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的MEM培养基内，再加入10mL新生犊牛血清后混匀，即得到第一培养液；
所述的第二培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液3ml溶解于97ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的DMEM培养基内，再加入10mL胎牛血清后混匀，即得到第二培养液；
所述的胰酶消化液的制备方法如下：称取Gibic胰酶干粉（1:250）0.6克、碳酸氢钠0.64克、ETDA二钠0.224克、氯化钠8.9克、氯化钾0.44克和葡萄糖1.1克，然后将它们一起加入到1000ml纯净水内，溶解后经0.1微米滤膜过滤后，取滤液，即为胰酶消化液。。
其中，步骤（3）中将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮、步骤（4）中将细胞团块吹散并使其悬浮、以及步骤（6）中将单层细胞吹至悬浮采用的仪器均为普通移液管。
所述的离心速度为1000rpm，离心时间为5min。
实施例3
一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取日龄为1日龄内的新生健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长8cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；
步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后用眼科剪刀剪下小肠绒毛，接着将小肠绒毛加入到新的冲洗液中，每克小肠绒毛需要17mL冲洗液，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；
步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到温育至37℃的胰酶消化液中，每毫升胰酶消化液中小肠绒毛组织团块的加入量为0.09g；然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，补加胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，13min后，取出，再向其中加入第一培养液，混匀后，将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；
其中，补加的胰酶消化液的体积是原胰酶消化液体积的4倍；第一培养液的加入体积是补加的胰酶消化液体积的1.25倍；
步骤（4），向步骤（3）得到的第一细胞团块中加入第二培养液后，将细胞团块吹散并使其悬浮，第二培养液的加入体积是步骤（3）补加的胰酶消化液体积的0.5倍；接着补加第二培养液，混匀，得到混合液，补加的体积是第一次使用的第二培养液体积的一半；然后将混合液转移到带透气膜的细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；
步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，重新加入第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养，重新加入第二培养液的体积是步骤（4）第一次使用的第二培养液体积的0.75倍；
培养4天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去1/2培养瓶中的培养液，再补加新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；
更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；
步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入胰酶消化液涮洗单层细胞，加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.5倍；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入胰酶消化液，重新加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.25倍，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入第二培养液，第二培养液的加入体积与涮洗单层细胞的胰酶消化液体积相同，并将单层细胞吹至悬浮后，补加第二培养液，补加第二培养液的体积是涮洗单层细胞的胰酶消化液体积的5倍；然后平均分装至两个与原培养瓶相同的培养瓶，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；
其中，步骤（4）和步骤（6）中所述的二氧化碳恒温培养箱内CO2的体积浓度为5%；
所述的冲洗液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液2ml溶解于98ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到97mL的MEM培养基内，即得到冲洗液；
所述的第一培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液2ml溶解于98ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的MEM培养基内，再加入10mL新生犊牛血清后混匀，即得到第一培养液；
所述的第二培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液2ml溶解于98ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的DMEM培养基内，再加入10mL胎牛血清后混匀，即得到第二培养液；
所述的胰酶消化液的制备方法如下：称取Gibic胰酶干粉（1:250）0.6克、碳酸氢钠0.64克、ETDA二钠0.224克、氯化钠8.9克、氯化钾0.44克和葡萄糖1.1克，然后将它们一起加入到1000ml纯净水内，溶解后经0.1微米滤膜过滤后，取滤液，即为胰酶消化液。。
其中，步骤（3）中将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮、步骤（4）中将细胞团块吹散并使其悬浮、以及步骤（6）中将单层细胞吹至悬浮采用的仪器均为普通移液管。
所述的离心速度为1000rpm，离心时间为5min。
实施例4
一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取日龄为1日龄内的新生健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长8cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；
步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后用眼科剪刀剪下小肠绒毛，接着将小肠绒毛加入到新的冲洗液中，每克小肠绒毛需要18mL冲洗液，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；
步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到温育至37℃的胰酶消化液中，每毫升胰酶消化液中小肠绒毛组织团块的加入量为0.09g；然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，补加胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，13min后，取出，再向其中加入第一培养液，混匀后，将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；
其中，补加的胰酶消化液的体积是原胰酶消化液体积的4倍；第一培养液的加入体积是补加的胰酶消化液体积的1.25倍；
步骤（4），向步骤（3）得到的第一细胞团块中加入第二培养液后，将细胞团块吹散并使其悬浮，第二培养液的加入体积是步骤（3）补加的胰酶消化液体积的0.5倍；接着补加第二培养液，混匀，得到混合液，补加的体积是第一次使用的第二培养液体积的一半；然后将混合液转移到带透气膜的细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；
步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，重新加入第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养，重新加入第二培养液的体积是步骤（4）第一次使用的第二培养液体积的0.75倍；
培养4天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去1/2培养瓶中的培养液，再补加新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；
更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；
步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入胰酶消化液涮洗单层细胞，加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.5倍；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入胰酶消化液，重新加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.25倍，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入第二培养液，第二培养液的加入体积与涮洗单层细胞的胰酶消化液体积相同，并将单层细胞吹至悬浮后，补加第二培养液，补加第二培养液的体积是涮洗单层细胞的胰酶消化液体积的5倍；然后平均分装至两个与原培养瓶相同的培养瓶，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；
步骤（7），选取步骤（6）中得到的生长有10代次以内单层细胞的1个培养瓶倾去培养液，加入胰酶消化液涮洗单层细胞，加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.5倍；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入胰酶消化液，重新加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.25倍，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入第一培养液，第一培养液的加入体积与涮洗单层细胞的胰酶消化液体积相同，并将吹单层细胞至悬浮后，补加第一培养液，补加第一培养液的体积是涮洗单层细胞的胰酶消化液体积的3倍，混匀，离心，弃上清，得到第二细胞团块；
步骤（8），将细胞冻存液预冷至4℃，然后将步骤（7）得到的第二细胞团块加入至细胞冻存液中，将单层细胞吹至悬浮后，分装于细胞冻存管内，于4℃静置2h，再转移至冻存盒内，于-80℃过夜，最后转移至液氮长期保存；细胞冻存液的体积为步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.45倍；
其中，步骤（4）、步骤（6）和步骤（7）中所述的二氧化碳恒温培养箱内CO2的体积浓度为5%；
所述的冲洗液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1ml溶解于99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到97mL的MEM培养基内，即得到冲洗液；
所述的第一培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1ml溶解于99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的MEM培养基内，再加入10mL新生犊牛血清后混匀，即得到第一培养液；
所述的第二培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1ml溶解于99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的DMEM培养基内，再加入10mL胎牛血清后混匀，即得到第二培养液；
所述的胰酶消化液的制备方法如下：称取Gibic胰酶干粉（1:250）0.6克、碳酸氢钠0.64克、ETDA二钠0.224克、氯化钠8.9克、氯化钾0.44克和葡萄糖1.1克，然后将它们一起加入到1000ml纯净水内，溶解后经0.1微米滤膜过滤后，取滤液，即为胰酶消化液。。
所述的细胞冻存液的制备方法为：首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1ml溶解于99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL、二甲基亚砜10mL和胎牛血清10mL一起加入到的77mLDMEM培养基内，混匀后，即得到细胞冻存液。
其中，步骤（3）中将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮、步骤（4）中将细胞团块吹散并使其悬浮、以及步骤（6）中将单层细胞吹至悬浮采用的仪器均为普通移液管。
所述的离心速度为1000rpm，离心时间为5min。
实施例5
一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取日龄为1日龄内的新生未吮乳的健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长5cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；
步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后用眼科剪刀剪下小肠绒毛，接着将1.5g小肠绒毛置于50ml无菌离心管管口内壁处，再用30mL新的冲洗液将管壁处的小肠绒毛冲洗落入离心管底部，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；
步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到20mL温育至37℃的胰酶消化液中，然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，转移至300ml无菌三角瓶内，补加80mL胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，10min后，取出，再向其中加入100mL第一培养液，混匀后，10ml大口移液管轻轻将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，滤液分别转移至4个50ml离心管内，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；
步骤（4），分别向步骤（3）中的4个盛有小肠绒毛细胞团块的离心管内加入10mL第二培养液后，用10ml普通移液管将细胞团块吹散并使其悬浮；收集所有离心管内的细胞悬液于一个新的200ml大小的三角瓶内，接着补加20mL第二培养液，混匀，得到混合液；然后将混合液转移到带透气膜的150cm2细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；
步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，以清除掉残留于培养瓶内的死细胞、粘液和组织块，重新加入30mL第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养；
培养3天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去15mL培养瓶中的培养液，再补加15mL新鲜的第二培养液；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入30mL新鲜的第二培养液；
更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；
步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入10mL胰酶消化液涮洗单层细胞；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入5mL胰酶消化液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化3min，加入10mL第二培养液，并用10mL普通移液管将单层细胞吹至悬浮后，补加50mL第二培养液；然后平均分装至2个150cm2细胞培养瓶中，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；本申请制备的猪小肠绒毛上皮原代细胞株可传代至20-30代次以上；
步骤（7），选取步骤（6）中得到的生长有10代次以内单层细胞的1个培养瓶倾去培养液，加入10mL胰酶消化液涮洗单层细胞；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入5mL胰酶消化液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入10mL第一培养液，用10ml普通移液管吹单层细胞至悬浮后，补加30mL第一培养液，混匀，离心，弃上清，得到第二细胞团块；
步骤（8），将细胞冻存液预冷至4℃，然后将步骤（7）得到的第二细胞团块加入至9mL细胞冻存液中，将单层细胞吹至悬浮后，按1.8mL/管分装于细胞冻存管内，于4℃静置2h，再转移至冻存盒内，于-80℃过夜，最后转移至液氮长期保存。
所述的细胞冻存液的制备方法为：首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液2ml溶解于98ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL、二甲基亚砜10mL和胎牛血清20mL一起加入到的67mLDMEM培养基内，混匀后，即得到细胞冻存液。
所述的冲洗液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1ml溶解于99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到97mL的MEM培养基内，即得到冲洗液；
所述的第一培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1ml溶解于99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的MEM培养基内，再加入10mL新生犊牛血清后混匀，即得到第一培养液；
所述的第二培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1ml溶解于99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的DMEM培养基内，再加入10mL胎牛血清后混匀，即得到第二培养液；
所述的胰酶消化液的制备方法如下：称取Gibic胰酶干粉（1:250）0.6克、碳酸氢钠0.64克、ETDA二钠0.224克、氯化钠8.9克、氯化钾0.44克和葡萄糖1.1克，然后将它们一起加入到1000ml纯净水内，溶解后经0.1微米滤膜过滤后，取滤液，即为胰酶消化液。。
其中，步骤（3）中将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮、步骤（4）中将细胞团块吹散并使其悬浮、以及步骤（6）中将单层细胞吹至悬浮采用的仪器均为普通移液管。
所述的离心速度为1000rpm，离心时间为5min。
实施例6
一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取日龄为1日龄内的新生未吮乳的健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长10cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；
步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后用眼科剪刀剪下小肠绒毛，接着将2g小肠绒毛置于50ml无菌离心管管口内壁处，再用30mL新的冲洗液将管壁处的小肠绒毛冲洗落入离心管底部，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；
步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到20mL温育至37℃的胰酶消化液中，然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，转移至300ml无菌三角瓶内，补加80mL胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，15min后，取出，再向其中加入100mL第一培养液，混匀后，10ml大口移液管轻轻将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，滤液分别转移至4个50ml离心管内，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；
步骤（4），分别向步骤（3）中的4个盛有小肠绒毛细胞团块的离心管内加入10mL第二培养液后，用10ml普通移液管将细胞团块吹散并使其悬浮；收集所有离心管内的细胞悬液于一个新的200ml大小的三角瓶内，接着补加20mL第二培养液，混匀，得到混合液；然后将混合液转移到带透气膜的150cm2细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；
步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，以清除掉残留于培养瓶内的死细胞、粘液和组织块，重新加入30mL第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养；
培养5天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去15mL培养瓶中的培养液，再补加15mL新鲜的第二培养液；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入30mL新鲜的第二培养液；
更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；
步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入10mL胰酶消化液涮洗单层细胞；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入5mL胰酶消化液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化5min，加入10mL第二培养液，并用10mL普通移液管将单层细胞吹至悬浮后，补加50mL第二培养液；然后平均分装至2个150cm2细胞培养瓶中，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；本申请制备的猪小肠绒毛上皮原代细胞株可传代至20-30代次以上；
步骤（7），选取步骤（6）中得到的生长有10代次以内单层细胞的1个培养瓶倾去培养液，加入10mL胰酶消化液涮洗单层细胞；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入5mL胰酶消化液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入10mL第一培养液，用10ml普通移液管吹单层细胞至悬浮后，补加30mL第一培养液，混匀，离心，弃上清，得到第二细胞团块；
步骤（8），将细胞冻存液预冷至4℃，然后将步骤（7）得到的第二细胞团块加入至11mL细胞冻存液中，将单层细胞吹至悬浮后，按1.8mL/管分装于细胞冻存管内，于4℃静置2h，再转移至冻存盒内，于-80℃过夜，最后转移至液氮长期保存。
所述的细胞冻存液的制备方法为：首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液3ml溶解于97ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL、二甲基亚砜10mL和胎牛血清15mL一起加入到的72mLDMEM培养基内，混匀后，即得到细胞冻存液。
其中，所述的二氧化碳恒温培养箱内CO2的体积浓度为5%；
所述的冲洗液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液3ml溶解于97ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到97mL的MEM培养基内，即得到冲洗液；
所述的第一培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液3ml溶解于97ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的MEM培养基内，再加入10mL新生犊牛血清后混匀，即得到第一培养液；
所述的第二培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液3ml溶解于97ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的DMEM培养基内，再加入10mL胎牛血清后混匀，即得到第二培养液；
所述的胰酶消化液的制备方法如下：称取Gibic胰酶干粉（1:250）0.6克、碳酸氢钠0.64克、ETDA二钠0.224克、氯化钠8.9克、氯化钾0.44克和葡萄糖1.1克，然后将它们一起加入到1000ml纯净水内，溶解后经0.1微米滤膜过滤后，取滤液，即为胰酶消化液。。
其中，步骤（3）中将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮、步骤（4）中将细胞团块吹散并使其悬浮、以及步骤（6）中将单层细胞吹至悬浮采用的仪器均为普通移液管。
所述的离心速度为1000rpm，离心时间为5min。所述的二氧化碳恒温培养箱内CO2的体积浓度为5%
实施例7
一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），取日龄为1日龄内的新生未吮乳的健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长8cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；
步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后用眼科剪刀剪下小肠绒毛，接着将1.8g小肠绒毛置于50ml无菌离心管管口内壁处，再用30mL新的冲洗液将管壁处的小肠绒毛冲洗落入离心管底部，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；
步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到20mL温育至37℃的胰酶消化液中，然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，转移至300ml无菌三角瓶内，补加80mL胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，12min后，取出，再向其中加入100mL第一培养液，混匀后，10ml大口移液管轻轻将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，滤液分别转移至4个50ml离心管内，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；
步骤（4），分别向步骤（3）中的4个盛有小肠绒毛细胞团块的离心管内加入10mL第二培养液后，用10ml普通移液管将细胞团块吹散并使其悬浮；收集所有离心管内的细胞悬液于一个新的200ml大小的三角瓶内，接着补加20mL第二培养液，混匀，得到混合液；然后将混合液转移到带透气膜的150cm2细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；
步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，以清除掉残留于培养瓶内的死细胞、粘液和组织块，重新加入30mL第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养；
培养4天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去15mL培养瓶中的培养液，再补加15mL新鲜的第二培养液；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入30mL新鲜的第二培养液；
更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；
步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入10mL胰酶消化液涮洗单层细胞；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入5mL胰酶消化液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化4min，加入10mL第二培养液，并用10mL普通移液管将单层细胞吹至悬浮后，补加50mL第二培养液；然后平均分装至2个150cm2细胞培养瓶中，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；本申请制备的猪小肠绒毛上皮原代细胞株可传代至20-30代次以上；
步骤（7），选取步骤（6）中得到的生长有10代次以内单层细胞的1个培养瓶倾去培养液，加入10mL胰酶消化液涮洗单层细胞；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入5mL胰酶消化液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入10mL第一培养液，用10ml普通移液管吹单层细胞至悬浮后，补加30mL第一培养液，混匀，离心，弃上清，得到第二细胞团块；
步骤（8），将细胞冻存液预冷至4℃，然后将步骤（7）得到的第二细胞团块加入至10mL细胞冻存液中，将单层细胞吹至悬浮后，按1.8mL/管分装于细胞冻存管内，于4℃静置2h，再转移至冻存盒内，于-80℃过夜，最后转移至液氮长期保存。
所述的冲洗液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液2ml溶解于98ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到97mL的MEM培养基内，即得到冲洗液；
所述的第一培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液2ml溶解于98ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的MEM培养基内，再加入10mL新生犊牛血清后混匀，即得到第一培养液；
所述的第二培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液2ml溶解于98ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的DMEM培养基内，再加入10mL胎牛血清后混匀，即得到第二培养液；
所述的胰酶消化液的制备方法如下：称取Gibic胰酶干粉（1:250）0.6克、碳酸氢钠0.64克、ETDA二钠0.224克、氯化钠8.9克、氯化钾0.44克和葡萄糖1.1克，然后将它们一起加入到1000ml纯净水内，溶解后经0.1微米滤膜过滤后，取滤液，即为胰酶消化液。。
其中，步骤（3）中将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮、步骤（4）中将细胞团块吹散并使其悬浮、以及步骤（6）中将单层细胞吹至悬浮采用的仪器均为普通移液管。
所述的离心速度为1000rpm，离心时间为5min。所述的二氧化碳恒温培养箱内CO2的体积浓度为5%
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），取日龄为1日龄内的新生健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长5-10cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；
步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后剪下小肠绒毛，将小肠绒毛加入到新的冲洗液中，每克小肠绒毛需要15-20mL冲洗液，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；
步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到温育至37℃的胰酶消化液中，每毫升胰酶消化液中小肠绒毛组织团块的加入量为0.075-0.1g；然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，补加胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，10-15min后，取出，再向其中加入第一培养液，混匀后，将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；
其中，补加的胰酶消化液的体积是原胰酶消化液体积的4倍；第一培养液的加入体积是补加的胰酶消化液体积的1.25倍；
步骤（4），向步骤（3）得到的第一细胞团块中加入第二培养液后，将细胞团块吹散并使其悬浮，第二培养液的加入体积是步骤（3）补加的胰酶消化液体积的0.5倍；接着补加第二培养液，混匀，得到混合液，补加的体积是第一次使用的第二培养液体积的一半；然后将混合液转移到带透气膜的细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；
步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，重新加入第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养，重新加入第二培养液的体积是步骤（4）第一次使用的第二培养液体积的0.75倍；
培养3-5天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去1/2培养瓶中的培养液，再补加新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；
更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；
步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入胰酶消化液涮洗单层细胞，加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.5倍；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入胰酶消化液，重新加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.25倍，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入第二培养液，第二培养液的加入体积与涮洗单层细胞的胰酶消化液体积相同，并将单层细胞吹至悬浮后，补加第二培养液，补加第二培养液的体积是涮洗单层细胞的胰酶消化液体积的5倍；然后平均分装至两个与原培养瓶相同的培养瓶，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；
其中，步骤（4）和步骤（6）中所述的二氧化碳恒温培养箱内CO2的体积浓度为5%；
所述的冲洗液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1-3ml溶解于97-99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到97mL的MEM培养基内，即得到冲洗液；
所述的第一培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1-3ml溶解于97-99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的MEM培养基内，再加入10mL新生犊牛血清后混匀，即得到第一培养液；
所述的第二培养液的制备方法如下：
首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1-3ml溶解于97-99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87mL的DMEM培养基内，再加入10mL胎牛血清后混匀，即得到第二培养液；
所述的胰酶消化液的制备方法如下：称取Gibic胰酶干粉（1:250）0.6克、碳酸氢钠0.64克、ETDA二钠0.224克、氯化钠8.9克、氯化钾0.44克和葡萄糖1.1克，然后将它们一起加入到1000ml纯净水内，溶解后经0.1微米滤膜过滤后，取滤液，即为胰酶消化液。
2.根据权利要求1所述的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的剪下小肠绒毛采用的是眼科剪刀。
3.根据权利要求1所述的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，其特征在于，步骤（3）中将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮采用大口移液管；步骤（4）中将细胞团块吹散并使其悬浮以及步骤（6）中将单层细胞吹至悬浮采用的仪器均为普通移液管。
4.根据权利要求1所述的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
步骤（7），选取步骤（6）中得到的生长有10代次以内单层细胞的1个培养瓶倾去培养液，加入胰酶消化液涮洗单层细胞，加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.5倍；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入胰酶消化液，重新加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.25倍，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入第一培养液，第一培养液的加入体积与涮洗单层细胞的胰酶消化液体积相同，并将吹单层细胞至悬浮后，补加第一培养液，补加第一培养液的体积是涮洗单层细胞的胰酶消化液体积的3倍，混匀，离心，弃上清，得到第二细胞团块；
步骤（8），将细胞冻存液预冷至4℃，然后将步骤（7）得到的第二细胞团块加入至细胞冻存液中，将单层细胞吹至悬浮后，分装于细胞冻存管内，于4℃静置2h，再转移至冻存盒内，于-80℃过夜，最后转移至液氮长期保存；
其中，细胞冻存液的体积为步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.45-0.55倍；所述的二氧化碳恒温培养箱内CO2的体积浓度为5%；
所述的细胞冻存液的制备方法为：首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1-3ml溶解于97-99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；
接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000IU/mL青霉素溶液1mL和40000μg/mL链霉素溶液1mL、二甲基亚砜10mL和胎牛血清10-20mL一起加入到的DMEM培养基内，控制总体积为100mL，混匀后，即得到细胞冻存液。
5.根据权利要求1-4所述的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，其特征在于，所述的离心速度为1000rpm，离心时间为5min。
6.根据权利要求1所述的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），取日龄为1日龄内的新生健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长5-10cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；
步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后剪下小肠绒毛，接着将1.5-2g小肠绒毛加入到30mL新的冲洗液中，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；
步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到20mL温育至37℃的胰酶消化液中，然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，补加80mL胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，10-15min后，取出，再向其中加入100mL第一培养液，混匀后，将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；
步骤（4），向步骤（3）得到的第一细胞团块中加入到40mL第二培养液后，将细胞团块吹散并使其悬浮；接着补加20mL第二培养液，混匀，得到混合液；然后将混合液转移到带透气膜的150cm2细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；
步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，重新加入30mL第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养；
培养3-5天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去15mL培养瓶中的培养液，再补加15mL新鲜的第二培养液；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入30mL新鲜的第二培养液；
更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；
步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入10mL胰酶消化液涮洗单层细胞；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入5mL胰酶消化液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层3-5min，加入10mL第二培养液，并将单层细胞吹至悬浮后，补加50mL第二培养液；然后平均分装至2个150cm2细胞培养瓶中，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；
步骤（7），选取步骤（6）中得到的生长有10代次以内单层细胞的1个培养瓶倾去培养液，加入10mL胰酶消化液涮洗单层细胞；
涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入5mL胰酶消化液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入10mL第一培养液，并将吹单层细胞至悬浮后，补加30mL第一培养液，混匀，离心，弃上清，得到第二细胞团块；
步骤（8），将细胞冻存液预冷至4℃，然后将步骤（7）得到的第二细胞团块加入至9-11mL细胞冻存液中，将单层细胞吹至悬浮后，按1.8mL/管分装于细胞冻存管内，于4℃静置2h，再转移至冻存盒内，于-80℃过夜，最后转移至液氮长期保存。
7.根据权利要求1所述的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，其特征在于，所述的日龄为1日龄内的新生健康仔猪为未吮乳的新生仔猪。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114703136A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-07-05 | 广东省农业科学院动物科学研究所 | 一种初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法 |
| CN114703136B (zh) * | 2022-06-02 | 2022-08-19 | 广东省农业科学院动物科学研究所 | 一种初生仔猪肠道神经元的分离和原代培养方法 |
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| CN105219702B (zh) | 2020-03-31 |
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