CN114703123B - 一种通过调节NGN3表达促进iPSC向胰岛细胞分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种通过调节NGN3表达促进iPSC向胰岛细胞分化的方法。具体地，本发明通过在诱导细胞分化过程中梯度浓度添加重组人激活素A(Activin A)和添加CK‑666上调NGN3的表达，促进iPSC向胰岛细胞分化。

Description

一种通过调节NGN3表达促进iPSC向胰岛细胞分化的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种通过调节NGN3表达促进iPSC向胰岛细胞分化的方法。
背景技术
胰岛β细胞（即胰岛B细胞）是胰岛细胞的一种，属内分泌细胞，约占胰岛细胞总数的70%，主要位于胰岛中央部，能分泌胰岛素，起调节血糖含量的作用。胰岛β细胞功能受损，胰岛素分泌绝对或相对不足，会引发糖尿病，其中1型糖尿病的病因主要就是由于患者自身免疫***的缺陷对产生胰岛素的胰岛β细胞造成破坏，导致身体无法产生足够的胰岛素。
胰岛细胞移植作为治疗糖尿病的方法，在以基础研究为指导的临床应用中，相对于胰腺移植、胰岛移植表现出独特的优势，但是其远期效果不尽理想。目前主要靠从脑死亡供体获得胰岛细胞移植给患者，但由于个体差异，从每个供体获得的胰岛细胞数量并不稳定，一般需要2-3个供体提取的胰岛细胞移植给一名患者，且由于排斥反应和胰岛血供、氧供不足等问题，移植到体内的胰岛细胞会随着时间不断流失。也就是说，胰岛细胞移植面临远期效果差和供体器官严重短缺的挑战。
因此，开发iPSC细胞分化为胰岛β细胞的方法为糖尿病的细胞疗法提供了广阔前景。目前的分化方案通常使用各种生长因子或小分子来模拟胰腺β细胞的发育，并通过各种中间状态（定型内胚层、原始肠管、后前肠、胰腺祖细胞和内分泌祖细胞）逐渐诱导iPSC生成胰岛素产生细胞（胰岛β细胞）。但目前诱导胰岛β细胞面临问题，主要包括：1，生成β细胞效率较低；2，生成的细胞通常是异质性的，含有许多不需要的细胞类型，包括大量的胰岛素和胰高血糖素双激素阳性细胞。
Ngn3位于10号染色体上，是由214个氨基酸组成的多肽序列，属于碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，BHLH）结构类转录因子，它是内分泌干细胞基因转录的激活因子。在胰腺发育中，胰腺内的小部分胰腺干细胞表达Ngn3后，分化成为具有内分泌作用的胰岛细胞，聚集形成胰岛。NGN3对胰腺内分泌细胞的发育及分化至关重要，被认为是胰腺祖细胞的标志蛋白。
所以通过调节NGN3表达对促进iPSC向胰岛细胞分化，从而制备大量胰岛细胞并应用于临床治疗糖尿病具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于通过精准的调控NGN3的表达，提高iPSC向胰腺祖细胞分化效率，降低双激素（胰岛素和胰高血糖素双激素）阳性细胞比例，提高胰岛细胞成熟度。
本发明的诱导方案中包括1）梯度添加重组人激活素A（Activin A），梯度浓度即第一天115ng/mL，第二天110ng/mL，第三天100ng/mL，可有效提高NGN3的表达，增加iPSC向胰腺祖细胞分化效率；2）添加CK-666，抑制细胞黏附，进一步上调NGN3表达，促进iPSC向胰岛细胞分化。
培养基组合
第一方面，本发明提供了一种培养基组合，所述培养基组合包括以下培养基：
1）第一培养基A：由重组人激活素A（Activin A）、CHIR-99021、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、葡萄糖、谷氨酰胺（GlutaMax）、碳酸氢钠、基础培养基组成；
优选地，所述重组人激活素A的工作浓度为115ng/mL，所述CHIR-99021的工作浓度为3µM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
2）第一培养基B：由重组人激活素A（Activin A）、CHIR-99021、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、葡萄糖、谷氨酰胺（GlutaMax）、碳酸氢钠、基础培养基组成；
优选地，所述重组人激活素A的工作浓度为110ng/mL，所述CHIR-99021的工作浓度为3µM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
3）第一培养基C：由重组人激活素A（Activin A）、CHIR-99021、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、葡萄糖、谷氨酰胺（GlutaMax）、碳酸氢钠、基础培养基组成；
优选地，所述重组人激活素A的工作浓度为100ng/mL，所述CHIR-99021的工作浓度为3µM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
4）第二培养基：由抗坏血酸、成纤维细胞生长因子7（FGF-7）、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、葡萄糖、谷氨酰胺（GlutaMax）、碳酸氢钠、基础培养基MCDB131组成；
优选地，所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述成纤维细胞生长因子7（FGF-7）的工作浓度为50ng/mL，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
5）第三培养基：由抗坏血酸、成纤维细胞生长因子7（FGF-7）、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物TPPB、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、葡萄糖、谷氨酰胺（GlutaMax）、碳酸氢钠、基础培养基MCDB131组成；
优选地，所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述成纤维细胞生长因子7（FGF-7）的工作浓度为50ng/mL，所述SANT-1的工作浓度为0.25µM，所述视黄酸的工作浓度为1µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述蛋白激酶C活化物TPPB的工作浓度为200nM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为2.5g/L；
6）第四培养基：由抗坏血酸、成纤维细胞生长因子7（FGF-7）、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物TPPB、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、葡萄糖、谷氨酰胺（GlutaMax）、碳酸氢钠、基础培养基MCDB131组成；
优选地，所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述成纤维细胞生长因子7（FGF-7）的工作浓度为2ng/mL，所述SANT-1的工作浓度为0.25µM，所述视黄酸的工作浓度为1µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述蛋白激酶C活化物TPPB的工作浓度为200nM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为2.5g/L；
7）第五培养基：SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、基础培养基MCDB131组成；
优选地，所述SANT-1浓度的工作浓度为0.25µM，所述视黄酸的工作浓度为0.1µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM，所述ALK5抑制剂ALK5i II的工作浓度为10µM，所述硫酸锌的工作浓度为10µM，所述肝素的工作浓度为10µg/mL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；
优选地，所述培养基组合还包括以下培养基：
8）第六培养基A：由细胞黏附抑制剂CK-666、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂GSi-XX、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、基础培养基MCDB131组成；
优选地，所述培养基中CK-666的工作浓度为100µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%；所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM；所述ALK5抑制剂ALK5i II的工作浓度为10µM；所述硫酸锌的工作浓度为10 µM；所述γ-分泌酶抑制剂GSi-XX的工作浓度为100nM，所述肝素的工作浓度为10µg/mL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；
9）第六培养基B：由LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂GSi-XX、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、基础培养基MCDB131组成；
优选地，所述培养基中LDN193189的工作浓度为100nM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%；所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM；所述ALK5抑制剂ALK5i II的工作浓度为10µM；所述硫酸锌的工作浓度为10µM；所述γ-分泌酶抑制剂GSi-XX的工作浓度为100nM，所述肝素的浓度的工作浓度为10µg/mL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；
10）第六培养基C：由LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、基础培养基MCDB131组成；
优选地，所述LDN193189的工作浓度为100nM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%；所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM；所述ALK5抑制剂ALK5iII的工作浓度为10µM；所述硫酸锌的工作浓度为10µM；所述肝素的工作浓度为10ug/mL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；
优选地，所培养基组合中还包括第七培养基，所述第七培养基：由胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、肝素、乙酰-l-半胱氨酸(N-Cys)、水溶性维生素E和Axl抑制剂R428、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、基础培养基MCDB131组成。
优选地，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM，所述ALK5抑制剂ALK5i II的工作浓度为10µM，所述硫酸锌的工作浓度为10µM，所述肝素的工作浓度为10µg/mL，所述乙酰-l-半胱氨酸(N-Cys)的工作浓度为1mM，所述水溶性维生素E的工作浓度为10µM，所述Axl抑制剂R428的工作浓度为2µM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%。
优选地，以上任一培养基中碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、基础培养基MCDB131为常见的培养基组成，本领域人员根据公知常识可任意更换、调整为其他相近的成分。
优选地，本发明所述基础培养基MCDB131是不含谷氨酰胺的培养基，更具体的如本发明实施例所使用的是Gibco货号为10372019是产品。所述MCDB131 培养基不含蛋白质或生长因子，本领域技术人员可购买商品化培养基或自行配制。
试剂盒
另一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包含配制 前述任意一种培养基或多种培养基组成的培养基组合所需要的试剂。
优选地，所述试剂盒中包括以下任意一种或多种试剂：
重组人激活素A（Activin A）、CHIR-99021、坏血酸、成纤维细胞生长因子7（FGF-7）、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物TPPB、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、肝素、CK-666、γ-分泌酶抑制剂GSi-XX、乙酰-l-半胱氨酸(N-Cys)、维生素E、R428、BSA、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠。
应用
另一方面，本发明提供了前述培养基组合、前述试剂盒在诱导干细胞分化为成熟或未成熟的胰腺β细胞的应用。
另一方面本发明提供了细胞黏附抑制剂CK-666和重组人激活素A在诱导成熟或未成熟的胰腺β细胞、提高胰腺祖细胞的标志基因表达量、提高胰腺β细胞的标志基因表达量中的应用。
优选地，所述胰腺祖细胞的标志基因包括NGN3。
优选地，所述胰腺β细胞的标志基因包括GCG、INS、MAFA、NKX6.1。
优选地，所述干细胞是iPSC细胞。
方法
另一方面，本发明还提供了一种诱导成熟或未成熟的胰腺β细胞的方法，所述方法包括以下至少一个步骤：
1）使用前述第一培养基A培养1天，
2）使用前述第一培养基B培养1天，
3）使用前述第一培养基C培养1天，
4）使用前述第二培养基培养2天，
5）使用前述第三培养基培养2天，
6）使用前述第四培养基培养3天，
7）使用前述第五培养基培养3天，
8）使用前述第六培养基A培养1天，
9）使用前述第六培养基B培养6天，
10）使用前述第六培养基C培养7天，
优选地，所述诱导成熟胰腺β细胞的方法还包括使用前述第七培养基培养15天。
优选地，所述培养时间仅给出最优方案，本领域技术人员可根据细胞的状态进行调整。
优选地，所述成熟胰腺β细胞是NGN3高表达的成熟胰腺β细胞。
更优选地，所述成熟胰腺β细胞是GCG、INS、MAFA、NKX6.1高表达的成熟胰腺β细胞。
优选地，所述表达包括mRNA表达量或蛋白表达量；如实施例1证明了所述标志物mRNA的表达量升高。
优选地，所述成熟或未成熟的胰腺β细胞来源于iPSC细胞。
优选地，所述iPSC细胞是经以下方法处理得到的：
1）iPSC聚合度达到70–80%后用DPBS洗2遍，随后用TrypLE Express消化；
2）用DMEM/F12按5:1比例中和后离心；
3）用E8完全培养基+10μM Y-27632重悬铺种，细胞板提前用Matrigel包被。
更具体的iPSC细胞处理方法如本发明具体实施例所应用的。
优选地，所述方法是诱导高表达NGN3的胰腺β细胞的方法。
优选地，所述方法中需每天更换培养基。
细胞
另一方面，本发明提供了一种由前述方法制备得到的高表达NGN3的细胞。
优选地，所述细胞是成熟或未成熟的胰腺β细胞。
另一方面，本发明提供了上述高表达NGN3的细胞在制备治疗糖尿病药物中的应用。
优选地，所述糖尿病是1型糖尿病。
附图说明
图1是本发明所使用的培养基汇总。
图2是本发明所述诱导胰腺β细胞的流程图。
图3是使用重组人激活素A或不使用重组人激活素A对NGN3表达量影响的对比结果图。
图4是使用CK-666或不使用CK-666对NGN3表达量影响的对比结果图。
图5是同时使用重组人激活素A和CK-666对胰腺β细胞标志物GCG、INS、MAFA、NKX6.1影响的统计结果图，A：GCG，B：INS，C：MAFA，D：NKX6.1。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、不同诱导胰岛细胞分化的方法比较
本发明所涉及的实验材料如以下表1所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
方法一：重组人激活素A（梯度）和CK-666联合
（所涉及的培养基统计如图1所示，流程如图2所示）
iPSCs聚合度达到70–80%后用DPBS洗2遍，随后用TrypLE Express消化3-5min，37℃。用DMEM/F12按5:1比例中和后离心，200g，5min。用E8完全培养基+10μM Y-27632重悬铺种，密度约1.8-2.2×105 cells/cm2。12孔细胞板提前24-48小时用0.13-0.2mg/mLMatrigel包被。
第一阶段
iPSCs（根据本公司先前专利申请201910110768.7 中的方法制备）向定型内胚层分化，由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、重组人激活素A（Activin A）和CHIR-99021组成（在本发明中称为第一培养基或阶段一培养基）。
在该培养基中：重组人激活素A浓度分别为115ng/mL（阶段一培养基A）、110ng/mL（阶段一培养基B）、100ng/mL（阶段一培养基C），CHIR-99021为3µM，胎牛白蛋白为0.5%，葡萄糖为10mM，谷氨酰胺为2mM，碳酸氢钠为1.5g/L。
第一阶段诱导的时间为3天，诱导第1天使用阶段一培养基A；诱导第2天，使用阶段一培养基B，诱导第3天使用阶段一培养基C，每天更换新鲜培养基。
第二阶段
诱导定型内胚层细胞向原始肠管分化，由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、抗坏血酸和成纤维细胞生长因子7（FGF-7）组成（在本发明中称为第二培养基或阶段二培养基）。
在该培养基中：抗坏血酸浓度为0.25mM，成纤维细胞生长因子7（FGF-7）为50ng/mL，胎牛白蛋白为0.5%，葡萄糖为10mM，谷氨酰胺为2mM，碳酸氢钠为1.5g/L。
第二阶段诱导的时长为2天，在诱导第4-5天，每天更换新鲜培养基。
第三阶段
诱导原始肠管细胞向后前肠细胞分化，由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子7（FGF-7）、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂和蛋白激酶C活化物TPPB组成（在本发明中称为第三培养基或阶段三培养基）。
在该培养基中：抗坏血酸浓度为0.25mM，成纤维细胞生长因子7（FGF-7）为50ng/mL，SANT-1为0.25µM，视黄酸为1µM，LDN193189为100nM，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂为0.5%，蛋白激酶C活化物TPPB为200nM，胎牛白蛋白为2%，葡萄糖为10mM，谷氨酰胺为2mM，碳酸氢钠为2.5g/L。
第三阶段，诱导的时长为2天，在诱导第6-7天，每天更换新鲜培养基。
第四阶段
诱导后前肠细胞向胰腺祖细胞分化，由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子7（FGF-7）、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂和蛋白激酶C活化物TPPB组成（在本发明中称为第四培养基或阶段四培养基）。
在该培养基中：抗坏血酸浓度为0.25mM，成纤维细胞生长因子7（FGF-7）为2ng/mL，SANT-1为0.25µM，视黄酸为1µM，LDN193189为100nM，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂为0.5%，蛋白激酶C活化物TPPB为200nM，胎牛白蛋白为2%，葡萄糖为10mM，谷氨酰胺为2mM，碳酸氢钠为2.5g/L。
第四阶段诱导的时长为3天，在诱导第8-10天，每天更换新鲜培养基。
第五阶段
由胰腺祖细胞向内分泌祖细胞分化，由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌和肝素组成（在本发明中称为第五培养基或阶段五培养基）。
在该培养基中：SANT-1浓度为0.25µM，视黄酸为0.1µM，LDN193189为100nM，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂为0.5%，三碘甲状腺原氨酸为1µM，ALK5抑制剂ALK5i II为10µM，硫酸锌为10µM，肝素为10ug/mL，碳酸氢钠为1.5g/L，谷氨酰胺为2mM，葡萄糖20mM，胎牛白蛋白为2%。
第五阶段诱导的时长为3天，在诱导第11-13天，每天更换新鲜培养基。
第六阶段
诱导内分泌祖细胞向未成熟β细胞分化，由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、细胞黏附抑制剂CK-666、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂GSi-XX和肝素组成（在本发明中称为第六培养基或阶段六培养基）。
在该培养基中：CK-666为100µM，LDN193189为100nM，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂为0.5%，三碘甲状腺原氨酸为1µM，ALK5抑制剂ALK5i II为10µM，硫酸锌为10µM，γ-分泌酶抑制剂GSi-XX为100nM，肝素为10ug/mL，碳酸氢钠为1.5g/L，谷氨酰胺为2mM，葡萄糖20mM，胎牛白蛋白为2%。
第六阶段诱导的时长为14天。
在诱导第14天，培养基中CK-666的浓度为100µM，LDN193189的浓度为100nM；胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5%；三碘甲状腺原氨酸的浓度为1µM；ALK5抑制剂ALK5i II的浓度为10µM；硫酸锌的浓度为10µM；γ-分泌酶抑制剂GSi-XX为100nM，肝素的浓度为10ug/mL。在诱导第15天采用细胞刮将细胞铺种到低亲附性6孔培养板中。
在诱导第15-20天，培养基中LDN193189的浓度为100nM；胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5%；三碘甲状腺原氨酸的浓度为1µM；ALK5抑制剂ALK5i II的浓度为10µM；硫酸锌的浓度为10µM；γ-分泌酶抑制剂GSi-XX为100nM，肝素的浓度为10ug/mL。
在诱导第21-27天，培养基中LDN193189的浓度为100nM；胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5%；三碘甲状腺原氨酸的浓度为1µM；ALK5抑制剂ALK5i II的浓度为10µM；硫酸锌的浓度为10µM；肝素的浓度为10ug/mL，即：诱导第14天使用阶段六培养基A，诱导第15-20天使用阶段六培养基B，在诱导第21-27天使用阶段六培养基C，每天更换新鲜培养基。
第七阶段
诱导未成熟β细胞向成熟β细胞分化，由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺（GlutaMax）、葡萄糖、脱脂BSA（胎牛白蛋白）（BSA）、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、肝素、乙酰-l-半胱氨酸(N-Cys)、水溶性维生素E和Axl抑制剂R428组成（在本发明中称为第七培养基或阶段七培养基）。
在该培养基中：胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂为0.5%，三碘甲状腺原氨酸为1µM，ALK5抑制剂ALK5i II为10µM，硫酸锌为10µM，肝素为10ug/mL，乙酰-l-半胱氨酸(N-Cys)为1mM，水溶性维生素E为10µM，Axl抑制剂R428为2µM，碳酸氢钠为1.5g/L，谷氨酰胺为2mM，葡萄糖20mM，胎牛白蛋白为2%。
第七阶段诱导的时长为14天，在诱导第28-35天，每天更换新鲜培养基。
方法二：重组人激活素A（梯度）单独作用
第一至四、五、七阶段与方法一相同，在第六阶段中不添加CK-666。
方法三：使用固定浓度的重组人激活素A和CK-666
第二至七阶段与方法一相同，在第一阶段中添加固定浓度为100ng/mL的重组人激活素A1。
方法四：对照组
第一阶段中添加固定浓度为100ng/mL的重组人激活素A，第六阶段中不加CK-666。
对以上不同方法制备得到的细胞进行比较
1、分别按照方法二和方法四制备细胞，在培养的第13天（也即完成前5个阶段的培养）检测NGN3表达水平，结果如图3所示：
重组人激活素A梯度作用组的胰腺祖细胞标志基因NGN3表达增加约4.5倍，由此得出结论：在诱导第一阶段梯度添加重组人激活素A，可显著增加NGN3表达水平，促进iPSC向胰腺祖细胞分化；
2、分别按照方法三和方法四制备细胞，在培养的第14天检测NGN3表达水平，结果如图4所示：
CK-666作用组的NGN3 mRNA水平较无CK-666作用组增加2.5倍，由此得出结论：在诱导Day14，使用100µM CK-666作用24小时，可显著增加NGN3表达水平，促进iPSC向胰腺祖细胞分化；
3、将方法一和方法四所制备得到的细胞进行比较，检测GCG、INS、MAFA、NKX6.1mRNA的表达水平，结果如图5所示：
重组人激活素A梯度作用联合CK-666诱导至Day35，INS、GCG、MAFA、NKX6.1 mRNA的表达水平均高于无CK-666作用组，分别增加2.2倍、1.6倍、22倍和123倍。
由此得出结论：在诱导Day1-3梯度添加重组人激活素A且Day14使用100µM CK-666作用24小时，可促进胰岛细胞成熟。

Claims (8)

1.一种培养基组合物，所述培养基组合物由以下培养基组成：
1）第一培养基A：由重组人激活素A、CHIR-99021、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；
所述重组人激活素A的工作浓度为115ng/mL，所述CHIR-99021的工作浓度为3µM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
2）第一培养基B：由重组人激活素A、CHIR-99021、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；
所述重组人激活素A的工作浓度为110ng/mL，所述CHIR-99021的工作浓度为3µM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
3）第一培养基C：由重组人激活素A、CHIR-99021、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；
所述重组人激活素A的工作浓度为100ng/mL，所述CHIR-99021的工作浓度为3µM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
4）第二培养基：由抗坏血酸、FGF-7、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；
所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述FGF-7的工作浓度为50ng/mL，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
5）第三培养基：由抗坏血酸、FGF-7、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物TPPB、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；
所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述FGF-7的工作浓度为50ng/mL，所述SANT-1的工作浓度为0.25µM，所述视黄酸的工作浓度为1µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述蛋白激酶C活化物TPPB的工作浓度为200nM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为2.5g/L；
6）第四培养基：由抗坏血酸、FGF-7、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物TPPB、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；
所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述FGF-7的工作浓度为2ng/mL，所述SANT-1的工作浓度为0.25µM，所述视黄酸的工作浓度为1µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述蛋白激酶C活化物TPPB的工作浓度为200nM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为2.5g/L；
7）第五培养基：SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、基础培养基组成；
所述SANT-1浓度的工作浓度为0.25µM，所述视黄酸的工作浓度为0.1µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM，所述ALK5抑制剂ALK5i II的工作浓度为10µM，所述硫酸锌的工作浓度为10µM，所述肝素的工作浓度为10µg/mL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；
8）第六培养基A：由细胞黏附抑制剂CK-666、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂GSi XX、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、基础培养基组成；
所述培养基中CK-666的工作浓度为100µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%；所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM；所述ALK5抑制剂ALK5i II的工作浓度为10µM；所述硫酸锌的工作浓度为10 µM；所述γ-分泌酶抑制剂GSi XX的工作浓度为100nM，所述肝素的工作浓度为10µg/mL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；
9）第六培养基B：由LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂GSi XX、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、基础培养基组成；
所述培养基中LDN193189的工作浓度为100nM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%；所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM；所述ALK5抑制剂ALK5i II的工作浓度为10µM；所述硫酸锌的工作浓度为10µM；所述γ-分泌酶抑制剂GSi XX的工作浓度为100nM，所述肝素的浓度的工作浓度为10µg/mL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；
10）第六培养基C：由LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、基础培养基组成；
所述LDN193189的工作浓度为100nM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%；所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM；所述ALK5抑制剂ALK5i II的工作浓度为10µM；所述硫酸锌的工作浓度为10µM；所述肝素的工作浓度为10ug/mL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；
11）第七培养基，所述第七培养基：由胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、肝素、乙酰-l-半胱氨酸、水溶性维生素E和Axl抑制剂R428、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、基础培养基组成；
所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM，所述ALK5抑制剂ALK5i II的工作浓度为10µM，所述硫酸锌的工作浓度为10µM，所述肝素的工作浓度为10µg/mL，所述乙酰-l-半胱氨酸的工作浓度为1mM，所述水溶性维生素E的工作浓度为10µM，所述Axl抑制剂R428的工作浓度为2µM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；
所述基础培养基是MCDB131。
2.一种试剂盒，所述试剂盒中包含配制 权利要求1所述培养基组合物所需要的试剂。
3.权利要求1所述培养基组合物或权利要求2所述的试剂盒在制备诱导iPSC细胞分化为成熟的胰腺β细胞的产品的应用。
4.一种非治疗目的的诱导iPSC细胞分化为成熟的胰腺β细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
1）使用权利要求1所述第一培养基A培养1天，
2）使用权利要求1所述第一培养基B培养1天，
3）使用权利要求1所述第一培养基C培养1天，
4）使用权利要求1所述第二培养基培养2天，
5）使用权利要求1所述第三培养基培养2天，
6）使用权利要求1所述第四培养基培养3天，
7）使用权利要求1所述第五培养基培养3天，
8）使用权利要求1所述第六培养基A培养1天，
9）使用权利要求1所述第六培养基B培养6天，
10）使用权利要求1所述第六培养基C培养7天；
11）使用权利要求1所述第七培养基培养14天。
5.如权利要求4所述的方法，所述成熟胰腺β细胞是NGN3高表达的胰腺β细胞。
6.如权利要求4所述的方法，所述成熟胰腺β细胞是GCG、INS、MAFA、NKX6.1高表达的成熟胰腺β细胞。
7.如权利要求5或6所述的方法，所述表达包括mRNA表达量或蛋白表达量。
8.如权利要求4所述的方法，所述iPSC细胞是经以下方法处理得到的：
1）iPSC聚合度达到70-80%后用DPBS洗2遍，随后用TrypLE Express消化；
2）用DMEM/F12按5:1比例中和后离心；
3）用E8完全培养基+10μM Y-27632重悬铺种，细胞板提前用Matrigel包被。
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