CN114689750B - 蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位hplc指纹图谱的构建方法 - Google Patents

蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位hplc指纹图谱的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位HPLC指纹图谱的构建方法。所述HPLC的色谱条件包括色谱柱为C18色谱柱；流动相B为乙腈，流动相C为水；采用线性梯度洗脱，检测波长：210nm～225nm；流速为0.5～1.5mL/min；柱温：30～35℃；进样量5～15μL。本发明首次建立了精密度、稳定性和重现性良好的蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位提取物的HPLC指纹图谱，同时结合成分含量测定结果，能够对蒙古扁桃及其近缘种的质量进行更加全面地控制。

Description

蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位HPLC指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明属于医药检测技术领域，具体而言，涉及一种蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位HPLC指纹图谱的构建方法。
背景技术
扁桃(Amygdalus communis L.)又名巴旦杏，为蔷薇科桃属扁桃亚属的落叶乔木或灌木，其原生产于中亚地区的山区，如今在中国新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区、甘肃省、陕西省等地均有分布，是世界著名的木本油料树种之一，属于国家濒危保护植物。目前我国有扁桃野生种6种，包括普通扁桃(Amygdalus commacis L.)、蒙古扁桃(Amygdalusmongolica(Maxim.)Ricker)、长梗扁桃(Amygdalus pedunculata Pall.长柄扁桃)、榆叶梅(Amygdalus triloba(Lindl.)Ricker)、西康扁桃(Amygdalus tangutica(Batal.)Korsh.唐古特扁桃)和矮扁桃(Amygdalus nana L.康定樱桃)。其种仁可代“郁李仁”入药，具有止咳活血、治疗支气管炎、预防癌症、润肠通便以及利尿的功效，同时在抗氧化、降血脂等方面也效果显著。且含有丰富的脂肪油(约占50％以上)、维生素、苦杏仁苷、蛋白质和氨基酸等，营养价值极高，既可入药也可作为保健食品，是集社会、经济效益为一体的优良树种。
现有技术对蒙古扁桃和长梗扁桃的药理作用进行了大量研究：吴桐等研究表明蒙古扁桃药材正丁醇提取物具有改善大鼠肝纤维化、保护肝脏的作用；权博文等研究表明蒙古扁桃药材正丁醇部位提取物是发挥抗大鼠肺纤维化的有效活性部位；常虹和刘庆等研究表明蒙古扁桃药材正丁醇提取物可明显改善大鼠肾纤维化。赵云山和白迎春等研究表明蒙古扁桃和长梗扁桃药材种仁正丁醇部位提取物具有降血脂的作用，并首次从中提取出苦杏仁苷单体化合物。
中药成分复杂，利用一定的方法对其药品质量的一致性和稳定性进行全面的分析和评价是十分重要的。中药指纹图谱是一种综合、可量化的鉴定手段，包括高效液相色谱法(HPLC)、红外光谱法(IR)、核磁共振法(NMR)等鉴定方法，广泛应用于中药质量控制、真伪鉴别和谱效关系研究，并在以上领域发挥了独特的优势。因此中药指纹图谱的建立，对提高中药品质，促进中药现代化发展意义重大。权博文等首次建立了扁桃的HPLC指纹图谱，为评价扁桃药材的质量提供了一定的方法依据，但对其发挥药效的活性部位的指纹图谱鲜有研究。
发明内容
为扁桃药材的鉴定、药材质量控制提供更加全面的实验依据，本发明提供了一种蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位HPLC指纹图谱的构建方法。
本发明以内蒙古包头固阳忽鸡沟、内蒙古包头爬榆树、内蒙古包头九峰山、内蒙古阿拉善左旗巴彦诺日公、内蒙古包头赵长城、河北省张家口和内蒙古包头市7种产地的10批扁桃药材为研究对象，进一步对其种仁正丁醇部位进行了HPLC指纹图谱研究并对其相似度进行分析，同时利用该方法对扁桃种仁正丁醇提取物中的苦杏仁苷进行了含量测定，以更加科学、全面、深入地评价蒙古扁桃及其近缘种药材的质量与品质。
一种蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)供试品溶液的制备
称取扁桃种仁研碎过筛的粗粉，加5-15倍量乙醇回流提取，提取液回收乙醇并浓缩为稠浸膏；将稠浸膏加水溶解，之后将溶液加石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇各萃取1-5次，将各萃取液浓缩至干得各部位提取物；称取正丁醇部位提取物，加甲醇溶解，超声处理，冷却，摇匀后取溶液适量，离心，取上清，用微孔滤膜滤过，即得扁桃药材正丁醇部位提取物供试品溶液；
2)标准品溶液的制备
称取苦杏仁苷对照品，用甲醇溶解、稀释，摇匀，即得苦杏仁苷标准品溶液；称取野黑樱苷对照品，用甲醇溶解、稀释，摇匀，即得野黑樱苷标准品溶液；
3)HPLC色谱条件
色谱柱为C18色谱柱；流动相为乙腈(B)-水(C)；采用线性梯度洗脱，检测波长：210nm～225nm；流速为0.5～1.5mL/min；柱温：30～35℃；进样量5～15μL。
进一步的，所述步骤1)的具体方法为：
将扁桃种仁去除外壳后研碎，过24目筛；称取粗粉60g，加10倍量95％乙醇90℃回流提取2次，10倍量70％乙醇90℃回流提取1次，每次2h，合并3次提取液后用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩为稠浸膏，将稠浸膏与水以1:1体积溶解，之后将溶液以2倍量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，将各萃取液浓缩至干得各部位提取物；精密称取正丁醇部位提取物25mg，加甲醇溶解并定容至5mL，超声处理30min，冷却，摇匀后取溶液适量，离心，取上清，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得扁桃药材正丁醇部位提取物供试品溶液(5.0mg/mL)。
进一步的，所述步骤2)的具体方法为：
精密称取苦杏仁苷对照品25.0mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解、稀释并定容至5mL，摇匀，即得5.0mg/mL的苦杏仁苷标准品溶液；精密称取野黑樱苷对照品5.0mg，置于2mL容量瓶中，用甲醇溶解、稀释并定容至2mL，摇匀，即得2.5mg/mL的野黑樱苷标准品溶液。
进一步的，所述步骤3)的具体方法为：
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6nm×250nm，5μm)；流动相：乙腈(B)-水(C)，采用线性梯度洗脱；检测波长：0～25min，210nm；25～60min，225nm；流速：1.0mL/min；柱温：32℃；进样量10μL。
进一步的，所述梯度洗脱程序为：
Figure BDA0003573449820000041
进一步的，所述蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位HPLC指纹图谱共检测到6个共有峰，分别为4号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰和15号峰。
进一步的，所述蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位的指纹图谱有6个特征共有峰，以苦杏仁苷的色谱峰为参照峰，以其保留时间为1计，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对保留时间分别如下：峰4：0.508±0.002；峰7：0.894±0.001；峰8：0.989±0.001；峰9：1.00；峰10：1.164±0.001；峰15：2.116±0.004；其中9号峰为苦杏仁苷，10号峰为野黑樱苷。
进一步的，所述蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位的指纹图谱有6个特征共有峰，以苦杏仁苷的色谱峰为参照峰，以其峰面积为1计，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对峰面积分别如下：峰4：0.012±0.009；峰7：0.059±0.011；峰8：0.040±0.011；峰9：1.00；峰10：0.123±0.080；峰15：0.074±0.060；其中9号峰为苦杏仁苷，10号峰为野黑樱苷。
有益效果
近年来有关中药指纹图谱的研究十分热门，但关于扁桃药材正丁醇提取物HPLC指纹图谱的研究未见报道。本发明首次建立的蒙古扁桃药材及其近缘种正丁醇提取物HPLC指纹图谱的测定分析方法精密度高，稳定性、重复性和各色谱峰分离度均良好。相似度评价结果显示不同批次扁桃药材的HPLC指纹图谱相似度较高(0.982～0.997)，药材质量较为稳定。同时通过比较6个共有峰，指认出了2个共有峰，即苦杏仁苷(峰9)和野黑樱苷(峰10)，其中未知成分峰4、峰7、峰8、峰15仍需进一步鉴定分析。随后对其中的苦杏仁苷含量进行了测定，显示苦杏仁苷在0.25～2.5mg/mL(R2＝0.9991)内呈现良好的线性关系；平均加样回收率为99.4％；RSD值为1.03％。
指纹图谱具有综合性和整体性的特点，利用其对中药的品质进行全面、深入研究并进行质量控制，从而保证不同批次间中药质量的稳定，这对于推进中药的临床应用并促进其现代化发展具有重要意义。本发明通过建立蒙古扁桃药材及其近缘种正丁醇提取物HPLC指纹图谱的测定方法，并利用该方法测定了不同批次扁桃种仁正丁醇提取物中苦杏仁苷的含量，进一步反映了蒙古扁桃药材有效药用成分的特征，以期为扁桃药材的鉴定、药材质量控制提供更加全面的实验依据，为进一步科学评价扁桃药材的质量奠定基础，同时对扁桃药材质量评价体系的完善具有积极的推动作用。
本发明首次建立了精密度、稳定性和重现性良好的蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位提取物的HPLC指纹图谱，同时结合成分含量测定结果，能够对蒙古扁桃及其近缘种的质量进行更加全面地控制。
附图说明
图1是10批扁桃药材正丁醇部位HPLC指纹图谱。
图2是10批扁桃药材正丁醇部位HPLC对照指纹图谱。
图3是混合对照品HPLC色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的范围并非局限于具体实施例。
仪器
UltiMate 3000高效液相色谱仪(PDA检测器)，中国赛默飞世尔科技有限公司；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6nm×250nm,5μm)色谱柱，安捷伦科技有限公司；AP-01P真空泵，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；KQ-500E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DZW-8-8型水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂；RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；BSY-200T研磨机，永康市铂欧五金制品有限公司；电子分析天平，上海恒平仪器公司。
药品与试剂
10批扁桃种仁样品(S1～S10)，分别采自不同产地的扁桃药材，经内蒙古科技大学包头医学院石松利教授鉴定为蔷薇科，桃属植物扁桃的干燥成熟种子，来源信息见表1；苦杏仁苷对照品(批号：Z28A6L2815，纯度≥98％，CAS号：29883-15-6)、野黑樱苷对照品(批号：X07J11L117770，纯度≥98％，CAS号：99-18-3)，均购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈(色谱纯，批号：016880)、甲醇(色谱纯，批号：016953)均购自美国Mreda TechnologyInc；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯，购自天津凯通化学试剂有限公司。
表1扁桃药材样品来源
Figure BDA0003573449820000061
Figure BDA0003573449820000071
实施例1
1.1供试品溶液的制备
将不同批次扁桃种仁去除外壳后研碎，过24目筛。各称取粗粉60g，加10倍量95％乙醇90℃回流提取2次，10倍量70％乙醇90℃回流提取1次，每次2h，合并3次提取液后用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩为稠浸膏，将稠浸膏与水以1:1体积溶解，之后将溶液以2倍量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，将各萃取液浓缩至干得10批扁桃的各部位提取物。精密称取各批次正丁醇部位提取物25mg，加甲醇溶解并定容至5mL，超声处理30min，冷却，摇匀后取溶液适量，离心，取上清，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得7种产地10批扁桃药材正丁醇部位提取物供试品溶液(5.0mg/mL)。
1.2标准品溶液的制备
精密称取苦杏仁苷对照品25.0mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解、稀释并定容至5mL，摇匀，即得5.0mg/mL的苦杏仁苷标准品溶液；精密称取野黑樱苷对照品5.0mg，置于2mL容量瓶中，用甲醇溶解、稀释并定容至2mL，摇匀，即得2.5mg/mL的野黑樱苷标准品溶液。
1.3HPLC色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6nm×250nm，5μm)。流动相：乙腈(B)-水(C)，采用线性梯度洗脱，具体程序见表2。检测波长：0～25min，210nm；25～60min，225nm；流速：1.0mL/min；柱温：32℃；进样量10μL。
表2流动相梯度洗脱程序
Figure BDA0003573449820000081
1.4数据处理
应用《中药色谱指纹图谱相似度评价***》(2012.130723版本)分析和建立扁桃正丁醇部位提取物的HPLC指纹图谱并进行相似度评价。
1.5指纹图谱方法学考察
1.5.1精密度试验取同一产地的供试品溶液(编号：S4)，按“1.3”项下色谱条件连续进样6次，测得各色谱峰相对保留时间RSD在0.01％～0.21％，相对峰面积RSD在0.29％～2.10％，各色谱峰图谱与“对照指纹图谱”相似度在0.986～1.00，结果表明仪器精密度良好，符合要求。
1.5.2稳定性试验取同一产地新配制的供试品溶液(编号：S4)，按“1.3”项下色谱条件分别在配制后的0、2、4、8、12、24h进样，测得24h内同一份供试品溶液中各色谱峰相对保留时间RSD在0.01％～0.24％，相对峰面积RSD在0.12％～2.26％，各色谱峰图谱与“对照指纹图谱”相似度为0.942％～0.963％，结果表明样品溶液在24h内稳定性良好，符合要求。
1.5.3重复性试验取同一批号的供试品溶液(编号：S4)6份，按照“1.3”项下色谱条件进样并检测分析，测得6份样品中各色谱峰相对保留时间RSD<0.02％，相对峰面积的RSD在0.44％～3.15％，各色谱峰图谱与“对照指纹图谱”相似度RSD在0.856％～0.997％，结果表明该方法的重复性较好。
1.6蒙古扁桃及其近缘种正丁醇提取物指纹图谱的建立与分析
取10批扁桃种仁正丁醇部位提取物的供试品溶液，分别按照“1.3”项下色谱条件进行检测，得到各批次扁桃种仁正丁醇提取物的HPLC色谱图(S1～S10)，见图1。将各批次样品色谱图转化为CDF格式文件，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012.130723版本)”软件，计算各样品相似度。采用自动匹配，以中位数法，时间窗为0.3的条件生成对照指纹图谱(R)，见图2。观察10批扁桃种仁正丁醇提取物样品色谱峰并标出了6个共有峰，其中确认了苦杏仁苷(峰9)和野黑樱苷(峰10)，见图3。苦杏仁苷是扁桃主要药效成分之一，发明人前期采用色谱、波谱手段对蒙古扁桃药材正丁醇部位提取物进行了化学成分研究，首次从中鉴定出苦杏仁苷单体化合物，比重为47.72％。因其所占峰面积在共有峰中最大，因此选择苦杏仁苷(峰9)作为参照峰，将其保留时间和峰面积设为1，分别计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积，结果见表3和表4。
表3不同批次扁桃种仁样品正丁醇提取物HPLC指纹图谱共有峰的相对保留时间(min)
Figure BDA0003573449820000101
表4不同批次扁桃种仁样品正丁醇提取物HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积(mAU)
Figure BDA0003573449820000102
1.7指纹图谱相似度评价
将10批扁桃药材种仁正丁醇提取物HPLC色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***》(2012.130723版本)，采用自动匹配，以中位数法，生成各样品指纹图谱与对照指纹图谱，对其进行编号后计算其相似度，结果见表5。由结果可知，各样品指纹图谱与对照指纹图谱比较，相似度在0.982～0.997，表明10批样品总体相似度较高，表明该实验所用的10批扁桃药材种仁正丁醇提取物药材品质稳定性较好。同时根据指纹图谱结果(图1)，共检测到6个共有峰，分别为4号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰和15号峰，其中指认了9号峰为苦杏仁苷，10号峰为野黑樱苷。但不同产地的样品色谱峰略有不同，说明不同产地的扁桃药材品质存在一定差异。
表5不同批次扁桃种仁样品正丁醇提取物相似度
Figure BDA0003573449820000111
1.8含量测定方法学考察
1.8.1线性关系考察精密吸取“1.2”项下苦杏仁苷标准品溶液2.5、2.0、1.0、0.5、0.25mL，分别置于5mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度线并摇匀，得到稀释倍数分别为2、2.5、5、10、20倍的标准品系列溶液。按照“1.3”项下色谱条件进样并检测分析，记录色谱图，以峰面积(y)为纵坐标，浓度(x，mg/mL)为横坐标进行线性回归分析，结果显示苦杏仁苷的线性回归方程为y＝156.260x-6.821(R2＝0.9991)，浓度在0.25～2.5mg/mL的范围内呈现良好的线性关系。
1.8.2精密度试验取“1.2”项下苦杏仁苷标准品溶液适量(5.0mg/mL)，按照“1.3”项下色谱条件连续进样6次。苦杏仁苷峰面积的RSD值为0.39％，结果表明该方法精密度良好，符合要求。
1.8.3重复性试验取同一批号的供试品溶液(编号：S4)6份，按照“1.3”项下色谱条件进样并检测分析，测得苦杏仁苷峰面积的RSD值为1.29％，结果表明该含量测定方法重复性较好。
1.8.4稳定性试验取同一产地新配制的供试品溶液(编号：S4)，按“1.3”项下色谱条件分别在配制后的0、2、4、8、12、24h进样，测得24h内苦杏仁苷峰面积的RSD值为1.37％，结果表明苦杏仁苷在24h内稳定性良好，符合要求。
1.8.5加样回收率试验精密量取已知含量的供试品溶液(编号：S4)1mL，共9份，分别加入苦杏仁苷标准品溶液适量，配成低、中、高浓度的混合溶液，每一浓度平行配制3份，按“1.3”项下色谱条件进样，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表6。
表6加样回收率试验结果
Figure BDA0003573449820000121
1.8.6样品含量测定取各批次扁桃药材正丁醇提取物样品适量，按照“1.2”项下制备供试品溶液，再按照“1.3”项下色谱条件进样并检测分析，平行测定3次。实验结果以SPSS19.0进行统计分析，数据均以±s表示，苦杏仁苷样品含量测定结果见表7。
表7蒙古扁桃及其近缘种正丁醇提取物中苦杏仁苷的含量
Figure BDA0003573449820000131
实施例2：
对比甲醇-水和乙腈-水两种流动相的分离效果，按照以下条件，色谱柱：AgilentEclipse XDB-C18(4.6nm×250nm，5μm)；流动相：甲醇(B)-水(C)/乙腈(B)-水(C)，采用线性梯度洗脱，检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量10μL。
所述梯度洗脱程序为：
Figure BDA0003573449820000132
结果将甲醇-水作为流动相时，色谱峰出现了较多的前沿陡起后部平缓，不对称的拖尾峰和组分没有完全分开，重叠在一起的交叉峰。而将乙腈-水作为流动相时，色谱峰出峰较多，对称性良好，峰高及峰面积理想，且各个峰之间的分离效果明显，因此将乙腈-水作为流动相能够更好的对扁桃药材正丁醇部位提取物中的成分进行分离鉴定。
实施例3：
对比扁桃亚属药材种仁正丁醇提取物在不同波长下的色谱图(210nm、225nm、250nm)，按照以下条件，色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6nm×250nm，5μm)；流动相：乙腈(B)-水(C)，采用线性梯度洗脱，检测波长分别为：210nm/225nm/250nm/0～25min，210nm；25～60min，225nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量10μL。
结果发现在单一波长条件下的色谱峰出现了较多的拖尾峰和峰型比较矮且胖的馒头峰，而在210-225nm波长切换的条件下，色谱图基线平稳，色谱峰的吸收强度最大，出峰最多，峰高、峰面积和峰形均较好且分离效果明显，无相互干扰。因此在210-225nm波长切换的条件进行检测，能够更好的对扁桃药材正丁醇部位提取物中的成分进行分离鉴定。
实施例4
对比不同柱温(30℃、32℃、35℃)对不同批次供试品色谱峰的影响，按照以下条件，色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6nm×250nm，5μm)；流动相：乙腈(B)-水(C)，采用线性梯度洗脱，检测波长分别为：0～25min，210nm；25～60min，225nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃/32℃/35℃；进样量10μL。
结果显示各柱温下的色谱图总体差别不大，均出峰较多，但柱温32℃时色谱峰的峰形、峰高、峰面积及分离度等整体相对来说较好。故最终选择32℃为检测温度，能更好的对扁桃药材正丁醇部位提取物中的成分进行分离鉴定。
以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）供试品溶液的制备
将扁桃种仁去除外壳后研碎，过24目筛；称取粗粉60 g，加10倍量95%乙醇90℃回流提取2次，10倍量70%乙醇90℃回流提取1次，每次2 h，合并3次提取液后用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩为稠浸膏，将稠浸膏与水以1:1体积溶解，之后将溶液以2倍量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，将各萃取液浓缩至干得各部位提取物；精密称取正丁醇部位提取物25 mg，加甲醇溶解并定容至5 mL，超声处理30 min，冷却，摇匀后取溶液适量，离心，取上清，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得扁桃药材正丁醇部位提取物供试品溶液，浓度为5.0 mg/mL；
2）标准品溶液的制备
称取苦杏仁苷对照品，用甲醇溶解、稀释，摇匀，即得苦杏仁苷标准品溶液；称取野黑樱苷对照品，用甲醇溶解、稀释，摇匀，即得野黑樱苷标准品溶液；
3）HPLC色谱条件
色谱柱为C18色谱柱；流动相B为乙腈，流动相C为水；采用线性梯度洗脱，检测波长：210nm ~ 225 nm；流速为0.5~1.5 mL/min；柱温：30~35℃；进样量5~15 μL；
所述蒙古扁桃及其近缘种选自蒙古扁桃Amygdalus mongolica (Maxim.) Ricker、长梗扁桃Amygdalus pedunculata Pall.或榆叶梅Amygdalus triloba (Lindl.) Ricker；
所述步骤3）的具体方法为：
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5μm；流动相B为乙腈，流动相C为水，采用线性梯度洗脱；检测波长：0 ~ 25 min，210 nm；25 ~ 60 min，225 nm；流速：1.0mL/min；柱温：32℃；进样量10μL；
所述梯度洗脱程序为：
时间/min 乙腈% 水% 0 5 95 2 5 95 10 8 92 15 11 89 25 20 80 60 50 50
。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2）的具体方法为：
精密称取苦杏仁苷对照品25.0 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解、稀释并定容至5mL，摇匀，即得5.0 mg/mL的苦杏仁苷标准品溶液；精密称取野黑樱苷对照品5.0 mg，置于2mL容量瓶中，用甲醇溶解、稀释并定容至2 mL，摇匀，即得2.5 mg/mL的野黑樱苷标准品溶液。
3.根据权利要求1-2任一所述的构建方法，其特征在于，所述蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位HPLC指纹图谱共检测到6个共有峰，分别为4号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰和15号峰。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位的指纹图谱有6个特征共有峰，以苦杏仁苷的色谱峰为参照峰，以其保留时间为1计，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对保留时间分别如下：峰4：0.508±0.002；峰7：0.894±0.001；峰8：0.989±0.001；峰9：1.00；峰10：1.164±0.001；峰15：2.116±0.004；其中9号峰为苦杏仁苷，10号峰为野黑樱苷。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位的指纹图谱有6个特征共有峰，以苦杏仁苷的色谱峰为参照峰，以其峰面积为1计，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对峰面积分别如下：峰4：0.012±0.009；峰7：0.059±0.011；峰8：0.040±0.011；峰9：1.00；峰10：0.123±0.080；峰15：0.074±0.060；其中9号峰为苦杏仁苷，10号峰为野黑樱苷。
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