CN114216980A - 一种银柴胡hplc-elsd指纹图谱建立方法 - Google Patents
一种银柴胡hplc-elsd指纹图谱建立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114216980A CN114216980A CN202111524169.3A CN202111524169A CN114216980A CN 114216980 A CN114216980 A CN 114216980A CN 202111524169 A CN202111524169 A CN 202111524169A CN 114216980 A CN114216980 A CN 114216980A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mobile phase
- percent
- volume percent
- hplc
- elsd
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 title claims description 23
- 238000001474 liquid chromatography-evaporative light scattering detection Methods 0.000 title description 2
- 240000007641 Spergula rubra Species 0.000 title 1
- 244000018687 Stellaria dichotoma Species 0.000 claims abstract description 30
- 240000006694 Stellaria media Species 0.000 claims abstract description 30
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 42
- 229940076810 beta sitosterol Drugs 0.000 claims description 32
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N beta-sitosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2(C)C3CC=C4CC(O)CCC4C3CCC12C)C(C)C NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 claims description 32
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 claims description 32
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims description 15
- 241000213015 Bupleurum scorzonerifolium Species 0.000 claims description 14
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 claims description 3
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 abstract description 4
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 abstract description 4
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 11
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 241000510654 Bupleurum chinense Species 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000015817 Infant Nutrition disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000007602 hot air drying Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
- G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
- G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种银柴胡HPLC‑ELSD指纹图谱建立方法，属于中药指纹图谱技术领域，该图谱建立方法包括通过对银柴胡采用HPLC‑ELSD色谱法进行分析测得高效液相指纹图谱，其中，所述HPLC‑ELSD色谱法色谱条件包括：色谱柱为C18；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为水，进行梯度洗脱；检测器：蒸发光散射检测器。本发明中，解决了银柴胡主要有效成分甾醇因紫外末端吸收不易检测的问题，同时得到指纹图谱特征峰可以通过相对峰面积更加直接和准确地反映银柴胡中化学物质的含量，进而更好地对银柴胡药材质量进行评价，建立了便捷的银柴胡乙酸乙酯提取物的提取方法和指纹图谱建立方法，得到的银柴胡色谱图谱特征峰分离效果较为良好。
Description
技术领域
本发明属于中药指纹图谱技术领域，尤其涉及一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法。
背景技术
银柴胡是宁夏的道地药材，是我国清虚热、除疳热的传统良药。随着现代医学研究的深入中，银柴胡良好的清热凉血、抗炎、抗过敏、抗癌等功效逐渐被发现，药用价值不断提高，社会需求随之不断增大。近年来，在野生银柴胡资源趋于匮乏的情况下，栽培银柴胡开始成为市场的主流。但在野生转为栽培的过程中，不同的栽培产地、田间管理、加工方式等因素导致银柴胡的药材质量良莠不齐。然而，银柴胡作为一种小品种药材，其相关的科学研究尚不完善，导致截至目前仍然没有有效的银柴胡药材质量评价方法，一定程度上影响了银柴胡产业发展和基础研究的进程。
指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱等技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式。色谱法是分析化学领域中发展最快、应用最广泛的分析方法之一，也是中药指纹图谱最基本的技术和现代中药产业的关键技术，而高效液相(HPLC)指纹图谱是目前中药质量控制较为成熟的技术之一。高效液相分析中的检测器是重要硬件组成部分和物质定性定量基础。在已有研究报道银柴胡的功效成分中，甾醇一直被认为是其清虚热的主要成分，但是由于甾醇成分普遍具有紫外末端吸收，因此常用的光学类检测器对银柴胡主要有效成分的检测效果较差。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决常用的光学类检测器对银柴胡主要有效成分的检测效果较差的问题，而提出的一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法，该图谱建立方法包括通过对银柴胡采用HPLC-ELSD色谱法进行分析测得高效液相指纹图谱，其中，所述HPLC-ELSD色谱法色谱条件包括：
色谱柱为C18；
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为水，进行梯度洗脱；
检测器：蒸发光散射检测器。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述HPLC-ELSD色谱法的标准对照品溶液按照以下步骤来制备：取α－菠甾醇、β－谷甾醇标准对照品适量，精密称定之后用乙酸乙酯溶解，定容，制成α－菠甾醇和β－谷甾醇标准对照品溶液，于4℃避光处保存，备用。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述HPLC-ELSD色谱法的供试品溶液按照以下步骤来制备：精密称量过40目筛银柴胡粉末2-5g，置于50ml具塞锥形瓶中，倒入提取溶剂，浸泡25-30min后，于超声提取30min，静置3min后，取出上清液，残渣倒入提取溶剂，进行二次提取，合并提取液，迅速过滤，滤液置于旋转蒸发仪中，60℃浓缩至2-5ml，将浓缩液移至10ml容量瓶中，用提取溶剂精确定容，即得。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述提取溶剂均为的乙酸乙酯。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述梯度洗脱程序按以下体积浓度配置进行：
0分钟时，流动相A的体积百分比为30.0％，流动相B的体积百分比为70％；
5分钟时，流动相A的体积百分比为30.0％，流动相B的体积百分比为70％；
10分钟时，流动相A的体积百分比为70.0％，流动相B的体积百分比为30％；
15分钟时，流动相A的体积百分比为70.0％，流动相B的体积百分比为30％；
18分钟时，流动相A的体积百分比为86.0％，流动相B的体积百分比为14％；
32分钟时，流动相A的体积百分比为86.0％，流动相B的体积百分比为14％；
37分钟时，流动相A的体积百分比为91.0％，流动相B的体积百分比为9％；
57分钟时，流动相A的体积百分比为91.0％，流动相B的体积百分比为9％；
60分钟时，流动相A的体积百分比为95.0％，流动相B的体积百分比为5％；
95分钟时，流动相A的体积百分比为95.0％，流动相B的体积百分比为5％；
100分钟时，流动相A的体积百分比为30.0％，流动相B的体积百分比为70％；
110分钟时，流动相A的体积百分比为30.0％，流动相B的体积百分比为70％。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述色谱柱为Waters Sun Fire C18色谱柱，其规格为：4.6×250mm,5μm。
作为上述技术方案的进一步描述：
色谱条件还包括:
蒸发光散射检测器的漂移管温度为75℃；
载气流速为1.6L/min；
柱温为40℃；
每次进样为20μl；
流速为0.8ml/min。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述图谱分析采用计算机数据处理软件对获得的色谱图谱进行减去基线、计算保留时间、峰高和峰面积，并进行特征峰指认。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中，通过将高效液相蒸发光散射联用技术(HPLC-ELSD)应用到银柴胡指纹图谱技术中，解决了银柴胡主要有效成分甾醇因紫外末端吸收不易检测的问题，蒸发光散射摆脱了样品对光学特性的依赖，对所有物质均有响应，且物质的响应值可以更好地反映中药化学物质的含量。因此建立的银柴胡指纹图谱特征峰可以通过相对峰面积更加直接和准确地反映银柴胡中化学物质的含量，进而更好地对银柴胡药材质量进行评价。同时本发明建立了便捷的银柴胡乙酸乙酯提取物的提取方法和指纹图谱建立方法，得到的银柴胡色谱图谱特征峰分离效果较为良好，且用到的试剂耗材简单、低毒，适宜推广，具有较高的实用性。
2、本发明中，通过添加对照标准品，在指纹图谱中指认出α－菠甾醇、β－谷甾醇两个物质的色谱峰，在获得银柴胡指纹图谱信息的同时，可以同时实现对α－菠甾醇、β－谷甾醇的准确定性定量。
3、本发明中，梯度洗脱程序的过程及条件是本发明的重要部分，采用本发明的梯度洗脱程序及条件，能够更好地分离银柴胡指纹图谱特征峰，提升分离效果好，更好地反映银柴胡指纹图谱特征，大幅度提升银柴胡品质鉴定结果的准确性。
附图说明
图1为本发明提出的银柴胡样品ELSD-HPLC色谱指纹图谱；
图2为本发明提出的α－菠甾醇和β－谷甾醇标准对照品ELSD-HPLC色谱图谱；
图3为本发明提出的银柴胡药材色谱指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种技术方案：一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法，该图谱建立方法，包括通过对银柴胡采用HPLC-ELSD色谱法进行分析测得高效液相指纹图谱，该方法分为4步：
S1、HPLC-ELSD色谱法的标准对照品溶液的制备：
取α－菠甾醇、β－谷甾醇标准对照品适量，精密称定之后用乙酸乙酯溶解，定容，制成α－菠甾醇和β－谷甾醇标准对照品容液，于4℃避光处保存，备用；
S2、HPLC-ELSD色谱法的供试品溶液的制备：
精密称量过40目筛银柴胡粉末2-5g，置于50ml具塞锥形瓶中，倒入乙酸乙酯溶液，浸泡25-30min后，于超声提取30min，静置3min后，取出上清液，残渣倒入乙酸乙酯溶液，进行二次提取，合并提取液，迅速过滤，滤液置于旋转蒸发仪中，60℃浓缩至2-5ml，将浓缩液移至10ml容量瓶中，乙酸乙酯溶液精确定容，即得；
S3、HPLC-ELSD色谱法测定：
将上述制得的对照品溶液和供试品溶液进行分析,其中，所述HPLC-ELSD色谱法色谱条件包括：
色谱柱为C18；
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为水，进行梯度洗脱；
检测器：蒸发光散射检测器；
其中梯度洗脱条件详见表1：
表1梯度洗脱条件
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 0.00 | 30.0 | 70.0 |
| 5.00 | 30.0 | 70.0 |
| 10.00 | 70.0 | 30.0 |
| 15.00 | 70.0 | 30.0 |
| 18.00 | 86.0 | 14.0 |
| 32.00 | 86.0 | 14.0 |
| 37.00 | 91.0 | 9.0 |
| 57.00 | 91.0 | 9.0 |
| 60.00 | 95.0 | 5.0 |
| 95.00 | 95.0 | 5.0 |
| 100.00 | 30.0 | 70.0 |
S4、图谱分析：
采用计算机软件生成标准对照品溶液和供试品溶液的色谱图谱。
实施例2
本发明提供了又一种具体的实施方案，一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法，该图谱建立方法，包括通过对银柴胡采用HPLC-ELSD色谱法进行分析测得高效液相指纹图谱，该方法分为4步：
S1、HPLC-ELSD色谱法的标准对照品溶液的制备：
取α－菠甾醇、β－谷甾醇标准对照品适量，精密称定之后用乙酸乙酯溶解，定容，制成0.5696mg/ml的α－菠甾醇、0.4024mg/ml的β－谷甾醇标准对照品溶液，于4℃避光处保存，备用；
S2、HPLC-ELSD色谱法的供试品溶液的制备：
精密称量过40目筛银柴胡粉末2g，置于50ml具塞锥形瓶中，倒入乙酸乙酯溶液，浸泡30min后，于超声提取30min，静置3min后，取出上清液，残渣倒入20ml乙酸乙酯溶液，进行二次提取，合并提取液，迅速过滤，滤液置于旋转蒸发仪中，60℃浓缩至2-5ml，将浓缩液移至10ml容量瓶中，乙酸乙酯溶液精确定容，即得；
其中乙酸乙酯选用色谱级，浓度要求98％以上；
S3、HPLC-ELSD色谱法测定：
将上述制得的对照品溶液和供试品溶液进行分析,其中，所述HPLC-ELSD色谱法色谱条件包括：
色谱柱为C18；
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为水，进行梯度洗脱；
检测器：蒸发光散射检测器；
其中选用Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 1260Infinity蒸发光散射检测器以及Waters Sun Fire C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)，设置参数为漂移管温度75℃，载气流速1.6L/min，柱温40℃，每次进样20μl，流速为0.8ml/min，流动相A为甲醇，B为水，进行梯度洗脱，梯度洗脱条件与实施例1相同；
S4、图谱分析：
采用Origin 2018等数据处理软件对获得的标准对照品溶液和供试品溶液色谱图谱进行减去基线、计算保留时间、峰高、峰面积等，并进行特征峰指认；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价***软件》2012A版，对图谱进行相似度综合评价。
实施例3
本发明又提供了一种实施方案，该方案可以定量测定供试样品α－菠甾醇和β－谷甾醇的含量，该方案与实施例2的区别在于还包括：
分别取实施例2的S1步骤中配制的标准对照品母液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml至10ml容量瓶，用乙酸乙酯溶液准确定容，配置成不同浓度的标准对照品溶液，将得到的溶液按上述方法进行检测，以对照品浓度为横坐标(X)，对照品峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数(即R2，要求相关系数大于0.99)；
以获得的回归方程为标准，将实施例2中S4步骤测得的供试品的α－菠甾醇峰和β－谷甾醇峰的峰面积代入回归方程，计算供试品样品的α－菠甾醇和β－谷甾醇含量。
当然，本实施例仅是为了便于相关领域技术人员理解，不局限于实施例2中设定的标准对照品母液浓度等前提条件，能够满足相关系数大于0.99均可。
试验例
本试验例通过验证方法可行性，并进行实例试验，主要方案如下：
1.方法学考察
(1)线性关系考察：分别取实施例2中的标准对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml至10ml容量瓶，用乙酸乙酯溶液准确定容，配置成不同浓度的标准对照品溶液，将得到的溶液按上述方法进行检测，以对照品浓度为横坐标(X)，对照品峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到α－菠甾醇线性回归方程为Y＝7047X-0.8942，R2为0.9912，β－谷甾醇线性回归方程为Y＝1480X-27.441，R2为0.9952，表明线性关系良好，可以用于后续含量测定。
(2)精密度考察：取同一份银柴胡药材，按实施例2中的方法，制备供试品溶液、设置色谱条件等，连续进样6针，记录色谱图，以α－菠甾醇和β－谷甾醇为参照峰，计算两个色谱峰相对保留时间和相对峰面积。
结果显示，指纹图谱中α－菠甾醇和β－谷甾醇相对保留时间的RSD值分别为0.45％和0.39％，相对峰面积的相对标准偏差(RSD值)分别为3.58％和3.04％，表明仪器的精密度良好。
(3)重复性考察：取同一份银柴胡药材6份，按实施例2中的方法，平行制备6份供试品溶液，在相同色谱条件下，记录色谱图，以α－菠甾醇和β－谷甾醇为参照峰，计算两个色谱峰相对保留时间和相对峰面积。
结果显示，指纹图谱中α－菠甾醇和β－谷甾醇相对保留时间的RSD值分别为0.42％和0.46％，相对峰面积的RSD值分别为3.78％和3.95％，表明该方法的重复性良好。
(4)稳定性考察：取同一份银柴胡药材，按实施例2中的方法，制备供试品溶液，设置色谱条件，将制得的供试品溶液分别在0、2、4、8、12、24h进样分析，记录色谱图，以α-菠甾醇和β-谷甾醇为参照峰，计算两个色谱峰相对保留时间和相对峰面积。
结果显示，指纹图谱中α-菠甾醇和β-谷甾醇相对保留时间的RSD值分别为0.37％和0.42％，相对峰面积的RSD值分别为3.57％和3.45％，表明供试液在常温下在24h内稳定性良好。
(5)加样回收率考察：精密称取已知α－菠甾醇和β－谷甾醇含量的过40目筛银柴胡粉末2g，6份，分别精密加入1ml线性关系考察中配制的不同浓度的标准对照品溶液，并参照实施例2中的方法，制备供试品溶液，测定样品α－菠甾醇峰和β－谷甾醇峰的峰面积，根据线性关系考察中的回归方程计算α－菠甾醇和β－谷甾醇的含量，计算得到平均回收率和RSD值。
结果显示α－菠甾醇的平均回收率在95.46％～103.23％之间，RSD均小于5％，说明方法回收率良好。
2.实例试验：
(1)样品采集
收集包括野生与栽培、不同产地、不同干燥方法的共17份银柴胡药材，采集到的银柴胡药材晒干至恒重，样品详细信息见表2，干燥好的银柴胡样品粉碎至过40目筛，低温、避光、密封保存备用。
表2样品采集信息
(2)17份银柴胡样品指纹图谱
将17份银柴胡药材，按实施例2中的方法，制备供试品溶液、设置色谱条件等，并进行检测，得到17份合成银柴胡指纹图谱，如图1所示；
利用Origin 2018软件将17份银柴胡高效液相色谱图谱进行叠加，共确定15个共有峰(共有峰保留时间见表3)。由图谱显示不同产地、野生与栽培以及不同干燥方法的银柴胡指纹图谱以及特征峰表现出不同的差异，说明这些银柴胡样品的化学物质含量存在差异，进而其药材质量亦存在较大差异，从而根据特定化学物质含量的差异进行银柴胡品质的判定。
表3 15个银柴胡ELSD-HPLC色谱指纹图谱峰位
(3)特征峰指认
利用实施例2中配制的α－菠甾醇和β－谷甾醇标准对照品，在相同的条件下进行检测，以相同保留时间和峰形特征对15个共有特征峰进行指认，最终指认出表3中的C13和C15分别为α－菠甾醇和β－谷甾醇的特征峰(标准对照品色谱峰和银柴胡指纹图谱详见图2、图3)。
(4)银柴胡α－菠甾醇和β－谷甾醇含量测定
根据实施例2中的方法及线性关系考察中的回归方程，对17份银柴胡的α－菠甾醇和β－谷甾醇含量进行测定，将不同样品银柴胡α－菠甾醇和β－谷甾醇对应的峰面积，带入回归方程，求得X即为样品的α－菠甾醇和β－谷甾醇含量，结果如表4所示。
17份银柴胡的α－菠甾醇和β－谷甾醇含量存在差异，表明不同来源银柴胡药材在有效成分含量上存在差异，进而反映其药材质量也存在一定差异，从而根据有效成分的含量进行银柴胡品质的鉴定和评级。
表4 17份银柴胡样品指纹图谱α－菠甾醇和β－谷甾醇含量(mg/g)
(5)相似度评价
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价***软件》2012A版，对17份银柴胡样品的图谱进行相似度综合评价，结果如表5所示，所有样品的指纹图谱相似度均在0.90以上，但又存在一定的差异，表明17份银柴胡样品指纹图谱具有一定的一致性，全部银柴胡药材的相似度均达到0.900以上，同时又存在一定特异性，如：YCH1～YCH4均为野生银柴胡药材，其相似度在0.91～0.93之间，YCH6～YCH11均为栽培药材，相似度均在0.93以上；YCH12～YCH17作为同一批银柴胡采用不同干燥方法处理药材，其中自然干燥银柴胡样品YCH12和YCH13均低于0.91，而热风干燥处理的样品相似度均在0.91以上，因此该指纹图谱在区分不同来源银柴胡药材上有一定的应用效果，具有良好的银柴胡质量评价应用前景，可以在鉴定不同品质银柴胡药材及来源上进行应用。
表5 17份银柴胡样品指纹图谱相似度
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法，其特征在于，该图谱建立方法包括通过对银柴胡采用HPLC-ELSD色谱法进行分析测得高效液相指纹图谱，其中，所述HPLC-ELSD色谱法色谱条件包括：
色谱柱为C18；
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为水，进行梯度洗脱；
检测器：蒸发光散射检测器。
2.根据权利要求1所述的一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法，其特征在于，所述HPLC-ELSD色谱法的标准对照品溶液按照以下步骤来制备：取α－菠甾醇、β－谷甾醇标准对照品适量，精密称定之后用乙酸乙酯溶解，定容，制成α－菠甾醇和β－谷甾醇标准对照品溶液，于4℃避光处保存，备用。
3.根据权利要求1所述的一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法，其特征在于，所述HPLC-ELSD色谱法的供试品溶液按照以下步骤来制备：精密称量过40目筛银柴胡粉末2-5g，置于50ml具塞锥形瓶中，倒入提取溶剂，浸泡25-30min后，于超声提取30min，静置3min后，取出上清液，残渣倒入提取溶剂，进行二次提取，合并提取液，迅速过滤，滤液置于旋转蒸发仪中，60℃浓缩至2-5ml，将浓缩液移至10ml容量瓶中，用提取溶剂精确定容，即得。
4.根据权利要求3所述的一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法，其特征在于，所述提取溶剂均为乙酸乙酯。
5.根据权利要求1所述的一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序按以下体积浓度配置进行：
0分钟时，流动相A的体积百分比为30.0％，流动相B的体积百分比为70％；
5分钟时，流动相A的体积百分比为30.0％，流动相B的体积百分比为70％；
10分钟时，流动相A的体积百分比为70.0％，流动相B的体积百分比为30％；
15分钟时，流动相A的体积百分比为70.0％，流动相B的体积百分比为30％；
18分钟时，流动相A的体积百分比为86.0％，流动相B的体积百分比为14％；
32分钟时，流动相A的体积百分比为86.0％，流动相B的体积百分比为14％；
37分钟时，流动相A的体积百分比为91.0％，流动相B的体积百分比为9％；
57分钟时，流动相A的体积百分比为91.0％，流动相B的体积百分比为9％；
60分钟时，流动相A的体积百分比为95.0％，流动相B的体积百分比为5％；
95分钟时，流动相A的体积百分比为95.0％，流动相B的体积百分比为5％；
100分钟时，流动相A的体积百分比为30.0％，流动相B的体积百分比为70％；
110分钟时，流动相A的体积百分比为30.0％，流动相B的体积百分比为70％。
6.根据权利要求1所述的一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters Sun Fire C18色谱柱，其规格为：4.6×250mm,5μm。
7.根据权利要求1所述的一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法，其特征在于，色谱条件还包括：
蒸发光散射检测器的漂移管温度为75℃；
载气流速为1.6L/min；
柱温为40℃；
每次进样为20μl；
流速为0.8ml/min。
8.根据权利要求1所述的一种银柴胡HPLC-ELSD指纹图谱建立方法，其特征在于，所述图谱分析采用计算机数据处理软件对获得的色谱图谱进行减去基线、计算保留时间、峰高和峰面积，并进行特征峰指认。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111524169.3A CN114216980B (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种银柴胡hplc-elsd指纹图谱建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111524169.3A CN114216980B (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种银柴胡hplc-elsd指纹图谱建立方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114216980A true CN114216980A (zh) | 2022-03-22 |
| CN114216980B CN114216980B (zh) | 2023-12-29 |
Family
ID=80701896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111524169.3A Active CN114216980B (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种银柴胡hplc-elsd指纹图谱建立方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114216980B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115677874A (zh) * | 2022-11-23 | 2023-02-03 | 宁夏大学 | 一种具有益生元活性的银柴胡粗多糖及其制备方法 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101073587A (zh) * | 2006-05-18 | 2007-11-21 | 天津天士力制药股份有限公司 | 一种柴胡药材的提取分离方法 |
| CN101073606A (zh) * | 2006-05-18 | 2007-11-21 | 天津天士力制药股份有限公司 | 一种白芍药材的提取分离方法 |
| CN110346463A (zh) * | 2018-04-08 | 2019-10-18 | 暨南大学 | 一种岗梅根药材hplc-elsd指纹图谱的建立方法 |
| CN110724177A (zh) * | 2019-09-29 | 2020-01-24 | 杨凌萃健生物工程技术有限公司 | 一种灵芝糖肽及其制备方法 |
| CN111879887A (zh) * | 2020-08-25 | 2020-11-03 | 北京振东光明药物研究院有限公司 | 黄芪药材及其制剂中成分的检测方法和应用 |
| CN113109482A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-07-13 | 北京振东光明药物研究院有限公司 | 黄芪药材、提取物及单味制剂的指纹图谱的建立方法 |
| CN113413632A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-09-21 | 宁夏大学 | 一种银柴胡脂类提取物及其制备方法 |
| CN113514576A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-10-19 | 北京振东光明药物研究院有限公司 | 柴胡药材、提取物及单味制剂的指纹图谱的建立方法 |
| CN113759011A (zh) * | 2020-08-26 | 2021-12-07 | 北京康仁堂药业有限公司 | 一种银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法 |
-
2021
- 2021-12-14 CN CN202111524169.3A patent/CN114216980B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101073587A (zh) * | 2006-05-18 | 2007-11-21 | 天津天士力制药股份有限公司 | 一种柴胡药材的提取分离方法 |
| CN101073606A (zh) * | 2006-05-18 | 2007-11-21 | 天津天士力制药股份有限公司 | 一种白芍药材的提取分离方法 |
| CN110346463A (zh) * | 2018-04-08 | 2019-10-18 | 暨南大学 | 一种岗梅根药材hplc-elsd指纹图谱的建立方法 |
| CN110724177A (zh) * | 2019-09-29 | 2020-01-24 | 杨凌萃健生物工程技术有限公司 | 一种灵芝糖肽及其制备方法 |
| CN111879887A (zh) * | 2020-08-25 | 2020-11-03 | 北京振东光明药物研究院有限公司 | 黄芪药材及其制剂中成分的检测方法和应用 |
| CN113759011A (zh) * | 2020-08-26 | 2021-12-07 | 北京康仁堂药业有限公司 | 一种银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法 |
| CN113109482A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-07-13 | 北京振东光明药物研究院有限公司 | 黄芪药材、提取物及单味制剂的指纹图谱的建立方法 |
| CN113514576A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-10-19 | 北京振东光明药物研究院有限公司 | 柴胡药材、提取物及单味制剂的指纹图谱的建立方法 |
| CN113413632A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-09-21 | 宁夏大学 | 一种银柴胡脂类提取物及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 李振凯等: "不同干燥方法对银柴胡浸出物及甾醇成分的影响", 《江苏农业学报》, pages 1006 - 1008 * |
| 王秀芬等: "基于HPLC—ELSD法的银柴胡中甾醇类成分含量测定", 《西北药学杂志》, pages 551 - 554 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115677874A (zh) * | 2022-11-23 | 2023-02-03 | 宁夏大学 | 一种具有益生元活性的银柴胡粗多糖及其制备方法 |
| CN115677874B (zh) * | 2022-11-23 | 2024-01-23 | 宁夏大学 | 一种具有益生元活性的银柴胡粗多糖及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114216980B (zh) | 2023-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105259269B (zh) | 一种石斛特征指纹图谱的建立方法 | |
| CN110702813B (zh) | 一种苗药黑骨藤hplc指纹图谱研究及多成分含量测定方法 | |
| CN103869041A (zh) | 一种止咳口服药物组合物的质量控制方法 | |
| CN110297060B (zh) | 一种山苦荬药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱 | |
| CN102539597B (zh) | 一种羌活种子和宽叶羌活种子的快速鉴别方法 | |
| CN102441057B (zh) | 一种养血清脑颗粒的hplc指纹图谱检测方法 | |
| CN114216980A (zh) | 一种银柴胡hplc-elsd指纹图谱建立方法 | |
| CN110243986B (zh) | 一种活血消瘿片hplc指纹图谱及其制备方法 | |
| CN106153805B (zh) | 一种元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法及其应用 | |
| CN106290645B (zh) | 一种拉萨大黄指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱 | |
| CN110031564B (zh) | 基于hplc指纹图谱的天然植物抗球虫饲料添加剂的质量检测方法 | |
| CN116183805B (zh) | 一种桑菊感冒颗粒成分的检测和评价方法 | |
| CN114965802B (zh) | 一种更年安片的质量控制方法 | |
| CN113759037B (zh) | 南葶苈子和/或北葶苈子配方颗粒特征图谱及其构建方法和鉴别方法 | |
| CN106018647B (zh) | 一种建立葵花盘hplc标准指纹图谱的方法 | |
| CN111220719B (zh) | 一种人参药材质量的指纹图谱评价方法 | |
| CN109596763B (zh) | 一种杜仲与盐杜仲的特征图谱的构建方法及鉴别方法 | |
| CN106324146A (zh) | 苦瓜叶的hplc指纹图谱检测方法 | |
| CN110308213B (zh) | 滋肾育胎丸指纹图谱构建方法及其在质量检测中的应用 | |
| CN113759011A (zh) | 一种银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法 | |
| CN114689750B (zh) | 蒙古扁桃及其近缘种正丁醇部位hplc指纹图谱的构建方法 | |
| CN109900832A (zh) | 一种法半夏指纹图谱的检测方法 | |
| CN114236034B (zh) | 一种飞龙掌血药材的检测方法 | |
| CN109239251A (zh) | 黄氏响声丸hplc—elsd指纹图谱的测定方法 | |
| CN111766309B (zh) | 一种安神宝颗粒特征图谱的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |