CN114685609B - 一种超短自组装抗菌肽fwr及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种超短自组装抗菌肽FWR及其制备方法与应用，抗菌肽FWR的序列如下：Fmoc‑WRR^DF^DF‑NH₂，其中Fmoc为9‑芴甲氧羰基，^DF为D型苯丙氨酸。制备方法位于多肽WR的C端由两个D型苯丙氨酸作为基础，提高抗菌肽的稳定性，且C端进行酰胺化；色氨酸为多肽提供疏水性；增加精氨酸数量为抗菌肽提供足够的正电荷数，从而提高多肽的抗菌活性。在WR的N端引入Fmoc保护基诱导多肽自组装，得到FWR。在较低的浓度下对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌均有很强的抑制作用。本发明的抗菌肽FWR是一条具有自组装能力，拥有较好抗菌活性和生物相容性的抗菌肽。

Description

一种超短自组装抗菌肽FWR及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种超短自组装抗菌肽FWR及其制备方法与应用。

背景技术

制药行业的发展实现了抗生素的大规模使用，但抗生素滥用现象也随之出现，这导致了细菌开始对抗生素产生耐药性。开发新型抗菌剂是解决细菌产生耐药性危机的办法之一。抗菌肽是机体免疫***的关键组成部分，具有广谱抑菌活性。不同于抗生素单一的与特异性分子受体结合的作用机制，抗菌肽主要通过物理作用破坏细胞膜完整性引起细胞质外流，从而达到杀灭靶细胞的目的，这种作用机制使得细菌不易产生耐药性。抗菌肽的发现为开发新型抗菌剂提供了新的方向。自组装纳米肽的生物学活性较高，有很好的生物相容性和稳定性，在药物载体、抗菌等领域具有良好的应用前景。近年的研究发现多肽连接某些疏水性较高的官能团可以自组装形成纳米结构，进而发挥良好的生物相容性、高稳定性等优点，表现出不同于单体多肽分子的特性和优势，在药物传递、组织工程、抗菌等领域具有良好的应用前景。为了得到具有良好抗菌活性的抗菌肽，研究者们发现增加氨基酸个数可以提高抗菌肽的抑菌活性，但肽链长度的增加对肽自身的疏水性、净电荷数、两亲性和螺旋性均会产生影响，这些因素保持微妙的平衡才能保证抗菌肽具有较优的抗菌活性。这使得设计抗菌肽这一工作变得复杂与繁琐，肽链长度的增加也提高了抗菌肽的合成成本。并且在实际应用中，由于天然抗菌肽的半衰期短、稳定性差、合成费用高昂的局限性，限制了其在畜牧业中的应用。

发明内容

基于以上背景的不足之处，本发明提供一种超短自组装抗菌肽FWR的，利用Fmoc基团作为主要的自组装驱动力，诱导抗菌肽进行自组装；在氨基酸数量较少的基础上，抗菌肽仍保持较好的抑菌活性，以解决传统抗菌肽肽链过长，合成过程复杂，合成成本高昂的不足。

本发明所采用的技术方案如下：一种超短自组装抗菌肽FWR，其序列如下：Fmoc-WRR^DF^DF-NH₂，其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，^DF为D型苯丙氨酸。

本发明的另一目的是提供一种超短自组装抗菌肽FWR的制备方法，步骤如下：

(1)多肽WR的序列为：WRR^DF^DF，其C端由两个D型苯丙氨酸作为基础，提高抗菌肽的稳定性，且C端进行酰胺化；色氨酸为多肽提供疏水性；增加精氨酸的数量为多肽WR提供足够的正电荷数，在多肽WR的N端引用Fmoc保护基作为自组装驱动力，诱导多肽自组装，所得的多肽命名为FWR；

(2)采用固相化学合成法，使用多肽合成仪合成肽树脂；

(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定，即完成对抗菌肽FWR的制备。

本发明采用的Fmoc保护基全称为9-芴甲氧羰基，是一个芳香性基团，可以通过π-π堆积的分子间作用力诱导短肽形成纳米结构。研究表明，以Fmoc保护基作为主要自组装驱动力形成的纳米肽，在氨基酸较少的情况下仍能保持较好的抑菌活性及稳定性。

本发明的另一目的在于提供如上所述的一种超短自组装抗菌肽FWR在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌引发的感染性疾病药物中的应用；所述的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌；所述的革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。

本发明具有如下优点及有效果：本发明的抗菌肽FWR，具有较好的自组装能力，多肽序列短，仅有5个氨基酸，合成过程简单，对制备的抗菌肽进行自组装能力、抑菌活性、细胞毒性试验，发现FWR在PB缓冲液中具有较好的自组装能力，通过计算，FWR的临界胶束浓度约为27μM，在透射电镜下可以看到规则的球形结构。在较低的浓度下对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有很强的抑制作用。而用高浓度的FWR处理RAW264.7细胞后，细胞仍有很高的存活率，有很好的生物相容性。综上所述，本发明的FWR是一条具有自组装能力，拥有较好抗菌活性的抗菌肽，具有成为抗菌药物的潜力，有很高的应用价值。

附图说明

图1为多肽WR的反相高效液相色谱图；

图2为抗菌肽FWR的反相高效液相色谱图；

图3为多肽WR的质谱图；

图4为抗菌肽FWR的质谱图；

图5为多肽WR的在水环境(a)或PB环境(b)1,8-ANS荧光光谱图；

图6为抗菌肽FWR的在水环境(a)或PB环境(b)1,8-ANS荧光光谱图；

图7为多肽WR的在水环境(a)或PB环境(b)临界胶束浓度图；

图8为抗菌肽FWR的在水环境(a)或PB环境(b)临界胶束浓度图；

图9为抗菌肽FWR在水环境(a)或PB环境(b)中的透射电镜图；

图10为多肽WR和抗菌肽FWR的细胞毒性图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

多肽WR的C端是两个D型苯丙氨酸，且C端进行酰胺化；色氨酸为多肽提供疏水性；增加精氨酸。在多肽WR的N端引入Fmoc保护基诱导多肽自组装，所得的抗菌肽命名为FWR，抗菌肽序列如表1所示。

表1抗菌肽氨基酸序列

实施例2

固相化学合成法合成FWR抗菌肽

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后用哌啶脱保护反应30min后，去除哌啶，并用二甲基甲酰胺(DMF)清洗并检测脱保护颜色。再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)按照多肽中氨基酸的顺序依次从C端合成到N端，直至合成完毕；

2、在上述得到的肽树脂中，加入二氯甲烷(DCM)反应30min，用DMF洗涤3遍后检测，确定所有氨基酸已正确连接。将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水***，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水***洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽。

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，在反相高效液相色谱图和质谱图中，WR显示的分子量(如图1、3所示)为809.95。FWR显示的分子量(如图2、4所示)为1032.19，抗菌肽的纯度均大于95％。

实施例3：自组装抗菌肽的表征

1、1,8-ANS荧光光谱的测定：8-苯胺基-1-萘磺酸盐(1,8-ANS)是一种用于检测分子自组装能力的外源荧光染料，可与多肽组装体的疏水核心结合，造成自身荧光性质的改变。将抗菌肽与无菌水或PB(10mM,pH＝7.4)混合，获得不同浓度的抗菌肽稀释液。50μL的1,8-ANS在避光的条件下与稀释液混合，在激发波长360nm，发射波长420nm-670nm的条件下测定荧光值。所得荧光值绘制曲线如图5和图6。

2、临界胶束浓度测定:尼罗红染料是一种疏水性荧光探针，常用来检测多肽的临界胶束浓度(CMC)。使用无菌水或PB(10mM,pH＝7.4)稀释抗菌肽至不同浓度，50μL的尼罗红溶液加入到不同浓度的抗菌肽稀释液中，全程避光。用酶标仪在激发波长为550nm，发射波长为600-750nm的条件下检测样品的尼罗红荧光值。以多肽浓度的对数值lgC为横坐标，校正后的平均荧光强度值为纵坐标绘制曲线(如图7和图8)，其交点处所对应的肽浓度为临界胶束浓度。

3、自组装抗菌肽微观形态的观察：将多肽储备液(2.56mM)用10mM，pH＝7.4的PB稀释至临界胶束浓度，37℃恒温箱孵育24h，使多肽充分自组装。用移液枪吸取100μL滴到铜网上，静置约2min，用滤纸轻轻吸走多余液体，让残余的多肽溶液自然干燥约2min，然后加入10μL磷钨酸进行染色，3分钟后，用滤纸小心去除多余的染色溶液。使用透射电镜观察多肽的纳米结构(如图9)。

抗菌肽的自组装表征试验表明，在1,8-ANS荧光光谱测定中，WR在水中与PB缓冲液中均未引起荧光强度的增加。而FWR在水中和PB缓冲液两种环境中均明显引起ANS荧光强度增加，并伴随着蓝移现象。在PB环境中，FWR的ANS荧光强度表现出更高的荧光值，说明在PB溶液环境中FWR更容易发生聚集。测定临界胶束浓度试验中，WR在两种溶液中仍未引起荧光强度改变。FWR在水中的荧光值基本保持不变，没有出现拐点，而在PB溶液环境下，FWR的浓度大于27μM时，尼罗红荧光强度开始增加，通过计算拐点，FWR的CMC值约为27μM，表明此肽在PB缓冲液中具有更强的自组装能力。使用透射电镜观察浓度为27μM的抗菌肽FWR，可以明显看到FWR在PB环境下形成了规则的球形结构。

实施例4：抗菌肽生物学活性的测定

1、抗菌活性的测定：抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)采用微量肉汤稀释法测定。细菌在摇速为220rpm，温度为37℃的摇床中孵育过夜，第二天转移至新的、无菌的MHB中培养至细胞生长的对数期。使用分光光度计将细菌的OD值调至0.4左右，将稀释1000倍后的细菌培养液添加到50μL含有不同浓度抗菌肽的BSA中，在37℃下孵育18-24h。孵育结束后，观察并测量492nm的光密度，在视觉和分光光度计下未观察到微生物生长的抗菌肽浓度为MIC。不含细菌的MHB作为阴性对照，含有细菌的MHB用作阳性对照。测试进行3次重复，每个重复两个平行。检测结果见表2。

表2抗菌肽的抑菌活性(μM)

通过表2可以看出，WR对于革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌均无活性，而Fmoc基团引入后得到的FWR对于革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌均有较好的抑菌活性。

2、抗菌肽细胞毒性测定：通过噻唑蓝(MTT)比色法对抗菌肽的细胞毒性进行检测，主要方法如下：在96孔板中每孔加入4.0×10⁵个真核细胞系小鼠巨噬细胞RAW264.7，然后用抗菌肽进行处理，抗菌肽的浓度从2-64μM变化。在37℃下培养4h，然后再与MTT(25μL,0.5mg/ml)培育3小时，然后再1,000×g条件下离心5分钟。上清弃去。随后，用150μL的二甲基亚砜(DMSO)去溶解孔底的甲瓒，细胞毒性可以通过酶标仪在492nm的吸光值进行检测。检测结果见图10。

通过图10可以看出，FWR在浓度为64μM时，小鼠RAW264.7细胞仍有很高的存活率，该浓度是最小抑菌浓度的8倍以上。这表明FWR在高浓度下也未对RAW264.7细胞产生细胞毒性，有很好的生物相容性。

综上所述，FWR以Fmoc保护基作为主要的自组装驱动力，成功地在PB环境中形成纳米结构，在透射电镜下观察到稳定、规则的球状结构。在较低的浓度下对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有很强的抑制作用。而FWR在高浓度下也未对RAW264.7细胞产生细胞毒性，有很好的生物相容性。以上结果表明，FWR具有成为抗菌药物的潜力，有很高的应用价值。

Claims (3)

1.一种超短自组装抗菌肽FWR，其特征在于，其序列如下：Fmoc-WRR^DF^DF-NH₂，其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，^DF为D型苯丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的一种超短自组装抗菌肽FWR的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)多肽WR的序列为：WRR^DF^DF，其C端由两个D型苯丙氨酸作为基础，提高抗菌肽的稳定性，且C端进行酰胺化；色氨酸为多肽提供疏水性；增加精氨酸的数量为多肽WR提供足够的正电荷数，在多肽WR的N端引用Fmoc保护基作为自组装驱动力，诱导多肽自组装，所得的多肽命名为FWR；

(2)采用固相化学合成法，使用多肽合成仪合成肽树脂；

(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定，即完成对抗菌肽FWR的制备。

3.根据权利要求1所述的一种超短自组装抗菌肽FWR在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌引发的感染性疾病药物中的应用；所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌；所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。

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