CN114685526A - 一种托吡酯衍生物、免疫原、抗托吡酯特异性抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种托吡酯衍生物、免疫原、抗托吡酯特异性抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种托吡酯衍生物、免疫原、抗托吡酯特异性抗体及其制备方法与应用。首先将新型托吡酯衍生物与经过基因工程改造得到的重组骆驼血清白蛋白偶联制得托吡酯人工抗原，再用托吡酯人工抗原免疫实验动物获得抗托吡酯特异性抗体，经ELISA检测表明该特异性抗体的特异性强、灵敏度高，干扰实验显示该特异性抗体与100种常见药物无任何交叉反应；将抗托吡酯特异性抗体应用于制备托吡酯检测试剂，包括托吡酯均相酶免疫检测试剂与托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂，所述检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对托吡酯的高通量、快速化检测。

Description

一种托吡酯衍生物、免疫原、抗托吡酯特异性抗体及其制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及一种托吡酯衍生物、免疫原、抗托吡酯特异性抗体及其制备方法与应用，属于生物医学检测技术领域。
背景技术
托吡酯（Topiramate, TPM）是一种新型的抗癫痫药物，化学结构为2,3:4,5-双-0(1-甲基亚乙基)-β-右旋-氨基磺酸吡喃果糖。托吡酯与其他抗癫痫药物的结构式截然不同，它是自然态单糖基右旋果糖的硫代物，其分子式为：C12H12NO8S，相对分子量为：339.36。托吡酯主要用于治疗单纯和复杂部分性发作及全身强直-阵挛性发作。临床上以单药治疗或在原抗癫痫药的基础上作为添加药物，均显示有良好的效果。在欧美已广泛被用于治疗各种类型的癫痫, 现在我国也已用于临床。托吡酯生物利用度高，且吸收迅速，单次服用托吡酯100mg的生物利用度约为80%，其吸收速率和速度不受食物的影响，约2小时后可达血浆峰浓度。托吡酯在血药浓度1~259mg/L范围内仅有13%~17％与血浆蛋白结合，多次给药后托吡酯结合位点饱和。肾清除率17mL/h , 肾功能正常者连续口服4d后达稳态血浓度。每日2次给药可使血药峰浓度（Cmax）和药时曲线下面积（AUC）随剂量而增加。达稳态后血浆清除半衰期为21h。
对于肝、肾或胃肠功能不良患者，儿童、老人及孕期妇女等随着患者的年龄、性别、体重、激素水平变化而影响药物吸收代谢分布的患者，与其它抗癫痫药物进行合并用药的患者，及时监测血清中托吡酯水平和及时调整治疗剂量是至关重要的。此外，患者用药依从性难以判断、药物耐受性不佳、治疗剂量下无效以及可能存在药代动力学药物间相互作用等情况下，测定托吡酯血药浓度是非常有用的。因此，对给药患者血液中托吡酯的浓度进行监测可以制定和调整个体化给药方案，提高疗效，保障用药安全。
托吡酯的血药浓度检测方法有多种，包括荧光偏振免疫测定法(FPIA)、气相色谱氮磷检测法（GC-NPD）、气相色谱串联质谱（GC/MS）、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-串联质谱(HPLC/MS)等。荧光偏振免疫法利用测定体系荧光偏振程度与待测抗原浓度呈反比关系的原理，获得样本中托吡酯及其代谢物的总浓度信息。FPIA法测定托吡酯最大的缺陷在于FPIA专属性不强，测定结果中常包含托吡酯的代谢物，从而导致测定结果与临床疗效存在偏差，并且试剂价格昂贵，给患者带来沉重的经济负担，导致临床上推广使用困难。气相色谱氮磷检测法可将标本中的理化性质相近的药物分离进行定量分析，但是物质需要在气化状态下进行，样本需有挥发性，且对样本的耐热性要求较高。高效液相色谱法具有准确、灵敏、廉价的特点，但测定时间较长，且检测浓度有限，且该法操作繁琐、重现性较差、难以实现自动化监测，制约了其在临床检测上的大规模使用。液相色谱-串联质谱法可大大简化样品纯化过程，且结果不受托吡酯代谢产物的干扰，且线性范围广、定量下限低，但对试验的要求较高，其前处理较为复杂，条件不易控制。
因此，目前市面上缺乏线性范围宽、灵敏度高、准确度高、精密度高，检测时间短，样品处理简单，仪器自动化程度高，可多样本连续检测的托吡酯检测产品。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种托吡酯衍生物，该衍生物为新合成的化合物，自然界中不存在。
本发明的第一个目的采用以下技术方案实现：一种托吡酯衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure 90038DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ。
本发明的第二个目的在于提供一种如上所述的托吡酯衍生物的合成方法，该合成方法不同于常规合成方法，具有良好的合成效果，显著提高了托吡酯衍生物的合成效率。
本发明的第二个目的采用以下技术方案实现：一种如上述结构式Ⅰ所示的托吡酯衍生物的合成方法，反应过程如下式所示：
Figure 381080DEST_PATH_IMAGE002
；
具体的，反应过程包括以下步骤：
（A1）化合物2的合成：
Figure 36184DEST_PATH_IMAGE003
将化合物1(10 g，38.46 mmol)与Et3N(5.8 g，57.69 mmol)共同溶解于DCM(100mL)中，然后加入氨基磺酰氯(6.6 g，57.69 mmol)制成反应混合物，将此反应混合物在室温下搅拌过夜。反应结束后将反应混合物用纯化水、卤水洗涤，然后通过Na2SO4进行干燥与浓缩处理。将溶剂去除后的残留物通过硅胶层析柱进行纯化，得到化合物2。
（A2）左乙拉西坦衍生物的合成：
Figure 742977DEST_PATH_IMAGE004
将化合物2(5.0 g，14.75 mmol)溶解于THF(50 mL)中，然后加入二氢吡喃-2,6-二酮(5.0 g，44.25 mmol)与叔丁醇钾(5.0 g，44.25 mmol)，然后在40℃下搅拌过夜。将溶剂去除后的残留物通过硅胶层析柱进行纯化，得到托吡酯衍生物。
本发明的第三个目的在于提供一种托吡酯免疫原。
本发明的第三个目的采用以下技术方案实现：一种托吡酯免疫原，所述托吡酯免疫原由上述结构式Ⅰ所示的托吡酯衍生物与载体蛋白连接而成，其结构式如式Ⅱ所示：
Figure 432716DEST_PATH_IMAGE005
式Ⅱ；
其中，载体蛋白为重组骆驼血清白蛋白，进一步地，所述重组骆驼血清白蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
重组骆驼血清白蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：1）具体如下：
MKWVTFISLLFLFSKVYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEDKFKGLVLIAFSQYLQQCPFDDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAKDCDKSLHTLFGDKLCTVASLRETYKEMADCCEKQEPERNECFLQHKSDNPDLPKLKPEPKALCTAFQENEKRFGGKYLYEIARKHPYFYAPELLYYAHQYKHVFEECKKDADKAACLLPKLDALKERILASKARQRLRCTSIQKFGDRALKAWSVGHLSQKFPKADFAEISKIVTDLTKIHKECKQGDLLECADDRADLAKYFCDNQETIKSKLKECCEKPLLEKSHCIHEAERDKMPENLPAITEQFAEDKDVCKHYTEKKDVFLGMFLHEYARRHPEYAVSLLLRIAKEYEATLEDCKAKDDPHACYATVFDKLQHLADEPQNLVKQNCELFKKLGEYGFQNDILVRYTKRLPQVSTPTLKEVARGLGRVGTKCKTLPESNRMSCAEDYLSLILNRLCVLHEKTPVSPRVTKCCTESLVNRKPCFSSLTADETYEPKEFDEKTFTKHADLCSVSEPEKQIKKQTALAELLKHKPKAKDEQLKTVMEKFVAFVDKCCAKVDKEACFTVEVLALFVFMFVCLIPFAVKFDQARD
本发明的第四个目的在于提供一种如上所述的托吡酯免疫原的制备方法。
本发明的第四个目的采用以下技术方案实现：一种如上所述的托吡酯免疫原的制备方法，包括以下步骤：
（B1）载体蛋白溶液的制备：将上述的重组骆驼血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液；
（B2）托吡酯衍生物溶液的制备：将上述结构式Ⅰ所示的托吡酯衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到托吡酯衍生物溶液；
（B3）托吡酯免疫原的合成：将步骤（B2）得到的托吡酯衍生物溶液加入到步骤（B1）得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到托吡酯免疫原。
具体的，所述托吡酯免疫原的制备方法，包括以下步骤：
（b1）载体蛋白溶液的制备：将重组骆驼血清白蛋白溶解于0.35mol/L的磷酸钾缓冲液（pH=8.5）中，重组骆驼血清白蛋白的终浓度为5.0mg/mL，得到载体蛋白溶液；
（b2）托吡酯衍生物溶液的制备：将250.0mg上述的托吡酯衍生物、7.5mL二甲基甲酰胺、7.5mL乙醇、15.0mL的磷酸钾缓冲液（10.0mmol/L，pH=8.0）、150.0mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、90.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应3小时，得到托吡酯衍生物溶液；
（b3）托吡酯免疫原的合成：将步骤（b2）得到的托吡酯衍生物溶液逐滴加入到步骤（b1）得到的载体蛋白溶液中，并在-4℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到托吡酯免疫原。
本发明的第五个目的在于提供一种抗托吡酯特异性抗体。
本发明的第五个目的采用以下技术方案实现：一种抗托吡酯特异性抗体，所述抗托吡酯特异性抗体为使用上述的托吡酯免疫原对实验动物进行注射后所得到的特异性抗体，所述的实验动物为兔子、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠或马中的一种。
本发明的第六个目的在于提供一种如上所述的抗托吡酯特异性抗体的制备方法。
本发明的第六个目的采用以下技术方案实现：一种如上所述的抗托吡酯特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：
（C1）将上述的托吡酯免疫原用磷酸盐缓冲液稀释，得到托吡酯人工抗原溶液，然后将托吡酯人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对上述的实验动物进行多点注射；
（C2）3-6周后，再用相同的托吡酯人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物进行多点注射，之后每隔3-6周注射一次，共计注射3-10次；
（C3）对步骤（C2）中完成注射的实验动物取血，分离纯化，得到抗托吡酯特异性抗体。
具体的，所述抗托吡酯特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：
（c1）将上述的托吡酯免疫原用0.15mol/L磷酸钠缓冲液（pH=7.0）稀释至终浓度为3.5mg/mL，得到人工抗原溶液，然后将3.0mL人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；
（c2）4周后，再用3.0mL相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔子进行多点注射，之后每隔5周注射一次，共计注射6次；
（c3）对步骤（c2）完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗托吡酯特异性抗体。
本发明的第七个目的在于提供一种如上所述的抗托吡酯特异性抗体的应用。
本发明的第七个目的采用以下技术方案实现：一种如上所述的抗托吡酯特异性抗体的应用，将所述抗托吡酯特异性抗体用于制备托吡酯检测试剂，所述托吡酯检测试剂包括托吡酯均相酶免疫检测试剂与托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂。
优选地，上述的抗托吡酯特异性抗体的应用，所述托吡酯均相酶免疫检测试剂，由R1试剂与R2试剂组成，所述R1试剂包含上述的抗托吡酯特异性抗体与R1缓冲液，所述R2试剂包含托吡酯葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与R2缓冲液；
所述的R1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及Tris缓冲液，所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸，所述的辅酶为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
所述的托吡酯葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由上述结构式Ⅰ所示的托吡酯衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成；其结构式如式Ⅲ所示：
Figure 629080DEST_PATH_IMAGE006
式Ⅲ；
所述的R2缓冲液为含有牛血清白蛋白的Tris缓冲液。
具体的，所述托吡酯均相酶免疫检测试剂的制备方法，包含以下步骤：
（D1）将250.0mg牛血清白蛋白、250.0mg葡萄糖-6-磷酸及50.0mg氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入250mL Tris缓冲液（50mmol/L，pH=8.5）中搅拌溶解制成R1缓冲液，再将抗托吡酯特异性抗体以1∶1000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀，再用1.0 mol/L的盐酸调节pH至7.6，制成R1试剂；
（D2）将250.0mg牛血清白蛋白加入250mL Tris缓冲液（100mmol/L，pH=8.7）中搅拌溶解制成R2缓冲液，再将托吡酯葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀，再用1.0 mol/L的盐酸调节pH至8.0，制成R2试剂。
所述的托吡酯葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法，包含以下步骤：
（E1）称取20.0 mg活力单位为200KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在室温条件下溶解于50.0mL磷酸钠（100mmol/L，pH=8.0）缓冲液中，然后加入150.0 mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、75.0 mg葡萄糖-6-磷酸以及0.75 mL卡必醇，再逐滴加入2.5 mL二甲基亚砜，搅拌溶解，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
（E2）在无水状态下称取15.0 mg上述结构式Ⅰ所示的托吡酯衍生物，溶解于500.0µL二甲基甲酰胺中，将上述溶液温度降到0℃后加入4.5 µL三丁胺、2.5 µL氯甲酸异丁酯、3.5 µL N，N′-二环己基碳二亚胺，0℃下搅拌45分钟，得到托吡酯衍生物激活液；
（E3）将托吡酯衍生物激活液逐滴加入到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，-4℃搅拌反应12小时，反应结束后经G-25凝胶层析柱纯化得到托吡酯葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物。
优选地，上述的抗托吡酯特异性抗体的应用，所述托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂，由L1试剂与L2试剂组成；
所述L1试剂由上述的抗托吡酯特异性抗体、pH=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、促凝剂以及防腐剂组成；
所述L2试剂由托吡酯-牛血清白蛋白复合体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒、pH=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸以及防腐剂组成；
所述的托吡酯-牛血清白蛋白复合体由上述结构式Ⅰ所示的托吡酯衍生物与牛血清白蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅳ所示：
Figure 771479DEST_PATH_IMAGE007
式Ⅳ；
所述的聚苯乙烯胶乳颗粒直径范围为50-250nm；
所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或巴比妥缓冲液中的一种；
所述促凝剂为PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000或硫酸葡聚糖钠中的一种；
所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、苯酚或乙基汞硫代硫酸钠中的一种。
具体的，所述托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，包含以下步骤：
（F1）将5.0mL的抗托吡酯特异性抗体溶解于250.0mL磷酸钾缓冲液（50.0 mmol/LpH=8.0）中，然后添加100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μL吐温-20、250.0μL丙三醇、100.0μL的乙二胺四乙酸、150.0μL的PEG-4000以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，调节pH=7.3，制成L1试剂；
（F2）将1.5mg表面带有羧基的直径为125nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入15.0mL的MES缓冲液（50.0mmol/L，pH=7.0）中，然后加入5.0mg碳二亚胺，在25℃下反应3小时，制成胶乳颗粒溶液，再将1.2mg托吡酯-牛血清白蛋白复合体用7.5mL的硼酸盐缓冲液（50.0mmol/L，pH=9.2）稀释后，立即加入到上述胶乳颗粒溶液中，在41℃下反应18小时，然后加入3.0mL的甘氨酸缓冲液（100.0mmol/L，pH=8.0）搅拌3小时，反应终止后离心去除上清液，再将沉淀物用20.0mL的Tris-HCl缓冲液（50.0mmol/L，pH=8.0）洗涤3次，再用50.0mL的甘氨酸缓冲液（50.0mmol/L，pH=8.6）稀释成胶乳悬浊液，最后加入质量分数为100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μL吐温-20、250.0μL丙三醇、100.0μL的乙二胺四乙酸以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，制成L2试剂。
所述的托吡酯-牛血清白蛋白复合体的制备方法，包含以下步骤：
将10.0mg牛血清白蛋白用7.5mL的磷酸钠缓冲液（100.0mmol/L，pH=7.5）稀释，然后加入100.0mg上述结构式Ⅰ所示的托吡酯衍生物，再加入50.0mg的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺，在0℃下反应10 小时，再用100.0mL磷酸盐缓冲液（100.0mmol/L，pH=7.5）在-4℃下透析12小时，得到托吡酯-牛血清白蛋白复合体。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明设计的托吡酯衍生物及其合成方法均为针对性的新设计与研究，在现有技术中并不存在。
2、本发明使用经过基因工程改造得到的重组骆驼血清白蛋白与托吡酯衍生物偶联得到托吡酯免疫原，偶联效率高，显著提高托吡酯免疫原的免疫原性。使用本发明的托吡酯免疫原制备得到的抗托吡酯特异性抗体的特异性强、灵敏度高，并且与100种常见药物无任何交叉反应，因此能够用于制备具有较高的准确性、精密度、灵敏度和特异性的托吡酯检测试剂。
3、本发明的两种托吡酯检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对托吡酯高通量、快速化的检测，能同时测定多个样品，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低托吡酯检测成本，有利于临床推广使用。
附图说明
图1为实施例4 托吡酯的ELISA检测标准曲线；
图2为实施例8托吡酯均相酶免疫检测试剂校准曲线；
图3为实施例10托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂、仪器、设备、耗材均可从正规渠道商购买获得。
实施例1：托吡酯衍生物的合成
通过以下合成路线合成托吡酯衍生物：
Figure 361859DEST_PATH_IMAGE009
具体的合成步骤如下：
（1）化合物2的合成：
Figure 93054DEST_PATH_IMAGE003
将化合物1(10 g，38.46 mmol)与Et3N(5.8 g，57.69 mmol)共同溶解于DCM(100mL)中，然后加入氨基磺酰氯(6.6 g，57.69 mmol)制成反应混合物，将此反应混合物在室温下搅拌过夜。反应结束后将反应混合物用纯化水、卤水洗涤，然后通过Na2SO4进行干燥与浓缩处理。将溶剂去除后的残留物通过硅胶层析柱进行纯化，得到5.0 g化合物2为白色固体。
（2）左乙拉西坦衍生物的合成：
Figure 961784DEST_PATH_IMAGE004
将化合物2(5.0 g，14.75 mmol)溶解于THF(50 mL)中，然后加入二氢吡喃-2,6-二酮(5.0 g，44.25 mmol)与叔丁醇钾(5.0 g，44.25 mmol)，然后在40℃下搅拌过夜。将溶剂去除后的残留物通过硅胶层析柱进行纯化，得到4.0 g托吡酯衍生物为无色油状物。
实施例2：托吡酯免疫原的制备
托吡酯免疫原的制备方法具体步骤如下：
（1）载体蛋白溶液的制备：将重组骆驼血清白蛋白溶解于0.35mol/L的磷酸钾缓冲液（pH=8.5）中，重组骆驼血清白蛋白的终浓度为5.0mg/mL，得到载体蛋白溶液；
（2）托吡酯衍生物溶液的制备：将250.0mg上述的托吡酯衍生物、7.5mL二甲基甲酰胺、7.5mL乙醇、15.0mL的磷酸钾缓冲液（10.0mmol/L，pH=8.0）、150.0mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、90.0mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应3小时，得到托吡酯衍生物溶液；
（3）托吡酯免疫原的合成：将步骤（2）得到的托吡酯衍生物溶液逐滴加入到步骤（1）得到的载体蛋白溶液中，并在-4℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到托吡酯免疫原。
实施例3：抗托吡酯特异性抗体的制备
抗托吡酯特异性抗体的制备方法具体步骤如下：
（1）将上述的托吡酯免疫原用0.15mol/L磷酸钠缓冲液（pH=7.0）稀释至终浓度为3.5mg/mL，得到人工抗原溶液，然后将3.0mL人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；
（2）4周后，再用3.0mL相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔子进行多点注射，之后每隔5周注射一次，共计注射6次；
（3）对步骤（2）完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗托吡酯特异性抗体。
实施例4：ELISA法检验抗托吡酯特异性抗体的性能
1.托吡酯的ELISA检测标准曲线的建立：
（1）标准品的制备：
将托吡酯纯品粉末(购于Sigma公司) 溶解于甲醇溶液，制备成1mg/mL的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为16.00μg/mL、8.00μg/mL、4.00μg/mL、2.00μg/mL、1.00μg/mL、0.00μg/mL的标准溶液。其中，ELISA缓冲液由50.0mmol/L的Tris缓冲液，质量分数为1.5%的NaCl以及体积分数为0.25％的BSA配制而成。
（2）利用托吡酯的ELISA检验方法制备标准曲线：
用磷酸钾缓冲液（50.0mmol/L，pH=8.0）将实施例3中所制备的抗托吡酯特异性抗体稀释成1 : 10000的终浓度溶液，100μL/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置18小时；用磷酸钾缓冲液将包被有抗托吡酯特异性抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μL/孔的体积分数0.5％的BSA溶液，4℃下放置12小时。然后用磷酸钾缓冲液洗涤3次，加入20μL/孔的标准溶液。再加入100μL/孔工作浓度的HRP-托吡酯偶联物；室温下孵育30min后磷酸钾缓冲液洗板5次；然后每孔加入100μL的TMB 底物，室温孵育30min。再每孔加入100μL的终止液（2.0mol/L的硫酸）。使用酶标仪测定450nm的吸光值。根据各标准溶液所对应的450nm的吸光值定标，制作标准曲线，结果如图1所示。
待测样品中托吡酯含量的检测：
（1）制作待测样品：
制备方法：将托吡酯纯品粉末(购于Sigma公司) 溶解于甲醇溶液制成1.0mg/mL的储存液，并将此储存液稀释于空白血浆中，至终浓度分别为0.00μg/mL、1.50μg/mL、6.00μg/mL、12.00μg/mL，分别形成空白、低、中、高浓度的血浆样本。所述空白血浆为不含托吡酯的健康人血浆。
（2）测试方法：
利用上述托吡酯的ELISA检验方法，将上述空白、低、中、高浓度的血浆样本代替标准溶液，测试上述空白、低、中、高浓度的血浆样本在450nm的吸光值。
（3）测试结果：
对照图1中所示的托吡酯的ELISA检验的标准曲线，计算每个样本中托吡酯含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中托吡酯的实际含量计算回收率，结果如表1所示。
表1 托吡酯的ELISA检测结果
血浆样本 空白 低值 中值 高值
样本浓度(μg/mL) 0.00 1.50 6.00 12.00
测定1 0.00 1.52 5.98 12.20
测定2 0.00 1.51 6.07 11.88
测定3 0.00 1.49 6.03 11.96
平均值(μg/mL) 0.00 1.51 6.03 12.01
回收率(％) - 100.67 100.50 100.08
由表1中结果可知：使用本发明托吡酯特异性抗体的ELISA检测方法测定不同浓度样本中的托吡酯回收率都较高，均在97%-103%之间，说明本发明所述的抗托吡酯特异性抗体可以用于样本中托吡酯的检测，并且灵敏度高，检测结果准确度高。
实施例5：100种常见药物干扰试验
选取100种常见药物作为干扰物进行干扰试验，将100种常见药物纯品粉末配制成浓度为100.0μg/mL的溶液作为待测干扰物样本，采用实施例4的ELISA检验方法对相应干扰物的浓度进行检测，100种常见药物名称以及检测结果详见表2。
表2 常见药物干扰试验检测结果
序号 化合物名称 实际检测值(μg/mL) 序号 化合物名称 实际检测值(μg/mL)
1 阿司匹林 0.00 2 苯丙醇胺 0.00
3 β-苯基乙胺 0.00 4 普鲁卡因酰胺 0.00
5 *** 0.00 6 普鲁卡因 0.00
7 氨苄青霉素 0.00 8 奎尼丁 0.00
9 甲氨二氮卓 0.00 10 佐美酸 0.00
11 氯丙嗪 0.00 12 苯肾上腺素 0.00
13 氯拉卓酸 0.00 14 桂皮酰艾克宁 0.00
15 二甲苯氧庚酸 0.00 16 芽子碱 0.00
17 非诺洛芬 0.00 18 地西洋 0.00
19 甲基*** 0.00 20 可替宁 0.00
21 龙胆酸 0.00 22 阿替洛尔 0.00
23 吉非贝齐 0.00 24 心得安 0.00
25 氢可酮 0.00 26 苯乙哌啶酮 0.00
27 布洛芬 0.00 28 苯基丁氮酮 0.00
29 丙咪嗪 0.00 30 麦角酸二乙基酰胺 0.00
31 二氨基二苯砜 0.00 32 ***酚 0.00
33 萘普生 0.00 34 洛哌丁胺 0.00
35 氢*** 0.00 36 异克舒令 0.00
37 哌替啶 0.00 38 苯基丙氨酸 0.00
39 烯丙羟***酮 0.00 40 盐酸氟西汀 0.00
41 麻黄素 0.00 42 柳丁氨醇 0.00
43 烟酰胺 0.00 44 青霉素 0.00
45 甲胺呋硫 0.00 46 甲基二乙醇胺 0.00
47 异戊巴比妥 0.00 48 二亚甲基双氧*** 0.00
49 甲撑二氧*** 0.00 50 琥珀酸多西拉敏 0.00
51 四氢***酚 0.00 52 纳布啡 0.00
53 制霉菌素 0.00 54 去甲*** 0.00
55 乙酰*** 0.00 56 羟考酮 0.00
57 苄非他明 0.00 58 克他命 0.00
59 异丙嗪 0.00 60 苯海拉明 0.00
61 阿司帕坦 0.00 62 苯丁胺 0.00
63 阿立哌唑 0.00 64 氟康唑 0.00
65 氯氮平 0.00 66 呋塞米 0.00
67 艾司西酞普兰 0.00 68 加巴喷丁 0.00
69 伊马替尼 0.00 70 华法林 0.00
71 拉莫三嗪 0.00 72 瑞舒伐他汀 0.00
73 利奈唑胺 0.00 74 对乙酰氨基酚 0.00
75 利培酮 0.00 76 舒必利 0.00
77 舍曲林 0.00 78 氟伏沙明 0.00
79 奥卡西平 0.00 80 氟西汀 0.00
81 文拉法辛 0.00 82 齐拉西酮 0.00
83 伏立康唑 0.00 84 氟哌啶醇 0.00
85 左乙拉西坦 0.00 86 亚胺培南 0.00
87 奥氮平 0.00 88 阿昔替尼 0.00
89 唑尼沙胺 0.00 90 培唑帕尼 0.00
91 阿米替林 0.00 92 瑞戈非尼 0.00
93 氯丙嗪 0.00 94 异烟肼 0.00
95 多虑平 0.00 96 利福平 0.00
97 帕罗西汀 0.00 98 左氧氟沙星 0.00
99 氯霉素 0.00 100 莫西沙星 0.00
测定结果显示：采用实施例4的ELISA检验方法对相应干扰物的浓度进行检测，上述100种常见药物实际检测值均为0.00μg/mL。由此可见，本发明的抗托吡酯特异性抗体具有较强的抗原识别特异性，与100种常见药物无任何交叉反应。
实施例6：托吡酯均相酶免疫检测试剂的制备
托吡酯均相酶免疫检测试剂的制备方法，具体步骤如下：
（1）将250.0mg牛血清白蛋白、250.0mg葡萄糖-6-磷酸及50.0mg氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入250mL Tris缓冲液（50mmol/L，pH=8.5）中搅拌溶解制成R1缓冲液，再将抗托吡酯特异性抗体以1∶1000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀，再用1.0 mol/L的盐酸调节pH至7.6，制成R1试剂；
（2）将250.0mg牛血清白蛋白加入250mL Tris缓冲液（100mmol/L，pH=8.7）中搅拌溶解制成R2缓冲液，再将托吡酯葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀，再用1.0 mol/L的盐酸调节pH至8.0，制成R2试剂。
所述的托吡酯葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法，包含以下步骤：
（1）称取20.0 mg活力单位为200KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在室温条件下溶解于50.0mL磷酸钠（100mmol/L，pH=8.0）缓冲液中，然后加入150.0 mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、75.0 mg葡萄糖-6-磷酸以及0.75 mL卡必醇，再逐滴加入2.5 mL二甲基亚砜，搅拌溶解，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
（2）在无水状态下称取15.0 mg实施例1合成的托吡酯衍生物，溶解于500.0 µL二甲基甲酰胺中，将上述溶液温度降到0℃后加入4.5 µL三丁胺、2.5 µL氯甲酸异丁酯、3.5 µL N，N′-二环己基碳二亚胺，0℃下搅拌45分钟，得到托吡酯衍生物激活液；
（3）将托吡酯衍生物激活液逐滴加入到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，-4℃搅拌反应12小时，反应结束后经G-25凝胶层析柱纯化得到托吡酯葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物。
实施例7：托吡酯校准品、质控品的制备
（1）校准品的制备：将托吡酯纯品粉末分别加入6份浓度为50.0mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.00μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、8.00μg/mL、16.00μg/mL，然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠，搅拌均匀，即为托吡酯校准品（6个浓度）。
（2）质控品的制备：将托吡酯纯品粉末分别加入4份浓度为50.0mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.00μg/mL、1.50μg/mL、6.00μg/mL、12.00μg/mL，然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠，搅拌均匀，即为托吡酯质控品（4个浓度）。
实施例8：托吡酯均相酶免疫检测试剂校准曲线制作及质控实验
1. 制作托吡酯均相酶免疫检测校准曲线：
在迈瑞 BS480全自动生化分析仪中放入R1试剂、R2试剂及校准品，然后对生化分析仪进行反应参数设置，具体参数详见表3；实际操作过程中需不断调整R1试剂和R2试剂的体积比例，同时调整测光点，最后由生化分析仪自动得出均相酶免疫检测校准曲线，如图2所示。
表3 迈瑞 BS480全自动生化分析仪反应参数设置
项目名称 托吡酯
R1试剂 160.0µL
R2试剂 40.0µL
样本量 10.0µL
定标方法 两点终点法
主波长 340nm
次波长 405nm
反应时间 10分钟
温育时间 8分钟
反应方向 上升
结果 μg/mL
结果精度 0.01
拟合方法 Line graph
校准品浓度 0.00μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、8.00μg/mL、16.00μg/mL
2. 质控品检测实验：
利用上述的托吡酯均相酶免疫检测方法，对质控品进行测定，并根据步骤1中制作的均相酶免疫检测校准曲线，计算每个质控品中托吡酯的含量，每个质控品重复测定10次，检测结果及数据分析详见表4。
表4 托吡酯均相酶免疫检验试剂检测结果及数据分析
质控品 空白 低值 中值 高值
浓度(μg/mL) 0.00 1.50 6.00 12.00
测试1 0.00 1.50 6.01 12.11
测试2 0.00 1.48 6.05 12.05
测试3 0.00 1.51 5.94 12.50
测试4 0.00 1.52 6.03 11.95
测试5 0.00 1.50 6.10 12.13
测试6 0.00 1.53 6.10 12.00
测试7 0.00 1.50 6.07 12.36
测试8 0.00 1.52 6.00 11.80
测试9 0.00 1.49 5.90 12.22
测试10 0.00 1.52 5.98 12.17
平均值(μg/mL) 0.00 1.51 6.02 12.13
标准差（SD） / 0.02 0.07 0.20
精密度（CV%） / 1.04 1.10 1.66
回收率（%） / 100.67 100.33 101.08
实验结果表明：测定不同浓度质控品中托吡酯含量的CV值均低于5%，回收率均在95%-105%之间，说明本发明的托吡酯均相酶免疫检测试剂测定生物样本中托吡酯含量的精密度较高，结果准确。
实施例9：托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备
托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，包含以下步骤：
（F1）将5.0mL的抗托吡酯特异性抗体溶解于250.0mL磷酸钾缓冲液（50.0 mmol/LpH=8.0）中，然后添加100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μL吐温-20、250.0μL丙三醇、100.0μL的乙二胺四乙酸、150.0μL的PEG-4000以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，调节pH=7.3，制成L1试剂；
（F2）将1.5mg表面带有羧基的直径为125nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入15.0mL的MES缓冲液（50.0mmol/L，pH=7.0）中，然后加入5.0mg碳二亚胺，在25℃下反应3小时，制成胶乳颗粒溶液，再将1.2mg托吡酯-牛血清白蛋白复合体用7.5mL的硼酸盐缓冲液（50.0mmol/L，pH=9.2）稀释后，立即加入到上述胶乳颗粒溶液中，在41℃下反应18小时，然后加入3.0mL的甘氨酸缓冲液（100.0mmol/L，pH=8.0）搅拌3小时，反应终止后离心去除上清液，再将沉淀物用20.0mL的Tris-HCl缓冲液（50.0mmol/L，pH=8.0）洗涤3次，再用50.0mL的甘氨酸缓冲液（50.0mmol/L，pH=8.6）稀释成胶乳悬浊液，最后加入质量分数为100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μL吐温-20、250.0μL丙三醇、100.0μL的乙二胺四乙酸以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，制成L2试剂。
所述的托吡酯-牛血清白蛋白复合体的制备方法，包含以下步骤：
将10.0mg牛血清白蛋白用7.5mL的磷酸钠缓冲液（100.0mmol/L，pH=7.5）稀释，然后加入100.0mg实施例1合成的托吡酯衍生物，再加入50.0mg的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺，在0℃下反应10 小时，再用100.0mL磷酸盐缓冲液（100.0mmol/L，pH=7.5）在-4℃下透析12小时，得到托吡酯-牛血清白蛋白复合体。
实施例10：托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线制作及质控实验
1. 制作托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线：
在奥林巴斯AU480全自动生化分析仪中放入L1试剂、L2试剂及校准品，然后对生化分析仪进行反应参数设置，具体参数详见表5；实际操作过程中需不断调整L1试剂和L2试剂的体积比例，同时调整测光点，最后由生化分析仪自动得出胶乳增强免疫比浊检测校准曲线，如图3所示。
表5 奥林巴斯AU480全自动生化分析仪反应参数
项目名称 托吡酯
L1试剂 160.0µL
L2试剂 40.0µL
样本量 10.0µL
定标方法 两点终点法
主波长 570nm
次波长 412nm
反应时间 10分钟
温育时间 5分钟
反应方向 下降
结果 μg/mL
结果精度 0.01
拟合方法 Logit-log 4P
校准品浓度 0.00μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、8.00μg/mL、16.00μg/mL
2. 质控品检测实验：
利用上述的胶乳增强免疫比浊检测方法，对质控品进行测定，并根据步骤1中制作的胶乳增强免疫比浊检测校准曲线，计算每个质控品中托吡酯的含量，每个质控品重复测定10次，检测结果及数据分析详见表6。
表6 托吡酯胶乳增强免疫比浊试剂检测结果及数据分析
质控品 空白 低值 中值 高值
浓度(μg/mL) 0.00 1.50 6.00 12.00
测试1 0.00 1.52 6.04 12.01
测试2 0.00 1.53 6.03 12.00
测试3 0.00 1.50 5.96 11.90
测试4 0.00 1.52 5.93 12.07
测试5 0.00 1.51 6.09 12.20
测试6 0.00 1.47 6.20 12.13
测试7 0.00 1.51 5.97 11.87
测试8 0.00 1.51 6.03 12.04
测试9 0.00 1.48 6.11 12.05
测试10 0.00 1.50 5.95 12.18
平均值(μg/mL) 0.00 1.51 6.03 12.05
标准差（SD） / 0.02 0.08 0.11
精密度（CV%） / 1.22 1.40 0.90
回收率（%） / 100.67 100.50 100.42
实验结果表明：测定不同浓度质控品中托吡酯含量的CV值均低于5%，回收率均在95%-105%之间，说明本发明的托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂测定生物样本中托吡酯含量的精密度较高，结果准确。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思做出其它各种相应的变更以及修改，而所有的这些变更以及修改都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南苏阳医疗科技有限公司
<120> 一种托吡酯衍生物、免疫原、抗托吡酯特异性抗体及其制备方法与应用
<130> 2020.12.13
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 618
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Asp Lys Phe Lys Gly Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Asp Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Lys Asp Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Ser Leu Arg Glu Thr Tyr Lys Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Ser Asp Asn Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Glu Pro Lys
130 135 140
Ala Leu Cys Thr Ala Phe Gln Glu Asn Glu Lys Arg Phe Gly Gly Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Lys His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu
165 170 175
Leu Leu Tyr Tyr Ala His Gln Tyr Lys His Val Phe Glu Glu Cys Lys
180 185 190
Lys Asp Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Ala Leu
195 200 205
Lys Glu Arg Ile Leu Ala Ser Lys Ala Arg Gln Arg Leu Arg Cys Thr
210 215 220
Ser Ile Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Gly
225 230 235 240
His Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Asp Phe Ala Glu Ile Ser Lys
245 250 255
Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Ile His Lys Glu Cys Lys Gln Gly Asp
260 265 270
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Phe Cys
275 280 285
Asp Asn Gln Glu Thr Ile Lys Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys
290 295 300
Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile His Glu Ala Glu Arg Asp Lys
305 310 315 320
Met Pro Glu Asn Leu Pro Ala Ile Thr Glu Gln Phe Ala Glu Asp Lys
325 330 335
Asp Val Cys Lys His Tyr Thr Glu Lys Lys Asp Val Phe Leu Gly Met
340 345 350
Phe Leu His Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Glu Tyr Ala Val Ser Leu
355 360 365
Leu Leu Arg Ile Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Asp Cys Lys
370 375 380
Ala Lys Asp Asp Pro His Ala Cys Tyr Ala Thr Val Phe Asp Lys Leu
385 390 395 400
Gln His Leu Ala Asp Glu Pro Gln Asn Leu Val Lys Gln Asn Cys Glu
405 410 415
Leu Phe Lys Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Asp Ile Leu Val
420 425 430
Arg Tyr Thr Lys Arg Leu Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Lys Glu
435 440 445
Val Ala Arg Gly Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Lys Thr Leu Pro
450 455 460
Glu Ser Asn Arg Met Ser Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Ile Leu
465 470 475 480
Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Pro Arg Val
485 490 495
Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Lys Pro Cys Phe Ser
500 505 510
Ser Leu Thr Ala Asp Glu Thr Tyr Glu Pro Lys Glu Phe Asp Glu Lys
515 520 525
Thr Phe Thr Lys His Ala Asp Leu Cys Ser Val Ser Glu Pro Glu Lys
530 535 540
Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Leu Lys His Lys Pro
545 550 555 560
Lys Ala Lys Asp Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Glu Lys Phe Val Ala
565 570 575
Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Lys Val Asp Lys Glu Ala Cys Phe Thr
580 585 590
Val Glu Val Leu Ala Leu Phe Val Phe Met Phe Val Cys Leu Ile Pro
595 600 605
Phe Ala Val Lys Phe Asp Gln Ala Arg Asp
610 615

Claims (10)

1.一种托吡酯衍生物，其特征在于，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ。
2.一种如权利要求1所述的托吡酯衍生物的合成方法，其特征在于，所述合成方法如下式所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
3.一种托吡酯免疫原，其特征在于，所述托吡酯免疫原由权利要求1所述的托吡酯衍生物与载体蛋白连接而成，其结构式如式Ⅱ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
式Ⅱ；
其中，载体蛋白为重组骆驼血清白蛋白。
4. 根据权利要求3所述的托吡酯免疫原，其特征在于，所述重组骆驼血清白蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
5.一种如权利要求3-4任一项所述的托吡酯免疫原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（B1）载体蛋白溶液的制备：将权利要求3-4任一项中所述的重组骆驼血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液；
（B2）托吡酯衍生物溶液的制备：将权利要求1所述的托吡酯衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到托吡酯衍生物溶液；
（B3）托吡酯免疫原的合成：将步骤（B2）得到的托吡酯衍生物溶液加入到步骤（B1）得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到托吡酯免疫原。
6.一种抗托吡酯特异性抗体，其特征在于，所述抗托吡酯特异性抗体为使用权利要求3-4任一项所述的托吡酯免疫原对实验动物进行注射后所得到的特异性抗体，所述的实验动物为兔子、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠或马中的一种。
7.一种如权利要求6所述的抗托吡酯特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含以下步骤：
（C1）将权利要求3-4任一项所述的托吡酯免疫原用磷酸盐缓冲液稀释，得到托吡酯人工抗原溶液，然后将托吡酯人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对权利要求6中所述的实验动物进行多点注射；
（C2）3-6周后，再用相同的托吡酯人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物进行多点注射，之后每隔3-6周注射一次，共计注射3-10次；
（C3）对步骤（C2）中完成注射的实验动物取血，分离纯化，得到抗托吡酯特异性抗体。
8.如权利要求6-7任一项所述的抗托吡酯特异性抗体的应用，其特征在于，将所述抗托吡酯特异性抗体用于制备托吡酯检测试剂，所述托吡酯检测试剂包括托吡酯均相酶免疫检测试剂与托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂。
9.根据权利要求8所述的抗托吡酯特异性抗体的应用，其特征在于，所述托吡酯均相酶免疫检测试剂，由R1试剂与R2试剂组成，所述R1试剂包含权利要求6-7任一项所述的抗托吡酯特异性抗体与R1缓冲液，所述R2试剂包含托吡酯葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与R2缓冲液；
所述的R1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及Tris缓冲液，所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸，所述的辅酶为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
所述的托吡酯葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由权利要求1所述的托吡酯衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成；其结构式如式Ⅲ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
式Ⅲ；
所述的R2缓冲液为含有牛血清白蛋白的Tris缓冲液。
10.根据权利要求8所述的抗托吡酯特异性抗体的应用，其特征在于，所述托吡酯胶乳增强免疫比浊检测试剂，由L1试剂与L2试剂组成；
所述L1试剂由权利要求6-7任一项所述的抗托吡酯特异性抗体、pH=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、促凝剂以及防腐剂组成；
所述L2试剂由托吡酯-牛血清白蛋白复合体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒、pH=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸以及防腐剂组成；
所述的托吡酯-牛血清白蛋白复合体由权利要求1所述的托吡酯衍生物与牛血清白蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅳ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
式Ⅳ；
所述的聚苯乙烯胶乳颗粒直径范围为50-250nm；
所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或巴比妥缓冲液中的一种；
所述促凝剂为PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000或硫酸葡聚糖钠中的一种；
所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、苯酚或乙基汞硫代硫酸钠中的一种。
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