CN111875587B - 5-氟胞嘧啶衍生物、其制备方法及其在5-氟胞嘧啶免疫检测试剂中的应用 - Google Patents

5-氟胞嘧啶衍生物、其制备方法及其在5-氟胞嘧啶免疫检测试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明获得了一种全新的5‑氟胞嘧啶衍生物，并使用该5‑氟胞嘧啶衍生物制备得到高免疫原性的5‑氟胞嘧啶人工抗原，进而免疫实验动物得到高效价的抗5‑氟胞嘧啶特异性抗体；同时，使用该5‑氟胞嘧啶衍生物制备得到5‑氟胞嘧啶酶标偶联物。含有上述抗5‑氟胞嘧啶特异性抗体与5‑氟胞嘧啶酶标偶联物的5‑氟胞嘧啶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对5‑氟胞嘧啶含量的自动化测定，可以高通量、快速化、精确地测定生物样本中5‑氟胞嘧啶的含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低5‑氟胞嘧啶检测成本，有利于临床广泛推广使用。

Description

5-氟胞嘧啶衍生物、其制备方法及其在5-氟胞嘧啶免疫检测 试剂中的应用
技术领域
本发明属于生物医学检验领域，具体涉及5-氟胞嘧啶衍生物、其制备方法及其在5-氟胞嘧啶免疫检测试剂中的应用。
背景技术
5-氟胞嘧啶(5-FC)为抗真菌药物，低浓度时具有抑菌作用，高浓度时具杀菌作用。其作用机制在于药物通过真菌细胞的渗透酶***进入细胞内，在真菌细胞所具有的胞嘧啶脱氨酶的作用下转化为5-氟尿嘧啶，替代尿嘧啶进入真菌的核糖核酸链中，从而阻断核酸的正常合成，导致真菌细胞的凋亡。5-氟胞嘧啶主要用于治疗隐球菌属和念珠菌属等所致的真菌感染性疾病，如真菌败血症、心内膜炎、脑膜炎、肺部及泌尿生殖道感染等。此外，5-氟胞嘧啶对芽生菌属、分枝芽胞菌属、某些着色真菌属、曲菌属也有抗菌作用。此药口服吸收迅速、完全，吸收后主要分布于肝脏、肾脏、心脏、肺等器官，以及关节腔、腹腔等部位的体液中，并可进入脑脊液，脑脊液中药物浓度可达血液中药物浓度的5-10倍。5-氟胞嘧啶在体内仅有2%～4%与蛋白质结合，半衰期为2.5～6h，肾功能不全者半衰期可明显延长，约有90%的药物以原形由肾小球滤过通过尿液排出体外。5-氟胞嘧啶与两性霉素B合用具有协同作用，但可使本品自肾脏***量减少，血药浓度升高，促使肾脏、血液***发生毒性反应；同时使用骨髓抑制剂也可增加本品的血液***毒性。使用5-氟胞嘧啶所引起的不良反应较多，主要有：胃肠道症状（恶心、腹泻）、肝损害（转氨酶、碱性磷酸酶升高，也可出现肝肿大甚至肝坏死）、骨髓抑制、白细胞减少、贫血、血小板减少、肾损害、头痛、眩晕、视力减退、幻觉、听力下降、运动障碍、血清钾钙磷值下降，以及过敏反应（如皮疹）等，致命的粒性白细胞缺乏症和再障性贫血也有报道。因此，使用5-氟胞嘧啶进行治疗的患者需要定期监测其血药浓度，及时调整治疗剂量，才能获得最佳的治疗效果，并减少毒副作用。
目前检测检测5-氟胞嘧啶的实验室方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、毛细管电泳法等。这些方法都有其不可回避的缺点，如高效液相色谱法与液相色谱-串联质谱法常因操作繁琐，效率低，测定周期长及分析成本高的缺点限制了其在临床大规模药物浓度监测中的广泛应用，而毛细管电泳法较多应用于科研实验室，较难实现临床精确定量的要求。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的5-氟胞嘧啶检测试剂，尤其是质量好的高通量自动化检验试剂。因此，研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的5-氟胞嘧啶检测试剂已成为国内外治疗药物监测行业的热点。本发明可以实现在全自动生化分析仪上对5-氟胞嘧啶的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，能有效满足国内日益增长的临床检测需求。
发明内容
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一、提供一种5-氟胞嘧啶衍生物，其结构式如下述式（Ⅰ）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式（Ⅰ），
式中R1为连接基团，所述连接基团为
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，其中n为1至10之间的任意整数；优选地，所述连接基团为
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
二、提供一种技术方案一所述的5-氟胞嘧啶衍生物的制备方法，所述5-氟胞嘧啶衍生物的结构式如式（Ⅱ）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
式（Ⅱ），
所述制备方法步骤如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
；
（1）化合物3的合成：将化合物1与化合物2在含有K2CO3的乙腈中循环加热回流20小时，制成反应混合物。将此反应混合物用乙酸乙酯稀释，再用纯化水和浓盐水清洗，然后使用硫酸钠进行干燥，最后蒸发得到化合物3。
（2）5-氟胞嘧啶酸衍生物的合成：将化合物3加入甲醇中溶解制成反应溶液，室温下在此反应溶液中加入LiOH.H2O，然后在室温下搅拌反应过夜，将反应后的溶液通过减压蒸发干燥，得到的剩余物通过硅胶色谱柱层析法进行纯化，得到5-氟胞嘧啶酸衍生物。
（3）5-氟胞嘧啶马来酰亚胺衍生物的合成：将5-氟胞嘧啶酸衍生物加入二甲基甲酰胺中溶解，然后加入N,N-二异丙基乙胺、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯与化合物4，配制成反应混合物溶液。将此反应混合物溶液在室温下搅拌过夜，反应结束后在反应混合物溶液中加入纯化水，然后进行过滤。将过滤得到的滤饼通过快速柱层析法纯化得到5-氟胞嘧啶马来酰亚胺衍生物。
优选地，所述5-氟胞嘧啶衍生物的具体制备步骤如下：
（1）化合物3的合成：将2.6 g化合物1 (0.02 mmol)与3.6 g化合物2 (0.02 mmol)在含有2.8 g K2CO3 (0.02 mmol)的25 ml的乙腈(ACN)中循环加热回流20小时，制成反应混合物。将此反应混合物用乙酸乙酯稀释，再用纯化水和浓盐水清洗，然后使用硫酸钠进行干燥，最后蒸发得到化合物3。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
（2）5-氟胞嘧啶酸衍生物的合成：将2.3 g化合物3 (0.01 mmol) 加入20 ml的甲醇(MeOH)中溶解制成反应溶液，室温下在此反应溶液中加入0.8 g的LiOH.H2O(0.02mmol)，然后在室温下搅拌反应过夜，将反应后的溶液通过减压蒸发干燥，得到的剩余物通过硅胶色谱柱层析法进行纯化，得到5-氟胞嘧啶酸衍生物。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
（3）5-氟胞嘧啶马来酰亚胺衍生物的合成：将0.65 g 5-氟胞嘧啶酸衍生物(3mmol)加入5 ml二甲基甲酰胺(DMF)中溶解，然后加入1.5 ml N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(9mmol)、1.4 g 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(3 mmol)与0.45 g化合物4(3 mmol)，配制成反应混合物溶液。将此反应混合物溶液在室温下搅拌过夜，反应结束后在反应混合物溶液中加入纯化水(50 mL)，然后进行过滤。将过滤得到的滤饼通过快速柱层析法(FCC)纯化得到5-氟胞嘧啶马来酰亚胺衍生物。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
三、提供一种5-氟胞嘧啶人工抗原，由技术方案一所述的5-氟胞嘧啶衍生物与载体连接而成，其结构式如式（Ⅲ）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
式（Ⅲ），
式中R2为连接基团，所述连接基团为
Figure DEST_PATH_IMAGE011
，其中n为1至10之间的任意整数；优选地，所述连接基团为
Figure DEST_PATH_IMAGE012
；所述载体为血清白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、卵清蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白、多聚赖氨酸中的一种，优选为血清蛋白，更优选为牛血清白蛋白。
四、提供一种抗5-氟胞嘧啶特异性抗体，由技术方案三所述的5-氟胞嘧啶人工抗原免疫实验动物后分离纯化得到。
所述的抗5-氟胞嘧啶特异性抗体为技术方案三所述的5-氟胞嘧啶人工抗原对实验动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为采用技术方案三所述的5-氟胞嘧啶人工抗原免疫实验动物后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的宿主动物为兔子、山羊、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或马中的一种。
五、提供一种5-氟胞嘧啶免疫检测试剂，由以下组分组成：
试剂R1：包含技术方案四所述的抗5-氟胞嘧啶特异性抗体与R1缓冲液，所述R1缓冲液由牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与Tris缓冲液组成；
试剂R2：包含5-氟胞嘧啶酶标偶联物与R2缓冲液，所述5-氟胞嘧啶酶标偶联物由技术方案一所述的5-氟胞嘧啶衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，所述R2缓冲液由牛血清白蛋白与Tris缓冲液组成。
定标液：由5-氟胞嘧啶纯品粉末、Tris-HCl缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、叠氮钠组成。
六、提供一种技术方案五所述的5-氟胞嘧啶免疫检测试剂的制备方法，具体步骤如下：
（1）将牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液，再将技术方案四所述的抗5-氟胞嘧啶特异性抗体以1∶100-1∶10000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀，再用盐酸调节pH至6.0-9.0，制成R1试剂；
（2）将牛血清白蛋白加入Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液，再将技术方案五中所述的5-氟胞嘧啶酶标偶联物以1∶100-1∶10000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀，再用盐酸调节pH至6.0-9.0，制成R2试剂；
（3）将5-氟胞嘧啶纯品粉末分别加入6份Tris-HCl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.0μg/mL、4.0~6.0μg/mL、8.0~12.0μg/mL、16.0~24.0μg/mL、32.0~48.0μg/mL、64.0~96.0μg/mL，然后在每份溶液中分别加入氯化钠、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、叠氮钠，搅拌均匀，制得5-氟胞嘧啶定标液。
优选地，所述5-氟胞嘧啶免疫检测试剂的具体制备步骤如下：
（1）将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/L葡萄糖-6-磷酸及50mmol/L氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入50mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液，再将技术方案四所述的抗5-氟胞嘧啶特异性抗体以1∶500-1∶5000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀，再用6 mol/L的盐酸调节pH至8.0，制成R1试剂；
（2）将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液，再将技术方案五中所述的5-氟胞嘧啶酶标偶联物以1∶1000-1∶8000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀，再用6 mol/L的盐酸调节pH至7.6，制成R2试剂；
（3）将5-氟胞嘧啶纯品粉末分别加入6份浓度为50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL，然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠，搅拌均匀，制得5-氟胞嘧啶定标液。
其中，所述抗5-氟胞嘧啶特异性抗体的制备包括以下步骤：
a.将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化镁，共同溶解于去离子水中，制成缓冲溶液A；
b.将牛血清白蛋白溶解于上述缓冲溶液A中，制成载体蛋白溶液；
c.将上述结构式（Ⅰ）所示的5-氟胞嘧啶衍生物溶解于上述缓冲溶液A中，制成5-氟胞嘧啶衍生物溶液；
d.当上述5-氟胞嘧啶衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述载体蛋白溶液中，然后将此混合溶液搅拌12小时；
e.将反应后的上述混合溶液以上述缓冲溶液A作为透析液进行透析，透析后所得溶液即为5-氟胞嘧啶免疫原溶液，在5-氟胞嘧啶免疫原溶液中加入NaN3，于-20℃下储存；
f.将上述5-氟胞嘧啶免疫原溶液用磷酸钾缓冲液稀释成5-氟胞嘧啶人工抗原溶液，然后将5-氟胞嘧啶人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；21天后，再将相同的5-氟胞嘧啶人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对实验动物注射一次；之后每隔21天用同样方法注射一次，从实验动物进行初次注射开始，经过4个月后对实验动物进行采血，分离纯化获得多克隆抗体。
优选地，所述抗5-氟胞嘧啶特异性抗体的制备包括以下具体步骤：
a.称取8 g磷酸二氢钾、12 g磷酸氢二钠、2.5 g氯化钠、3.5 g氯化镁，共同溶解于500 mL去离子水中，调节pH至8.2，制成缓冲溶液A；
b.称取100 mg牛血清白蛋白，4℃下溶解于100 mL上述缓冲溶液A中，制成载体蛋白溶液；
c.称取10 mg上述结构式（Ⅱ）所示的5-氟胞嘧啶衍生物，4℃下溶解于10 mL上述缓冲溶液A中，制成5-氟胞嘧啶衍生物溶液；
d.当上述5-氟胞嘧啶衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述载体蛋白溶液中，然后将此混合溶液在-8℃下搅拌12小时；
e.将反应后的上述混合溶液以300mL上述缓冲溶液A作为透析液进行透析，透析后所得溶液即为5-氟胞嘧啶免疫原溶液，在5-氟胞嘧啶免疫原溶液中加入质量分数0.1%的NaN3，于-20℃下储存；
f.将上述5-氟胞嘧啶免疫原用磷酸钾缓冲液（10mmol/L，pH7.4）稀释成浓度为1.0mg/mL的5-氟胞嘧啶人工抗原溶液，然后将5-氟胞嘧啶人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对兔子进行注射，注射量为10mL/只；21天后，再将相同的5-氟胞嘧啶人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对兔子注射一次，注射量为8 mL/只；之后每隔21天用同样方法注射一次，从兔子进行初次注射开始，经过4个月后对兔子进行采血，分离纯化获得多克隆抗体。
其中，所述5-氟胞嘧啶酶标偶联物的制备包括以下步骤：
a.将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化镁，共同溶解于去离子水中，制成缓冲溶液B；
b.将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解于上述缓冲溶液B中，制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
c.将上述结构式（Ⅰ）所示的5-氟胞嘧啶衍生物溶解于上述缓冲溶液B中，制成5-氟胞嘧啶衍生物溶液；
d.当上述5-氟胞嘧啶衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，然后将此混合溶液搅拌12小时；
e.将反应后的上述混合溶液以上述缓冲溶液B作为透析液进行透析，透析后所得溶液即为5-氟胞嘧啶酶标偶联物溶液，在5-氟胞嘧啶酶标偶联物溶液中加入BSA和NaN3，于4℃下储存。
优选地，所述5-氟胞嘧啶酶标偶联物的制备包括以下具体步骤：
a.称取1.8 g磷酸二氢钾、2.5 g磷酸氢二钠、1.5 g氯化钠、1.5 g氯化镁，共同溶解于500 mL去离子水中，调节pH至8.2，制成缓冲溶液B；
b.称取100 mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，4℃下溶解于100 mL上述缓冲溶液B中，制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
c.称取10 mg上述结构式（Ⅱ）所示的5-氟胞嘧啶衍生物，4℃下溶解于10 mL上述缓冲溶液B中，制成5-氟胞嘧啶衍生物溶液；
d.当上述5-氟胞嘧啶衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，然后将此混合溶液在-8℃下搅拌12小时；
e.将反应后的上述混合溶液以300mL上述缓冲溶液B作为透析液进行透析，透析后所得溶液即为5-氟胞嘧啶酶标偶联物溶液，在5-氟胞嘧啶酶标偶联物溶液中加入质量分数0.5%的BSA和质量分数0.1%的NaN3，于4℃下储存。
七、提供一种技术方案五所述的5-氟胞嘧啶免疫检测试剂的用途，将该免疫检测试剂用于生物样本中5-氟胞嘧啶或5-氟胞嘧啶含量的测定，所述生物样本为人体或动物的液体生理样本，所述液体生理样本为血清、血浆、全血、尿液、唾液、淋巴液、组织液、脑脊液、羊水或泪液。
本发明提供了一种新型5-氟胞嘧啶衍生物及其制备方法，利用该新型5-氟胞嘧啶衍生物研制的抗5-氟胞嘧啶特异性抗体可以用于制备灵敏度高、特异性强、检测效果好的5-氟胞嘧啶免疫检验试剂。本发明还提供了5-氟胞嘧啶免疫检验试剂的制备方法及相应的使用方法。本发明提供的5-氟胞嘧啶免疫检测试剂使用方便、检测快速、结果准确、灵敏度高、特异性强，能够对人体血清、血浆等样本中的5-氟胞嘧啶含量进行定量检测。克服了现有技术中5-氟胞嘧啶检测方法存在的操作复杂、自动化程度低等缺陷，能有效指导临床个体化合理用药。
附图说明
图1是利用5-氟胞嘧啶免疫检验试剂进行5-氟胞嘧啶样本检测的反应标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂、仪器、设备、耗材均可从正规渠道商购买获得。
实施例1：5-氟胞嘧啶衍生物的制备
5-氟胞嘧啶衍生物的结构式如式（Ⅱ）所示：
Figure 23617DEST_PATH_IMAGE004
式（Ⅱ），
上述5-氟胞嘧啶衍生物的具体制备步骤如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
；
（1）化合物3的合成：将2.6 g化合物1 (0.02 mmol)与3.6 g化合物2 (0.02 mmol)在含有2.8 g K2CO3 (0.02 mmol)的25 ml的乙腈(ACN)中循环加热回流20小时，制成反应混合物。将此反应混合物用乙酸乙酯稀释，再用纯化水和浓盐水清洗，然后使用硫酸钠进行干燥，最后蒸发得到2.5 g白色泡沫状的化合物3。
Figure 691490DEST_PATH_IMAGE007
（2）5-氟胞嘧啶酸衍生物的合成：将2.3 g化合物3 (0.01 mmol) 加入20 ml的甲醇(MeOH)中溶解制成反应溶液，室温下在此反应溶液中加入0.8 g的LiOH.H2O(0.02mmol)，然后在室温下搅拌反应过夜，将反应后的溶液通过减压蒸发干燥，得到的剩余物通过硅胶色谱柱层析法进行纯化，得到2.1 g 5-氟胞嘧啶酸衍生物。
Figure 736806DEST_PATH_IMAGE008
（3）5-氟胞嘧啶马来酰亚胺衍生物的合成：将0.65 g 5-氟胞嘧啶酸衍生物(3mmol)加入5 ml二甲基甲酰胺(DMF)中溶解，然后加入1.5 ml N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(9mmol)、1.4 g 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(3 mmol)与0.45 g化合物4(3 mmol)，配制成反应混合物溶液。将此反应混合物溶液在室温下搅拌过夜，反应结束后在反应混合物溶液中加入纯化水(50 mL)，然后进行过滤。将过滤得到的滤饼通过快速柱层析法(FCC)纯化得到0.6 g白色固体状的5-氟胞嘧啶马来酰亚胺衍生物。
Figure 670696DEST_PATH_IMAGE009
通过的1H NMR（Varian mercury plus 400 MHz）光谱扫描分析（TMS作为内标）与LC-MS（Agilent 1200A）对上述制备步骤得到的白色固体状的5-氟胞嘧啶马来酰亚胺衍生物进行结构鉴定，结果表明：该5-氟胞嘧啶马来酰亚胺衍生物即为结构式如式（Ⅱ）所示的5-氟胞嘧啶衍生物。
Figure 422752DEST_PATH_IMAGE004
式（Ⅱ）。
实施例2：5-氟胞嘧啶免疫检验试剂的制备
5-氟胞嘧啶免疫检测试剂的具体制备步骤如下：
（1）将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/L葡萄糖-6-磷酸及50mmol/L氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入50mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液，再将抗5-氟胞嘧啶特异性抗体以1∶1500的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀，再用6 mol/L的盐酸调节pH至8.0，制成R1试剂；
（2）将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液，再将5-氟胞嘧啶酶标偶联物以1∶3000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀，再用6 mol/L的盐酸调节pH至7.6，制成R2试剂；
（3）将5-氟胞嘧啶纯品粉末分别加入6份浓度为50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL，然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠，搅拌均匀，制得5-氟胞嘧啶定标液。
其中，步骤（1）中所述抗5-氟胞嘧啶特异性抗体的制备包括以下具体步骤：
a.称取8 g磷酸二氢钾、12 g磷酸氢二钠、2.5 g氯化钠、3.5 g氯化镁，共同溶解于500 mL去离子水中，调节pH至8.2，制成缓冲溶液A；
b.称取100 mg牛血清白蛋白，4℃下溶解于100 mL上述缓冲溶液A中，制成载体蛋白溶液；
c.称取10 mg上述结构式（Ⅱ）所示的5-氟胞嘧啶衍生物，4℃下溶解于10 mL上述缓冲溶液A中，制成5-氟胞嘧啶衍生物溶液；
d.当上述5-氟胞嘧啶衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述载体蛋白溶液中，然后将此混合溶液在-8℃下搅拌12小时；
e.将反应后的上述混合溶液以300mL上述缓冲溶液A作为透析液进行透析，透析后所得溶液即为5-氟胞嘧啶免疫原溶液，在5-氟胞嘧啶免疫原溶液中加入质量分数0.1%的NaN3，于-20℃下储存；
f.将上述5-氟胞嘧啶免疫原用磷酸钾缓冲液（10mmol/L，pH7.4）稀释成浓度为1.0mg/mL的5-氟胞嘧啶人工抗原溶液，然后将5-氟胞嘧啶人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对兔子进行注射，注射量为10mL/只；21天后，再将相同的5-氟胞嘧啶人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对兔子注射一次，注射量为8 mL/只；之后每隔21天用同样方法注射一次，从兔子进行初次注射开始，经过4个月后对兔子进行采血，分离纯化获得多克隆抗体。
其中，步骤（2）中所述5-氟胞嘧啶酶标偶联物的制备包括以下具体步骤：
a.称取1.8 g磷酸二氢钾、2.5 g磷酸氢二钠、1.5 g氯化钠、1.5 g氯化镁，共同溶解于500 mL去离子水中，调节pH至8.2，制成缓冲溶液B；
b.称取100 mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，4℃下溶解于100 mL上述缓冲溶液B中，制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
c.称取10 mg上述结构式（Ⅱ）所示的5-氟胞嘧啶衍生物，4℃下溶解于10 mL上述缓冲溶液B中，制成5-氟胞嘧啶衍生物溶液；
d.当上述5-氟胞嘧啶衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，然后将此混合溶液在-8℃下搅拌12小时；
e.将反应后的上述混合溶液以300mL上述缓冲溶液B作为透析液进行透析，透析后所得溶液即为5-氟胞嘧啶酶标偶联物溶液，在5-氟胞嘧啶酶标偶联物溶液中加入质量分数0.5%的BSA和质量分数0.1%的NaN3，于4℃下储存。
实施例3：利用5-氟胞嘧啶免疫检验试剂进行5-氟胞嘧啶样本检测
1. 制作标准曲线：
（1）设置迈瑞 BS480全自动生化分析仪反应参数（表1）。
（2）操作步骤为：先加R1试剂，再加入定标液，最后加入R2试剂。加入试剂R2后，测定不同时间点的OD340nm吸光值，算出不同定标液浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调整R1试剂和R2试剂的体积比例，同时调整测光点，最后得出最佳的反应标准曲线图，如图1所示。
表1 迈瑞BS480全自动生化分析仪检测5-氟胞嘧啶的反应参数
Figure DEST_PATH_IMAGE015
2. 样本检测：利用本发明的5-氟胞嘧啶免疫检验试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高浓度质控样本10次，上述质控样本为：将5-氟胞嘧啶标准品溶解于空白人造血浆中，至浓度分别为15.00、30.00、60.00 ng/mL。检测结果及数据分析见表2。
表2 5-氟胞嘧啶样本测定值及精密度和回收率评估
血液样本 低 中 高
样本浓度(ng/mL) 15.00 30.00 60.00
1 14.62 31.46 58.96
2 15.62 28.92 59.62
3 16.34 29.57 59.32
4 14.88 29.64 57.96
5 15.32 29.84 59.82
6 16.22 27.59 62.31
7 14.92 31.15 61.47
8 14.77 30.55 61.33
9 15.16 30.95 60.57
10 15.82 30.67 58.74
平均值(ng/mL) 15.37 30.03 60.01
标准差（SD） 0.609 1.174 1.377
精密度（CV%） 3.96 3.91 2.29
回收率（%） 102.46 100.10 100.02
检测结果：本发明的5-氟胞嘧啶免疫检验试剂能精确测定5-氟胞嘧啶的含量，回收率均在95%-105%之间；变异系数CV均低于5%。
实施例4：常见药物干扰试验
选取62种常见药物作为干扰物进行干扰试验，将62种常见药物纯品粉末配制成浓度为100.0ng/mL的溶液作为待测干扰物样本，采用实施例2制备的5-氟胞嘧啶免疫检验试剂进行检测：将待测干扰物样本与实施例2制备的R1试剂接触反应，再加入R2试剂；检测上述混合溶液的OD340吸光值，根据图1的标准曲线得出相应物质的浓度。62种常见药物名称以及检测结果见表3。
表3 常见药物干扰试验检测结果
ID# 化合物名称 实际检测值 (ng/mL) ID# 化合物名称 实际检测值 (ng/mL)
1 阿司匹林 0.00 2 苯丙醇胺 0.00
3 β-苯基乙胺 0.00 4 普鲁卡因酰胺 0.00
5 *** 0.00 6 普鲁卡因 0.00
7 氨苄青霉素 0.00 8 奎尼丁 0.00
9 甲氨二氮卓 0.00 10 佐美酸 0.00
11 氯丙嗪 0.00 12 苯肾上腺素 0.00
13 氯拉卓酸 0.00 14 桂皮酰艾克宁 0.00
15 二甲苯氧庚酸 0.00 16 芽子碱 0.00
17 非诺洛芬 0.00 18 地西洋 0.00
19 甲基*** 0.00 20 可替宁 0.00
21 龙胆酸 0.00 22 阿替洛尔 0.00
23 吉非贝齐 0.00 24 心得安 0.00
25 氢可酮 0.00 26 苯乙哌啶酮 0.00
27 布洛芬 0.00 28 苯基丁氮酮 0.00
29 丙咪嗪 0.00 30 麦角酸二乙基酰胺 0.00
31 二氨基二苯砜 0.00 32 ***酚 0.00
33 萘普生 0.00 34 洛哌丁胺 0.00
35 氢*** 0.00 36 异克舒令 0.00
37 哌替啶 0.00 38 苯基丙氨酸 0.00
39 烯丙羟***酮 0.00 40 盐酸氟西汀 0.00
41 麻黄素 0.00 42 柳丁氨醇 0.00
43 烟酰胺 0.00 44 青霉素 0.00
45 甲胺呋硫 0.00 46 甲基二乙醇胺 0.00
47 异戊巴比妥 0.00 48 二亚甲基双氧*** 0.00
49 甲撑二氧*** 0.00 50 琥珀酸多西拉敏 0.00
51 四氢***酚 0.00 52 纳布啡 0.00
53 制霉菌素 0.00 54 去甲*** 0.00
55 乙酰*** 0.00 56 羟考酮 0.00
57 苄非他明 0.00 58 克他命 0.00
59 异丙嗪 0.00 60 苯海拉明 0.00
61 阿司帕坦 0.00 62 苯丁胺 0.00
测定结果显示：上述62种常见药物采用实施例2制备的5-氟胞嘧啶免疫检验试剂进行检测，实际检测值均为0.00ng/mL。由此可见，本发明的抗5-氟胞嘧啶特异性抗体具有较强的抗原识别特异性，与62种常见药物无任何交叉反应。
实施例5：使用不同连接基团的5-氟胞嘧啶衍生物制备的试剂性能验证
为了说明本发明使用其它不同连接基团的5-氟胞嘧啶衍生物都能用于制备5-氟胞嘧啶免疫检验试剂，并且都具有性能优越性，采用各种不同连接基团的5-氟胞嘧啶衍生物，按照实施例2所述的方法制备相应的5-氟胞嘧啶免疫检验试剂，并对所制备的5-氟胞嘧啶免疫检验试剂按照实施例3-5所述方法进行实验，各实验方案所采用的5-氟胞嘧啶衍生物的连接基团结构及试剂性能验证结果见表4：
表4使用不同连接基团的5-氟胞嘧啶衍生物制备的试剂性能验证结果
Figure DEST_PATH_IMAGE017
实验结果表明：本发明使用其它不同连接基团的5-氟胞嘧啶衍生物都能用于制备5-氟胞嘧啶免疫检验试剂，并且都具有性能优越性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (13)

1.5-氟胞嘧啶衍生物，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003062121520000011
式中R1为连接基团，所述连接基团为
Figure FDA0003062121520000012
其中n为1至10之间的任意整数。
2.根据权利要求1所述的5-氟胞嘧啶衍生物，其特征在于，所述连接基团为
Figure FDA0003062121520000013
3.一种如权利要求1所述的5-氟胞嘧啶衍生物的制备方法，其特征在于，所述5-氟胞嘧啶衍生物的结构式如式(Ⅱ)所示：
Figure FDA0003062121520000014
所述制备方法步骤如下：
Figure FDA0003062121520000015
Figure FDA0003062121520000023
(1)化合物3的合成：将化合物1与化合物2在含有K2CO3的乙腈中循环加热回流20小时，制成反应混合物，将此反应混合物用乙酸乙酯稀释，再用纯化水和浓盐水清洗，然后使用硫酸钠进行干燥，最后蒸发得到化合物3；
(2)5-氟胞嘧啶酸衍生物的合成：将化合物3加入甲醇中溶解制成反应溶液，室温下在此反应溶液中加入LiOH.H2O，然后在室温下搅拌反应过夜，将反应后的溶液通过减压蒸发干燥，得到的剩余物通过硅胶色谱柱层析法进行纯化，得到5-氟胞嘧啶酸衍生物；
(3)5-氟胞嘧啶马来酰亚胺衍生物的合成：将5-氟胞嘧啶酸衍生物加入二甲基甲酰胺中溶解，然后加入N,N-二异丙基乙胺、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯与化合物4，配制成反应混合物溶液，将此反应混合物溶液在室温下搅拌过夜，反应结束后在反应混合物溶液中加入纯化水，然后进行过滤，将过滤得到的滤饼通过快速柱层析法纯化得到5-氟胞嘧啶马来酰亚胺衍生物。
4.5-氟胞嘧啶人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述的5-氟胞嘧啶衍生物与载体连接而成，其结构式如式(Ⅲ)所示：
Figure FDA0003062121520000021
式中R2为连接基团，所述连接基团为
Figure FDA0003062121520000022
其中n为1至10之间的任意整数；所述载体为血清白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、卵清蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白、多聚赖氨酸中的一种。
5.根据权利要求4所述的5-氟胞嘧啶人工抗原，其特征在于，所述连接基团为
Figure FDA0003062121520000031
6.根据权利要求4所述的5-氟胞嘧啶人工抗原，其特征在于，所述载体为血清白蛋白。
7.根据权利要求6所述的5-氟胞嘧啶人工抗原，其特征在于，所述载体为牛血清白蛋白。
8.抗5-氟胞嘧啶特异性抗体，其特征在于，由权利要求4-7任一项所述的5-氟胞嘧啶人工抗原免疫实验动物后分离纯化得到。
9.根据权利要求8所述的抗5-氟胞嘧啶特异性抗体，其特征在于：所述的抗体为采用权利要求4-7任一项所述的5-氟胞嘧啶人工抗原对实验动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为采用权利要求4-7任一项所述的5-氟胞嘧啶人工抗原免疫实验动物后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔子、山羊、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或马中的一种。
10.一种5-氟胞嘧啶免疫检测试剂，其特征在于，由以下组分组成：
试剂R1：包含权利要求8-9任一项所述的抗5-氟胞嘧啶特异性抗体与R1缓冲液，所述R1缓冲液由牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与Tris缓冲液组成；
试剂R2：包含5-氟胞嘧啶酶标偶联物与R2缓冲液，所述5-氟胞嘧啶酶标偶联物由权利要求1-2任一项所述的5-氟胞嘧啶衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，所述R2缓冲液由牛血清白蛋白与Tris缓冲液组成；
定标液：由5-氟胞嘧啶纯品粉末、Tris-HCl缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、叠氮钠组成。
11.一种权利要求10所述的5-氟胞嘧啶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液，再将权利要求8-9任一项所述的抗5-氟胞嘧啶特异性抗体以1∶100-1∶10000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀，再用盐酸调节pH至6.0-9.0，制成R1试剂；
(2)将牛血清白蛋白加入Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液，再将权利要求10中所述的5-氟胞嘧啶酶标偶联物以1∶100-1∶10000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀，再用盐酸调节pH至6.0-9.0，制成R2试剂；
(3)将5-氟胞嘧啶纯品粉末分别加入6份Tris-HCl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.0μg/mL、4.0～6.0μg/mL、8.0～12.0μg/mL、16.0～24.0μg/mL、32.0～48.0μg/mL、64.0～96.0μg/mL，然后在每份溶液中分别加入氯化钠、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、叠氮钠，搅拌均匀，制得5-氟胞嘧啶定标液。
12.根据权利要求11所述的5-氟胞嘧啶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述抗5-氟胞嘧啶特异性抗体的制备包括以下步骤：
a.将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化镁，共同溶解于去离子水中，制成缓冲溶液A；
b.将牛血清白蛋白溶解于上述缓冲溶液A中，制成载体蛋白溶液；
c.将权利要求1中结构式(Ⅰ)所示的5-氟胞嘧啶衍生物溶解于上述缓冲溶液A中，制成5-氟胞嘧啶衍生物溶液；
d.当上述5-氟胞嘧啶衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述载体蛋白溶液中，然后将此混合溶液搅拌12小时；
e.将反应后的上述混合溶液以上述缓冲溶液A作为透析液进行透析，透析后所得溶液即为5-氟胞嘧啶免疫原溶液，在5-氟胞嘧啶免疫原溶液中加入NaN3，于-20℃下储存；
f.将上述5-氟胞嘧啶免疫原溶液用磷酸钾缓冲液稀释成5-氟胞嘧啶人工抗原溶液，然后将5-氟胞嘧啶人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；21天后，再将相同的5-氟胞嘧啶人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对实验动物注射一次；之后每隔21天用同样方法注射一次，从实验动物进行初次注射开始，经过4个月后对实验动物进行采血，分离纯化获得多克隆抗体。
13.根据权利要求11所述的5-氟胞嘧啶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述5-氟胞嘧啶酶标偶联物的制备包括以下步骤：
a.将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化镁，共同溶解于去离子水中，制成缓冲溶液B；
b.将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解于上述缓冲溶液B中，制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
c.将权利要求1中结构式(Ⅰ)所示的5-氟胞嘧啶衍生物溶解于上述缓冲溶液B中，制成5-氟胞嘧啶衍生物溶液；
d.当上述5-氟胞嘧啶衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，然后将此混合溶液搅拌12小时；
e.将反应后的上述混合溶液以上述缓冲溶液B作为透析液进行透析，透析后所得溶液即为5-氟胞嘧啶酶标偶联物溶液，在5-氟胞嘧啶酶标偶联物溶液中加入BSA和NaN3，于4℃下储存。
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