CN114671943B - 一种鱼类摄食调控蛋白的制备和应用 - Google Patents

一种鱼类摄食调控蛋白的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鱼类摄食调控蛋白的制备，涉及基因工程技术领域，包括如下步骤：S1、罗非鱼肝脏总RNA的提取；S2、罗非鱼angptl8基因cDNA全序列的克隆；S3、罗非鱼angptl8的组织表达分布；S4、罗非鱼angptl8在进食过程的表达变化；S5、angptl8重组蛋白制备；S6、采用腹腔注射研究angptl8重组蛋白对罗非鱼摄食的影响。本发明鱼类angptl8基因在鱼类肝脏中大量表达，该基因产生的成熟蛋白具有调节鱼类摄食的功能，可以通过生物合成的方法进行开发利用，使用方便，效果显著，具有广泛的应用价值。本方案中采用原核表达制备重组蛋白，具有产量高，成本低，操作方便，易重复等优点。

Description

一种鱼类摄食调控蛋白的制备和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鱼类摄食调控蛋白的制备和应用。
背景技术
现有诱食剂活性低，用量大，生产成本较高并且有一定的毒副作用。本发明的目的在于提供一种血管生成素样8基因编码成熟蛋白。本发明另一目的在于提供上述鱼类angptl8神经蛋白基因的应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种鱼类摄食调控蛋白的制备和应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种鱼类摄食调控蛋白的制备，包括如下步骤：
S1、罗非鱼肝脏总RNA的提取：
取一条健康罗非鱼，解剖后分离肝脏组织，采用Trizol试剂法获得罗非鱼肝脏总RNA；
S2、罗非鱼angptl8基因cDNA全序列的克隆：
S201、以合成的第一链cDNA作为模板，设计特异性引物AN-F1、AN-R1，进行PCR扩增；
S202、将所得PCR产物上样至1.5％琼脂糖凝胶，以低电压电泳分离DNA片段，从凝胶中纯化回收目的产物；
S203、将纯化后的目的产物连接至
Figure GDA0004157174410000011
Easy载体，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆测序；
S204、根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术对目的基因的3'末端和5'末端进行PCR扩增；
S205、按照RACE试剂盒GeneRacerTM Kit说明书对罗非鱼肝脏总RNA进行去磷酸，去mRNA5'帽子结构，与RNAOligo连接，最终通过反转录合成cDNA第一链；
S206、以罗非鱼angptl8cDNA的3'-RACE、5'-RACE特异引物AN-F2、AN-F3和AN-R2、AN-R3，和GeneRacerTM Kit的通用引物扩增罗非鱼angptl8cDNA 5'端片段和3'端片段；
S207、对所得到的PCR产物的回收纯化后，连接T载体、转化DH5α感受态，利用蓝白斑筛选阳性菌落，菌落PCR验证后进行DNA测序；
S3、罗非鱼angptl8的组织表达分布：
利用实时荧光定量PCR技术检测罗非鱼angptl8在各种组织中的表达；
S301、提取罗非鱼下丘脑、端脑、视顶盖、小脑、嗅球、延髓、脊髓、垂体、肝脏、脂肪、肠、肌肉等12个组织总RNA；
S302、经DNaseI处理后，按照iScriptTM说明书取1μg RNA进行反转录；
S303、将反转录产物稀释10倍作为cDNA模板，参照iQTM
Figure GDA0004157174410000021
GreenSupermix说明书准备qPCR反应体系；
S304、通过分析qPCR溶解曲线，确定扩增产物特异性；
S4、罗非鱼angptl8在进食过程的表达变化：
S401、将体重2±0.5g的罗非鱼随机分配到四个玻璃缸中，分别为对照组和3个投喂组，平均每个缸6条罗非鱼；
S402、每天下午4点投喂1次，食物投喂量为体重的3％，驯养两周后，实验正式开始；
S403、按照下列时间点对正常喂养下罗非鱼的下丘脑取样：摄食前1h、摄食中(0hr)、摄食后1hr和摄食后3hr；
S404、罗非鱼用0.05％MS-222麻醉后处死收集下丘脑样品，液氮速冻处理，存放于-80℃超低温冰箱备用；
S405、通过qPCR技术检测罗非鱼下丘脑中angptl8基因表达量变化；
S5、angptl8重组蛋白制备：
S501、以罗非鱼肝脏组织cDNA为模板，通过Taq酶试剂盒扩增angptll8cDNA序列全长；
S502、使用1.5％琼脂糖凝胶对扩增后的产物进行电泳，并用胶回收试剂盒进行目的片段回收；
S503、将纯化片段双酶切后连接pET30a(+)表达载体，并转化BL21(DE3)感受态细胞；
S504、利用LB培养基(Kana抗生素：50mg/ml)筛选阳性表达菌落，菌液PCR验证后保种；
S505、按照1％LB培养基(Kana抗生素：50mg/ml)体积加入angptl8-pET30a(+)-BL21(DE3)菌液，37℃，200rpm摇床过夜后，将菌液倒入100倍体积的LB培养基(Kana抗生素：50mg/ml)中，37℃，200rpm培养至菌液浓度OD600≈0.5(约3hr)，加入IPTG至终浓度为0.1mM，37℃，200rpm诱导表达6hr；
S506、菌液5000×g离心2min后弃上清，并用裂解液润洗2次；
S507、按照菌液体积10％加入裂解液，冰浴超声破碎；
S508、破碎液通过10,000×g4℃离心30min，使用0.45μm过滤器过滤上清液；
S509、利用His标签蛋白纯化试剂盒(碧云天生物技术公司)纯化蛋白，洗脱条件为：50mM咪唑和100mM咪唑裂解液清洗杂蛋白，500mM咪唑裂解液洗脱目的蛋白；
S5011、利用3K超滤管(Milipore)浓缩洗脱液，BCA法测目的蛋白终浓度；
S6、采用腹腔注射研究angptl8重组蛋白对罗非鱼摄食的影响：
S601、将体重2±0.5g的罗非鱼随机分配到2个玻璃缸中，平均每个缸6条罗非鱼；
S602、罗非鱼每天下午4点投喂一次，食物投喂量为体重的3％，驯养两周后开始正式实验；
S603、罗非鱼用MS-222麻醉后，称量每组中个体体重(body weight，BW)，根据体重分别由腹腔注射0.7％鱼类生理盐水(对照组)、1μg/g BW angptl8；
S604、注射10分钟后，分别向每组罗非鱼投喂固定重量的食物，让每组罗非鱼自由摄食2小时；
S605、将各组剩余的食物分别收集并烘干，根据剩余的食物的重量计算各组中单位体重罗非鱼的摄食量。
进一步地，步骤S303中所述的qPCR所涉及的具体反应程序如下：95℃预变性2min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40个循环。
进一步地，步骤S303中qPCR反应时每个样品设置三个平行。
进一步地，步骤S507中所述的超声条件：6mm探头，40％功率，工作4s，休息9s，工作时间10min。
进一步地，所述的各特异引物AN-F1、AN-F2、AN-F3、AN-R1、AN-R2、AN-R3分别命名为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，其序列分别为：
SEQ ID NO:1 5’to3’atgatctggagcctgtgcttgc；
SEQ ID NO:2 5’to3’gcaagcacaggctccagatcat；
SEQ ID NO:3 5’to3’tgccaccttgtattccgtcttgctgg；
SEQ ID NO:4 5’to3’ttacatatttccatgtcttctta；
SEQ ID NO:5 5’to3’caggtaagaagacatggaaata；
SEQ ID NO:6 5’to3’cactgagagaactctccaaaagctga。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本发明鱼类angptl8基因在鱼类肝脏中大量表达，该基因产生的成熟蛋白具有调节鱼类摄食的功能，可以通过生物合成的方法进行开发利用，使用方便，效果显著，具有广泛的应用价值。本方案中采用原核表达制备重组蛋白，具有产量高，成本低，操作方便，易重复等优点。
2、本发明基于罗非鱼的理论研究，鉴定了鱼类血管生成素样8基因编码的成熟蛋白angptl8具有调节鱼类摄食的功能。这为开发出高活性、无毒和成本低廉的诱食剂，作为饲料添加剂，促进养殖鱼类等的发展具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为本发明鱼类angptl8基因在各个组织的表达分析；
图2为本发明鱼类angptl8基因在进食过程的表达变化；
图3为本发明鱼类angptl8重组蛋白纯化图；
图4为本发明鱼类angptl8腹腔注射对罗非鱼摄食的影响；
具体实施方式
为了对本发明做更进一步的解释，下面结合附图和具体实施例进行阐述。
一种鱼类摄食调控蛋白的制备，包括如下步骤：
S1、罗非鱼肝脏总RNA的提取：
取一条健康罗非鱼，解剖后分离肝脏组织，采用Trizol试剂法获得罗非鱼肝脏总RNA，其OD260/280＝1.95，OD260/230＝2.0。电泳结果显示，28S rRNA，18S rRNA条带清晰，28S条带亮度为18S的两倍，表明所得总RNA未被蛋白质、酚和基因组DNA污染，纯度高；
S2、罗非鱼angptl8基因cDNA全序列的克隆：
S201、以合成的第一链cDNA作为模板，设计特异性引物AN-F1(5'atgatctggagcctgtgcttgc 3')、AN-R1(ttacatatttccatgtcttctta 3')，进行PCR扩增；
S202、将所得PCR产物上样至1.5％琼脂糖凝胶，以低电压电泳分离DNA片段，从凝胶中纯化回收目的产物；
S203、将纯化后的目的产物连接至
Figure GDA0004157174410000051
载体，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆测序；
S204、根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术对目的基因的3'末端和5'末端进行PCR扩增；
S205、按照RACE试剂盒GeneRacerTM Kit说明书对罗非鱼肝脏总RNA进行去磷酸，去mRNA 5'帽子结构，与RNA Oligo连接，最终通过反转录合成cDNA第一链；
S206、以罗非鱼angptl8cDNA的3'-RACE、5'-RACE特异引物AN-F2(5'gcaagcacaggctccagatcat 3')、AN-F3(5'tgccaccttgtattccgtcttgctgg 3')和AN-R2(5'caggtaagaagacatggaaata 3')、AN-R3(5'cactgagagaactctccaaaagctga 3')，和GeneRacerTM Kit的通用引物扩增罗非鱼angptl8cDNA5'端片段和3'端片段；
S207、对所得到的PCR产物的回收纯化后，连接T载体、转化DH5α感受态，利用蓝白斑筛选阳性菌落，菌落PCR验证后进行DNA测序，通过分子克隆技术，在罗非鱼中克隆得到angptl8cDNA序列1059bp，其中开放阅读框(ORF)序列321bp，编码的angptl8蛋白为106个氨基酸，蛋白前体等电点为9.37，分子量为12.04千道尔顿，其中N-端信号蛋白由22个氨基酸组成(核酸序列表)；
S3、罗非鱼angptl8的组织表达分布：
利用实时荧光定量PCR技术检测罗非鱼angptl8在各种组织中的表达；
S301、提取罗非鱼下丘脑、端脑、视顶盖、小脑、嗅球、延髓、脊髓、垂体、肝脏、脂肪、肠、肌肉等12个组织总RNA；
S302、经DNaseI处理后，按照iScriptTM说明书取1μg RNA进行反转录；
S303、将反转录产物稀释10倍作为cDNA模板，参照iQTM
Figure GDA0004157174410000061
GreenSupermix说明书准备qPCR反应体系，qPCR所涉及的具体反应程序如下：95℃预变性2min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40个循环；
S304、通过分析qPCR溶解曲线，确定扩增产物特异性；
为保证结果的可信性，进行qPCR反应时每个样品设置三个平行；
采用实时荧光定量PCR检测罗非鱼angptl8基因在各种组织中的表达，结果显示在肝脏和肌肉中表达丰度最高；在其他组织表达量较低。显示出angptl8具有明显的组织表达特异性(图1)；
S4、罗非鱼angptl8在进食过程的表达变化：
S401、将体重2±0.5g的罗非鱼随机分配到四个玻璃缸中，分别为对照组和3个投喂组，平均每个缸6条罗非鱼；
S402、每天下午4点投喂1次，食物投喂量为体重的3％，驯养两周后，实验正式开始；
S403、按照下列时间点对正常喂养下罗非鱼的下丘脑取样：摄食前1h、摄食中(0hr)、摄食后1hr和摄食后3hr；
S404、罗非鱼用0.05％MS-222麻醉后处死收集下丘脑样品，液氮速冻处理，存放于-80℃超低温冰箱备用；
S405、通过qPCR技术检测罗非鱼下丘脑中angptl8基因表达量变化；
用实时荧光定量PCR检测罗非鱼基因在进食状态下的变化，结果表明：下丘脑angptl8mRNA表达水平在进食1小时后被显著抑制，表明angptl8与摄食调控相关(图2)；
S5、angptl8重组蛋白制备：
S501、以罗非鱼肝脏组织cDNA为模板，通过Taq酶试剂盒扩增angptll8cDNA序列全长；
S502、使用1.5％琼脂糖凝胶对扩增后的产物进行电泳，并用胶回收试剂盒进行目的片段回收；
S503、将纯化片段双酶切后连接pET30a(+)表达载体，并转化BL21(DE3)感受态细胞；
S504、利用LB培养基(Kana抗生素：50mg/ml)筛选阳性表达菌落，菌液PCR验证后保种；
S505、按照1％LB培养基(Kana抗生素：50mg/ml)体积加入angptl8-pET30a(+)-BL21(DE3)菌液，37℃，200rpm摇床过夜后，将菌液倒入100倍体积的LB培养基(Kana抗生素：50mg/ml)中，37℃，200rpm培养至菌液浓度OD600≈0.5(约3hr)，加入IPTG至终浓度为0.1mM，37℃，200rpm诱导表达6hr；
S506、菌液5000×g离心2min后弃上清，并用裂解液润洗2次；
S507、按照菌液体积10％加入裂解液，冰浴超声破碎，超声条件：6mm探头，40％功率，工作4s，休息9s，工作时间10min；
S508、破碎液通过10,000×g4℃离心30min，使用0.45μm过滤器过滤上清液；
S509、利用His标签蛋白纯化试剂盒(碧云天生物技术公司)纯化蛋白，洗脱条件为：50mM咪唑和100mM咪唑裂解液清洗杂蛋白，500mM咪唑裂解液洗脱目的蛋白；
S5011、利用3K超滤管(Milipore)浓缩洗脱液，BCA法测目的蛋白终浓度为1.2g/L(图3)；
通过体外重组蛋白angptl8原核表达后大量纯化获得活性蛋白(图3)；
S6、采用腹腔注射研究angptl8重组蛋白对罗非鱼摄食的影响：
S601、将体重2±0.5g的罗非鱼随机分配到2个玻璃缸中，平均每个缸6条罗非鱼；
S602、罗非鱼每天下午4点投喂一次，食物投喂量为体重的3％，驯养两周后开始正式实验；
S603、罗非鱼用MS-222麻醉后，称量每组中个体体重(body weight，BW)，根据体重分别由腹腔注射0.7％鱼类生理盐水(对照组)、1μg/g BW angptl8；
S604、注射10分钟后，分别向每组罗非鱼投喂固定重量的食物，让每组罗非鱼自由摄食2小时；
S605、将各组剩余的食物分别收集并烘干，根据剩余的食物的重量计算各组中单位体重罗非鱼的摄食量；
采用腹腔注射化学原核表达的angptl8成熟蛋白，实际应用表明，angptl8能够显著性增加罗非鱼的摄食量(图4)。
因此，本发明鱼类angptl8基因编码的成熟蛋白angptl8可以用于诱导鱼类摄食。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种鱼类摄食调控肽的制备和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgatctgga gcctgtgctt gc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaagcacag gctccagatc at 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgccaccttg tattccgtct tgctgg 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttacatattt ccatgtcttc tta 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggtaagaa gacatggaaa ta 22
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cactgagaga actctccaaa agctga 26
<210> 7
<211> 1059
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctgaggggc tgatgacact gctatgacag acaagtgcct gtttatggct ttcatttttg 60
tctcatacat aaaaaaaaag ctttattttg cacaggcgct attgctgaaa gataaatcag 120
aaatatcttt tgaacatttg aaagaactga ggaaacaaca tttattatcg caatgatctg 180
gagcctgtgc ttgctttttg tggctggagc agtgcacgca agcccggtca ggaagaccag 240
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cagccggtct ttgaagaaca ctgagagaac tctccaaaag ctggggaaac agactgagca 420
ggctgcagag gtggagaaac agatcaaaga agtgatacag ctgctacagg taagaagaca 480
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caggagctga ggacaaaagt gaaccggttg gagatgcacc tcagcaactc tgtacctcca 600
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cttttgactc agttccaaaa agaggatatt gagagtcaga atgagcagct tgccaaactg 720
cagaagatga gtgaagtgct gacatgatcc agatctcaac tccataaact cactgcactc 780
ccttccaacc ttgctatgga tgctatagat caactgtact ggcagaaaat atatattttg 840
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tgtgtcttta catcagtttg ctttgtaaat ttgcttttta aaataagctg ttaaattatt 960
aaagattgtg tttggtgaac tagtattata tgtacacgct gtacatagaa taaaaacaat 1020
ttgtttgttt tttgtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1059

Claims (2)

1.一种鱼类摄食调控蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以罗非鱼肝脏组织cDNA 为模板，通过 Taq 酶试剂盒扩增 angptll8 cDNA 序列全长，其中，angptl8cDNA 序列如序列 7 所示；
(2) 使用 1.5%琼脂糖凝胶对扩增后的产物进行电泳，并用胶回收试剂盒进 行目的片段回收；
(3) 将纯化片段双酶切后连接 pET30a(+)表达载体，并转化 BL21(DE3) 感受态细胞；
(4) 利用LB 培养基筛选阳性表达菌落，菌液 PCR 验证后保种；
(5)按照 1% LB 培养基体积加入 angptl8-pET30a(+)-BL21(DE3)菌液，37℃， 200rpm摇床过夜后，将菌液倒入 100 倍体积的 LB 培养基中，37℃ ，200rpm 培 养至菌液浓度OD600≈0.5 ，加入 IPTG 至终浓度为 0. 1mM ，37℃ ，200rpm 诱导 表达 6hr；
(6) 菌液 5000×g 离心 2min 后弃上清，并用裂解液润洗 2 次；
(7) 按照菌液体积 10%加入裂解液，冰浴超声破碎；
(8) 破碎液通过 10,000×g4℃离心 30min，使用 0.45μm 过滤器过滤上清液；
(9) 利用 His 标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，洗脱条件为：50mM 咪唑和 100mM 咪唑裂解液清洗杂蛋白，500mM 咪唑裂解液洗脱目的蛋白；
(10) 利用3K 超滤管浓缩洗脱液，BCA 法测目的蛋白终浓度。
2.根据权利要求 1 所述一种鱼类摄食调控蛋白的制备方法，其特征在于， 步骤 (7)中所述的超声条件：6mm 探头，40%功率，工作 4s ，休息 9s ，工作时 间 10min。
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