CN114668898A - 脂肪乳在制备创伤修复材料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于创伤修复技术领域，具体涉及脂肪乳在制备创伤修复材料中的应用。该脂肪乳在体外和体内均具有良好的抗炎作用，可显著下调促炎细胞因子TNF‑α和IL‑1β的表达；同时，脂肪乳还可促进血管生成和细胞迁移，作用于创伤愈合的各时期，具有显著的促进创伤修复的作用；将基于脂肪乳制备的创伤修复敷料应用在在糖尿病创面小鼠模型中，可增加创面的血管密度，加快伤口的愈合率，促进组织上皮化和更多胶原沉积形成。

Description

脂肪乳在制备创伤修复材料中的应用

技术领域

本发明属于创伤修复技术领域。更具体地，涉及脂肪乳在制备创伤修复材料中的应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，是隔绝机体内部和环境外界接触的保护屏障。日常生活或其他疾病影响造成皮肤受损而不及时修复时，创面很容易受到感染，演变成慢性伤口，比如糖尿病足溃疡(DFU)是一种常见的糖尿病综合征，严重时甚至危及生命，需要截肢。

研究表明，创伤愈合主要包含止血凝血期、炎症期、增殖期和组织重塑期四个时期：止血凝血期，血小板激活，分泌相关因子产生一系列级联反应，促使血液凝集成血栓，达到凝血作用，同时刺激机体产生炎症反应等；炎症期，中性粒细胞和巨噬细胞等炎症细胞，吞噬组织碎片并杀灭入侵的细菌等环境中的污染物，同时分泌各种细胞因子，刺激成纤维细胞***、胶原合成和血管生成；增殖期时，成纤维细胞则产生胶原蛋白、纤连蛋白等各种细胞外基质成分，合成肉芽组织，同时分化成肌成纤维细胞，再分泌相关蛋白促进伤口收缩；组织重塑期，胶原蛋白和纤连蛋白等在相关细胞因子和细胞的共同调节下，进行不断地合成和分解，达到一个平衡，进行不断地重塑。

为了促进创伤愈合各时期的快速进行，现有技术研究了多种创伤修复材料，如中国专利申请公开了一种用于创伤修复的有机-无机杂化敷料，该敷料由褐藻多糖硫酸酯在3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷偶联剂下修饰二氧化硅制备得到，具有良好的生物相容性、无细胞毒性、可以吸附炎症因子、促进细胞迁移和血管生成，促进慢性伤口愈合的作用；但是该材料制备方法步骤多、操作复杂，极大地限制了其应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有创伤修复材料制备方法步骤多、操作复杂的缺陷和不足，提供已临床应用的现有产品脂肪乳在制备创伤修复材料中的应用。

本发明的目的是提供一种创伤修复敷料。

本发明的另一目的是提供所述创伤修复敷料的制备方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

发明人在实践中发现，脂肪乳在体外和体内均具有良好的抗炎作用，可显著下调促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达；同时，脂肪乳还可促进血管生成和细胞迁移，作用于创伤愈合的各时期，具有显著的促进创伤修复的作用。

因此，本发明要求保护脂肪乳在制备创伤修复材料中的应用。

优选地，所述脂肪乳包括大豆油50～200mg/mL、C_6～24中链甘油三酸酯25～100mg/mL、卵磷脂6～12mg/mL。

更优选地，所述C_6～24中链甘油三酸酯选自辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯中的一种或两种。

另外的，本发明还提供了一种创伤修复敷料，所述创伤修复敷料包括脂肪乳和载体基质。

本发明制备得到的创伤修复敷料对烧伤、挤压伤、撞击伤、开放性伤口等创伤均具有较好的修复效果；并且通过实验证明，将本发明基于脂肪乳制备的创伤修复敷料应用于体内的糖尿病创面小鼠模型，可增加小鼠慢性伤口的血管密度，加快伤口愈合的速率，促进组织上皮化和更多胶原沉积产生，加快伤口的修复愈合。

优选地，所述脂肪乳包括大豆油50～200mg/mL、C_6～24中链甘油三酸酯25～100mg/mL、卵磷脂6～12mg/mL。

进一步地，所述载体基质选自医用纱布、医用海绵、医用泡沫、水凝胶中的一种或几种。

优选地，所述水凝胶为物理凝胶或化学凝胶。其中，所述物理凝胶可以为明胶、琼脂等，所述化学凝胶可以为聚丙烯酰胺-聚丙烯酸水凝胶、海藻酸-壳聚糖水凝胶等。更优选地，所述水凝胶为甲基丙烯酸酐化透明质酸。

更进一步地，所述脂肪乳和载体基质的质量比为1：(2～2×10⁶)。优选地，所述脂肪乳和载体基质的质量比为1：(200～20000)。

另外的，本发明还提供了所述创伤修复敷料的制备方法，包括以下步骤：

将脂肪乳稀释于生物相容性溶剂中，使脂肪乳的浓度为0.01～10000μg/mL，将所得脂肪乳负载于载体基质上，即得。

进一步地，所述生物相容性溶剂为水、PBS缓冲液或液体培养基。

优选地，所述脂肪乳的浓度为1～1000μg/mL，优选地，所述脂肪乳的浓度为10～100μg/mL，更优选地，所述脂肪乳的浓度为100μg/mL。

优选地，所述PBS缓冲液的pH为6.5～7.5。

优选地，所述液体培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、RPMI 1640培养基、F12培养基或IMDM培养基中的一种或几种。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了脂肪乳在制备创伤修复材料中的应用，该脂肪乳在体外和体内均具有良好的抗炎作用，可显著下调促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达；同时，脂肪乳还可促进血管生成和细胞迁移，作用于创伤愈合的各时期，具有显著的促进创伤修复的作用；将基于脂肪乳制备的创伤修复敷料应用在在糖尿病创面小鼠模型中，可增加创面的血管密度，加快伤口的愈合率，促进组织上皮化和更多胶原沉积形成。

另外的，脂肪乳已被FDA批准用于临床给胃肠道不能获得足够营养的病人提供营养，安全性有保障，并且制备方法简单，绿色安全，成本低，易于实现与大规模应用。

附图说明

图1为应用例1中检测脂肪乳粒径大小的DLS结果数据图。

图2为应用例2中脂肪乳形貌的TEM图。

图3为应用例3中检测不同浓度脂肪乳的细胞相容性荧光显微镜图。

图4为应用例3中检测不同浓度脂肪乳对HUVEC增殖率影响结果数据图。

图5为应用例4中不同浓度脂肪乳对炎症细胞因子Tnf-α基因转录水平影响结果数据图。

图6为应用例4中不同浓度脂肪乳对炎症细胞因子Il-1β基因转录水平影响结果数据图。

图7为应用例5中正常环境中不同浓度脂肪乳对细胞成血管能力的影响显微图。

图8为应用例5中正常环境中不同浓度脂肪乳对细胞成血管能力影响的定量结果数据图。

图9为应用例5中炎症环境中脂肪乳对细胞成血管能力影响的定量结果数据图。

图10为应用例6中不同浓度脂肪乳对细胞迁移的影响显微图。

图11为应用例7中基于脂肪乳的创伤修复敷料对糖尿病老鼠背部创面修复的结果图。

图12为应用例7中本发明制备得到的基于脂肪乳的创伤修复敷料对大鼠皮肤背部创面组织修复影响的免疫荧光染色、HE染色和Masson染色结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

脂肪乳(250mL脂肪乳含大豆油12.5～50g，C_6～24中链甘油三酸酯6.25～25g，卵磷脂1.5～3g)：购于中山大学第七附属医院。

全培养基：10％FBS+1％双抗的DMEM培养基，购于广州安晋生物科技有限公司。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1基于脂肪乳的创伤修复敷料的制备

一种基于脂肪乳的创伤修复敷料的制备包括以下步骤：

S1.将脂肪乳稀释于PBS缓冲液(pH 7.4)中，所得脂肪乳溶液的浓度为100μg/mL；

S2.将1mL步骤S1所得脂肪乳溶液与20mg甲基丙烯酸酐化透明质酸混合均匀，紫外照射30s，即可得到所述创伤修复敷料。

实施例2基于脂肪乳的创伤修复敷料的制备

一种基于脂肪乳的创伤修复敷料的制备包括以下步骤：

S1.将脂肪乳稀释于PBS缓冲液(pH 7.4)中，所得脂肪乳溶液的浓度为100μg/mL；

S2.将脂肪乳溶液吸附至纱布中，使纱布浸润，即可得到所述创伤修复敷料。

实施例3基于脂肪乳的创伤修复敷料的制备

一种基于脂肪乳的创伤修复敷料的制备包括以下步骤：

S1.将脂肪乳稀释于PBS缓冲液(pH 7.4)中，所得脂肪乳溶液的浓度为100μg/mL；

S2.将脂肪乳溶液吸附至海绵中，使海绵浸润，即可得到所述创伤修复敷料。

实施例4基于脂肪乳的创伤修复敷料的制备

一种基于脂肪乳的创伤修复敷料的制备包括以下步骤：

S1.将脂肪乳稀释于PBS缓冲液(pH 7.4)中，所得脂肪乳溶液的浓度为100μg/mL；

S2.将脂肪乳溶液吸附至泡沫中，使泡沫浸润，即可得到所述创伤修复敷料。

实施例5基于脂肪乳的创伤修复敷料的制备

一种基于脂肪乳的创伤修复敷料的制备包括以下步骤：

S1.称取100mg甲级丙烯酸酐化透明质酸基质(HA-MA)溶解在5g PBS缓冲液(pH7.4)中，搅拌2h；

S2.吸取脂肪乳与HA-MA基质混合，使得基质中脂肪乳的浓度为100μg/mL，紫外照射30s成胶，即可得到所述创伤修复敷料。

应用例1脂肪乳粒径大小的DLS测试

1、实验方法

用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释脂肪乳使其浓度为100μg/mL，混匀，得脂肪乳溶液；吸取1mL脂肪乳溶液于比色皿中；将比色皿放置于纳米粒度仪中检测。

2、实验结果

DLS对脂肪乳粒径大小测试结果如图1所示，由图可见，脂肪乳的尺寸范围为130～590nm，平均尺寸约为267nm。

应用例2通过TEM观察脂肪乳的形貌

1、实验方法

用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释脂肪乳使其浓度为100μg/mL，混匀，得脂肪乳溶液；用镊子取出TEM铜网，并放置于热灯下；用10μL的枪头吸取稀释好的脂肪乳溶液，将大约5uL的脂肪乳溶液滴在铜网上，打开热灯，加热大概20分钟，待铜网基本完全干燥；取出铜网，放置于空气中风干30分钟，再将铜网放置于透射电镜中观察脂肪乳的形貌。

2、实验结果

通过TEM观察脂肪乳的形貌如图2所示，由图可见，脂肪乳具有均匀的球形形貌。

应用例3脂肪乳的细胞相容性检测

1、实验方法

(a)将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分别接种在24和96孔板中，加入全培养基过夜待贴壁；

(b)去除旧培养基，实验组分别加入5个不同浓度(10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、300μg/mL和500μg/mL)的含脂肪乳的全培养基，阴性对照组只加入全培养基；

(c)分别共培养1、2、和3天后去除旧培养基，24孔板每孔加入200μL含钙黄绿素和碘化丙啶(PI)的DMEM培养基，孵育10分钟后，将24孔板放置于倒置荧光显微镜中观察细胞的增殖情况；96孔板每孔加入20μL MTT溶液，孵育4h，去培养液，每孔加100μL DMSO溶解晶体，摇床振荡8～10min，再把孔板放置在酶标仪上，采用490nm波长检测吸光值。

2、实验结果

不同浓度脂肪乳对HUVEC增殖率影响结果如图3和4所示，当脂肪乳的浓度低于等于100μg/mL时，基本观察不到死细胞，细胞的增殖率和阴性对照组的增殖率基本一致，不影响细胞的正常生长。但当脂肪乳浓度大于等于300μg/mL时，从图3可见较多死细胞，图4的细胞增殖率受到明显的抑制。

应用例4脂肪乳对炎症细胞因子Tnf-α和Il-1β基因转录水平影响测试

1、实验方法

(a)将RAW 264.7巨噬细胞接种在12孔板中，加入全培养基过夜待贴壁；

(b)去除旧培养基，阴性组加入DMEM培养基，阴性实验组分别加入含10μg/mL和100μg/mL脂肪乳溶液的DMEM培养基，共孵育24h；阳性组加入含脂多糖(LPS，100ng/mL)的DMEM培养基，阳性实验组分别加入含10μg/mL和100μg/mL脂肪乳溶液及LPS的DMEM培养基；

(c)LPS诱导炎症2h后，去除含LPS的培养基，并用PBS缓冲液(pH 7.4)清洗细胞2遍，阳性组加入DMEM培养基，阳性实验组分别加入含10μg/mL和100μg/mL脂肪乳溶液的DMEM培养基，继续孵育6h；

(d)去除培养基，用PBS清洗细胞2遍，每个样品加入1mL Trizol溶液，吹打均匀，收于1.5mL EP管中室温静置10min；

(e)每管加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min，4℃，14000g，离心15min；取200～400μL上清于新EP管，再每管加入0.5mL异丙醇，室温放置10min，4℃，14000g，离心15min；弃上清，加入冰预冷75％乙醇(DEPC水配)洗涤2次，12000g，离心5min；弃上清，室温自然干燥5～10min，再用20μLDEPC水溶解RNA；

(e)用核酸蛋白检测仪检测RNA的纯度和浓度；

(f)每20μL体系取1μg RNA进行逆转录；

(g)使用PCR仪进行qRT-PCR反应，检测炎症细胞因子Tnf-α和Il-1β基因转录水平。

2、实验结果

脂肪乳溶液对炎症细胞因子Tnf-α和Il-1β基因转录水平影响结果如图5和6所示。由图可见，RAW 264.7巨噬细胞在不同浓度的脂肪乳中孵育24h后，与阴性组相比，Tnf-α和Il-1β转录水平无差异；LPS诱导后，阳性组可见炎症细胞因子Tnf-α和Il-1β的基因转录水平明显上调，但经过100μg/mL脂肪乳溶液处理巨噬细胞后，Tnf-α和Il-1β的基因转录水平被显著性降低。

以上结果表明，脂肪乳不会刺激细胞产生炎症反应，同时具有良好的抗炎效果。

应用例5脂肪乳对细胞成血管的影响

1、实验方法

(a)4℃解冻matrigel，待matrigel解冻完成，在ibidi 96孔板上加10μLmatrigel；

(b)将96孔板放置37℃培养箱凝固30min；

(c)与此同时，准备5000/50mL HUVEC细胞悬浮液；

(d)30min后，分别每孔加入50μL HUVEC细胞悬浮液；

(e)待细胞全部沉在matrigel上，再轻柔地将培养液吸走，对照组加入DMEM培养基，10FE和100FE组分别加入含10μg/mL和100μg/mL脂肪乳的DMEM培养基；阳性组(LPS)加入由LPS诱导RAW264.7巨噬细胞24h后的DMEM培养基，10FE+和100FE+组分别加入含10μg/mL和100μg/mL脂肪乳且由LPS诱导RAW264.7巨噬细胞24h后的DMEM培养基；

(f)2h，6h和8h后观察管状形成情况，并拍照。

2、实验结果

脂肪乳的成血管能力结果如图7和8所示，由图可见，脂肪乳不仅可以促进官腔结构的形成，还可以促进更多管道数量的形成；与对照组相比，脂肪乳在2h后即可形成明显的官腔，能更早形成管状结构；并且随着时间的迁移，4h后管状结构越来越明显，管道数量越来越多。以上结果表明，脂肪乳可以促进官腔结构的形成和管道数量的形成，且表现出浓度依赖性。

通过imageJ软件分析计算得到图9数据，由图可见，当HUVEC细胞处于炎症环境时，脂肪乳仍然可提高细胞的成血管效果。

应用例6脂肪乳对HUVEC迁移能力的影响

1、实验方法

(a)铺板，6孔板(每孔25×10⁴)，待HUVEC细胞长满；

(b)用200uL枪头在每个孔板划3条直线，去旧液，用PBS缓冲液(pH 7.4)轻柔清洗孔板1～2次，阴性组加入DMEM培养基，阴性实验组分别加入含10μg/mL和100μg/mL脂肪乳的DMEM培养基；阳性组加入LPS诱导巨噬细胞24h后的DMEM培养基，阳性实验组分别加入含10μg/mL和100μg/mL脂肪乳的LPS诱导巨噬细胞24h后的DMEM培养基；拍照，再放回培养箱继续培养；

(c)每隔12h观察划痕的迁移情况，并拍照，待某一组迁移完成即可结束实验。

2、实验结果

脂肪乳对HUVEC细胞迁移能力的影响结果如图10所示，由图可见，10μg/mL和100μg/mL的脂肪乳均可促进HUVEC细胞迁移，并且呈现出浓度依赖性的特征。同时，在炎症的环境中，脂肪乳促进HUVEC迁移的效果更加显著，尤其是100μg/mL的脂肪乳(100FE+组)溶液。72h后，100FE+组的HUVEC细胞完全迁移，迁移率达到100％。这一结果表明了脂肪乳无论在正常的培养环境还是在炎症环境中均可促进HUVEC的迁移。

应用例7基于脂肪乳的创伤修复敷料对糖尿病小鼠创伤修复的影响

1、实验方法

(1)皮肤伤口造模

(a)选取体重20～22g的雄性C57小鼠为研究对象，禁食12h后，给所有的小鼠腹腔注射链脲佐菌素(150mg kg^-1)诱导I型糖尿病；

(b)一周后，给老鼠禁食12h后检测小鼠的血糖水平，如果空腹血糖超过16.7mM，认为小鼠I型糖尿病造模成功；

(c)将造模成功的小鼠随机分成2组，腹腔注射巴比妥钠麻醉小鼠，背部剃毛，然后全层切除小鼠背部5mm圆形皮肤；

(2)创口上药

对照组伤口处用HA-MA水凝胶处理，实验组伤口处用实施例5制备所得创伤修复敷料处理，每天上药并拍照。

2、实验结果

本发明制备得到的基于脂肪乳的创伤修复敷料对糖尿病小鼠皮肤背部创面组织修复影响的伤口面积大小、免疫荧光染色、HE染色和Masson染色结果如图11和12所示。

图11表明基于脂肪乳的创伤修复敷料可有效加快伤口愈合的时间，手术11天后，糖尿病小鼠的皮肤创面基本完全愈合，但是对照组的还存在明显的伤口。图12IL-1β免疫荧光染色显示基于脂肪乳的创伤修复敷料可以降低伤口的炎症反应，可促进伤口愈合；PDGF-B免疫荧光染色表明基于脂肪乳的创伤修复敷料可促进愈合组织形成更丰富的血管；由HE和Masson染色结果可以看出，与对照组相比，基于脂肪乳的创伤修复敷料组的伤口肉芽组织程度较高，血管分布丰富，有丰富的毛囊出现，伤口完全上皮化。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.脂肪乳在制备创伤修复材料中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述脂肪乳包括大豆油50～200mg/mL、C_6～24中链甘油三酸酯25～100mg/mL、卵磷脂6～12mg/mL。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述C_6～24中链甘油三酸酯选自辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯中的一种或两种。

4.一种创伤修复敷料，其特征在于，所述创伤修复敷料包括脂肪乳和载体基质。

5.根据权利要求4所述创伤修复敷料，其特征在于，所述脂肪乳包括大豆油50～200mg/mL、C_6～24中链甘油三酸酯25～100mg/mL、卵磷脂6～12mg/mL。

6.根据权利要求4所述创伤修复敷料，其特征在于，所述载体基质选自医用纱布、医用海绵、医用泡沫、水凝胶中的一种或几种。

7.根据权利要求6所述创伤修复敷料，其特征在于，所述水凝胶为物理凝胶或化学凝胶。

8.根据权利要求4～7任一所述创伤修复敷料，其特征在于，所述脂肪乳和载体基质的质量比为1：(2～2×10⁶)。

9.权利要求4～8任一所述创伤修复敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将脂肪乳稀释于生物相容性溶剂中，使脂肪乳的浓度为0.01～10000μg/mL，将所得脂肪乳负载于载体基质上，即得。

10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，所述生物相容性溶剂选自水、PBS缓冲液、液体培养基中的一种或多种。

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