CN1146663C - 选择性标记 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及氨基氰水合酶作为一种选择性标记在植物转化中的应用。氨基氰作为一种除草剂，用编码氨基氰水合酶基因转化的植物能够将氨基氰转变成尿素，这使通过氨基氰压力下的存活能够对转化植物进行选择。

Description

选择性标记
发明领域
本申请涉及一种新的选择性标记，尤其是氨基氰水合酶作为一种在转化实验中，特别是在植物转化实验中的选择性标记的用途。
背景技术
氨基氰(H2N-C≡N)是氰的衍生物，如其它氰衍生物一样，在农业中用于刺激生长和植物保护。氨基氰以水溶液或以其钙盐形式被用作肥料，方法是通过其的代谢转变向土壤提供氨。不过，它还具有另外的作为除草剂的优势。要用它作为肥料，它必须在播种前施用。
化学上，氨基氰属于氰类化合物。尽管含有氰基的化合物相对而言很少在自然界出现，水合这一基团的酶已在细菌和植物中发现(如，Nagasawa T.等人，1988，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)， 115 1008-1016；Endo T.和Watanabe I.，1989，FEBSLett.， 243 61-65)。在真菌疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)也发现了一种氰水合酶(Stransky H.和Amberger A.，1973，Z.Pflanzenphysiol， 70 74-87)，其水合氨基氰的氰基，伴随尿素生成：
Maier-Greiner等人已分离了该酶且克隆了编码该酶的基因(美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci)，88：4260-4264，1991)。他们已证实该酶具有极端窄的底物特异性，即氨基氰化学上相关的化合物不被认为是其底物。
选择性标记必须赋予转化细胞一个显性表型，其能够作为一个选择标准。这些选择性标记分为两类：一类基因赋予转化细胞在选择性试剂存在下的生存能力或致死性，而另一类基因虽然对细胞的存活影响很小，但赋予了转化细胞一些有区别的生理特征。
在植物转化中，整合了新DNA的细胞比例一般是低的，因此最稳定的转化方案采用标记以确保转化的细胞能在选择性试剂存在下存活。
大量的第一类选择性标记已为人所知并被用于植物的转化实验多年。所包括的标记有新霉素磷酸转移酶(npt)，其赋予转化细胞对一组抗生素，包括卡那霉素、巴龙霉素、geneticin和新霉素的抗性；乙酰乳酸合成酶(als)的突变体形式，其赋予对咪唑啉酮、磺酰脲类、***咪啶及嘧啶基氧苯甲酸的抗性；潮霉素3’-O-磷酸转移酶(hpt)，其赋予对潮霉素的抗性。同样适用的标记有氯霉素转移酶(cat)，其可解除氯霉素的毒性；二氢叶酸还原酶(dhfr)，其可中和氨甲蝶呤的毒效应。另一种可能性是将bar基因用于产生对除草剂双丙酰氨膦的抗性(WO 97/05829)。
尽管已有大量的选择性标记可用，但仍然需要另一种标记。这是由于如下原因：
-当用新构件第二次转化转基因植物时，需要借助第二种选择性标记选择新产生的转化体。
-上面提到的选择性标记并不能适用于所有的植物种类。
-一些只有被加入才能使选择变为可能的化合物为抗生素。赋予了对抗生素或除草剂抗性的基因的扩散应该尽可能最小，以避免赋予对病原体的抗性的风险。
-一些只有被加入才能使选择变为可能的化合物比较昂贵。需要较廉价的选择性试剂。
发明概述
本发明现在提供作为新选择性标记的编码氨基氰水合酶〔CAH〕基因的应用。优选地，此标记可用于植物的转化。基因包括核苷酸序列SEQID NO：1或其具有氨基氰水合酶功能的突变蛋白质。
本发明进一步包括用于选择转化植物的方法，其包含构建一个携带CAT编码序列和目标基因的载体，将载体转化到植物或植物器官或植物细胞或愈伤组织中，在含有氨基氰的培养基中培养产生的转化体。
本发明也涉及用于选择CAT编码基因所转化植物的氨基氰的应用。
本发明进一步的部分是包含编码氨基氰水合酶核苷酸序列和目标基因的表达盒。携带此表达盒的载体和宿主也是本发明的一部分，宿主包括携带了这种载体的土壤杆菌(Agrobacterium)。进一步，用这种载体和/或这种土壤杆菌转化的植物也构成本发明的一部分。
附图说明
图1.pMOG874中T-DNA的略图
图2.pMOG1156中T-DNA的略图
图3.pMOG22中T-DNA的略图
图4.pMOG1005中T-DNA的略图
图5.pMOG1278中T-DNA的略图
图6.pMOG1295中T-DNA的略图
图7.pMOG1253中T-DNA的略图
图8.pMOG873中表达盒的略图
图9 pMOG617中表达盒的略图
图10.用a)pMOG1156或pMOG410转化的拟南芥外植体在50mg/l氨基氰下选择。
发明详述
本发明涉及一种作为选择性标记的氨基氰水合酶编码基因的用途。
氨基氰水合酶(CAH)赋予对具有除草剂活性的化合物氨基氰的抗性。现在已发现该基因的这一特性可用于转化技术中，以有助于区分转化植物和未转化植物。然而，单独的除草活性不足以使基因用作选择性标记。因为还需要转化细胞中的该基因在选择性条件下得到表达。这种表达可以是组成型表达，或者在特殊组织中表达，如愈伤组织、种子、胚发生组织以及分生组织。更进一步，需要基因将植物对有毒化合物的敏感性转变为耐受性而没有任何残留的毒性。同样，对于选择性标记基因的应用，在选择所需的有毒化合物浓度与在选择基因存在下仍可观察到生长的浓度之间，存在足够大的“窗口”是重要的。此外，***应该优选地自动赋予细胞足够的功能，以便在嵌合组织中(如含有转化和未转化细胞的嵌合体组织)，未转化细胞不受到相邻转化细胞的保护而因此不能在选择中存活。令人惊奇地，编码CAH的基因和氨基氰有毒特性的组合使它们具备了用作选择性标记***的条件。
本发明显示出基于转化体对氨基氰的耐受性对转化体加以选择是可能的。
另外的优势在于氨基氰可被转化为尿素，在多种植物中尿素转化为NH3和CO2。NH3可被植物作为氮源利用。这对增加耐受与选择之间的“窗口”是一个额外的选择可能性。通常，培养基中含有氨和硝酸盐(含于Murashige和Skoog培养基，见表2和4)。如果这些氮源释放或其浓度降低，含有被CAH基因的转化植物，会将存在于培养基中作为选择性试剂的氨基氰转变为尿素并进一步转变为氨，氨可用作氮源。非转化植物无此功能，因此除了氨基氰的除草剂效应外，它们在氮吸收方面也处于竞争劣势。
编码CAH的核苷酸序列优选SEQ ID NO：1所描述的序列。该序列的突变体也可被认为是本发明的部分。突变体是核苷酸序列，其在该核苷酸序列中发生了变化，但仍然具有与SEQ ID NO：1中所示序列的相似功能和免疫特征。这些突变体也被称作功能变异体。此外，本发明的多聚核苷酸特别包括本质上(如下面描述所确定)与本发明的基因序列一致的基因序列，其所编码的蛋白质保持了本发明蛋白质的功能活性。因此，在CAH基因在此公开的情况下，上面术语包括变异的多聚核苷酸序列，其与在此公开的序列基本一致，其编码的蛋白质仍然具有氨基氰降解活性。
为了理想地对比两序列，通过在比较窗中比较两个被优化对比的序列，确定多聚核苷酸和多肽的“序列同一性百分率”，其中多聚核苷酸或多肽的部分在比较窗中与参考序列相比(其不含有***或缺失)可能含有***或缺失(如缺口)。百分率的计算：通过确定在两序列中出现相同核苷酸碱基或氨基酸残基位置的数量，产生匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以在对比窗中位置的总量，结果乘以100产生序列同一性的百分率。为了比较，理想的序列对比可以通过已知公式的计算机化仪器(如，Wisconsin遗传软件包方面中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFAST、遗传计算机组(GCG)、575科学博士、Madison WI.或BlastN和BlastX，可由国际生物技术信息中心获得)或通过检查进行。
术语“基本上相同”或“基本上相似”意思指在严格的条件下，多肽含有能够与目标多肽杂交的序列。在严格的条件下指2*SSC的溶液和65℃的温度。
“基本上相似”的多肽拥有与上面提到的序列相同的序列，除了不一致的残基位置因保守氨基酸改变可以不同。保守氨基酸的替代指具有相似侧链残基的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；一组具有酰胺的侧链的氨基酸为天门冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有含碱性侧链的氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；及一组具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。
多聚核苷酸基本上相同意思指多聚核苷酸含有至少70％序列同一性，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％。另一个核苷酸基本上相同的指示为，是否两分子可以在严格的条件下相互特异性地杂交。严格的条件依赖于序列并在不同的环境条件下而不同。一般，对于特定的序列，选择的严格条件为在一定的离子强度和pH下大约比解链温度(Tm)低10℃。Tm为50％靶序列与精确配对的探针杂交的温度(在一定的离子强度和pH)。杂交分子的Tm，是探针长度和碱基组成的一个函数，应用下列方法可以计算，见Sambrook T.等人，1989，分子克隆-实验手册(第二版)，1-3卷，冷泉港实验室，冷泉。一般，对于Southern斑点杂交技术方法，严格条件包括65℃下用0.2×SSC洗涤。对于优选的寡聚核苷酸探针，洗涤条件一般为大约42℃下于6×SSC中。
本发明提供一个嵌合的DNA序列，其含有能编码具有氨基氰水合酶活性的蛋白质的开放阅读框架。术语嵌合DNA指含有不能在自然界发现的DNA序列的任何DNA序列。例如，嵌合DNA指含有的DNA在植物基因组非天然的位置含有所述的开放阅读框架，即使所述的植物基因组在其天然染色***置正常地含有一个所述的开放阅读框架的拷贝。相似地，所述开放阅读框架可能整合在不能从中自然发现的植物的基因组中，或者整合在从中不能被自然地发现的一个复制子或载体中，比如细菌质粒或病毒载体。嵌合DNA不局限于能够在宿主中复制的DNA分子，而且也指含有能够被连接入复制子的DNA的DNA分子，例如根据本发明，通过特殊衔接序列的作用，物理地与开放阅读框架相连。开放阅读框架可能与或可能不与其自然的上游或下游调节元件相连。
开放阅读框架可能来源于基因组文库。在后一种情况中开放阅读框架可能含有一个或更多的内含子，将构成编码根据本发明的蛋白质之开放阅读框架的外显子分隔开。开放阅读框架也可以被一个非间断外显子编码，或者被编码根据本发明的蛋白质的mRNA的cDNA编码。根据本发明的开放阅读框架也包含其中含有一个或多个内含子被人工删除或添加的那些。本发明包含每一个这样的变体。
优选地，开放阅读框架来源于土壤真菌疣孢漆斑菌(如Maier-Greiner，U.H.等人，美国国家科学院学报， 88，4260-4264，1991中所描述)。
为了能够以表达的蛋白质赋予对有毒选择性试剂抗性的方式在宿主细胞中表达，通常在带有调节元件的表达盒内提供根据本发明的嵌合DNA，使它能够被宿主的生化机制所识别，并允许该开放阅读框架在宿主内转录和翻译。表达盒通常含有一个转录起始区域，其可以适当地来源于任何能够在所选择的宿主细胞中表达的任何基因，还含有一个翻译起始区域以便核糖体识别与附着。在真核植物细胞中，一个表达盒通常另外含有一个转录终止区域，位于所述开放阅读框架的下游，使转录能够终止、原初转录产物的多聚腺苷酸化能够发生。另外，密码子的使用可以与所选宿主采用的密码子的使用相适应。规定嵌合DNA构件在所选宿主细胞中表达的原理通常为本领域的一般技术人员所了解，可表达嵌合DNA构件的构建现在对任何种类的宿主细胞，无论其是原核或是真核，都是一种常规技术。
为了使开放阅读框架能够保持在宿主细胞中，其通常以复制子的形式提供，复制子含有根据本发明的所述开放阅读框架，此框架被连接到能被所选宿主细胞识别和复制的DNA上。相应地，复制子的选择主要由所选宿主细胞所决定。对于特定宿主如此决定合适的复制子选择的原则为本领域普通技术人员所熟悉。
特殊类型的复制子能够将本身或其中部分转移到另一宿主细胞如植物细胞，因而将根据本发明的开放阅读框架一起转移到所述植物细胞中。具有如此功能的复制子在此被称作载体。该载体的一个实例为Ti-质粒载体，当存在于合适宿主如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中时，其能够将自身的一部分即所谓的T-区转移给植物细胞。不同类型的Ti-质粒载体(参见：EP0 116 718 B1)现在常规地用于将嵌合DNA序列转移到植物细胞或原生质体，新的在其基因组中稳定地整合了所述嵌合DNA的植物可以由此产生。一种尤其优选形式的Ti-质粒载体是所谓的二元载体，如在(EP 0120 516 B1和美国4,940,838)中所要求保护的。其它可以用于将根据本发明的DNA导入植物宿主的合适载体可以从病毒载体中选择，例如，非整合的植物病毒载体，如来源于双链植物病毒(如CaMV)和单链植物病毒、双生(gemini)病毒等等。采用这些载体可能是有利的，尤其当难以稳定地转化植物宿主时。具有木质的物种可能是这种情况，特别是乔木和藤本植物。
“在其基因组中整合了根据本发明的嵌合DNA序列的宿主细胞”意思包括其基因组中稳定地整合了所述嵌合DNA而由此保持了嵌合DNA、并且无论通过有丝***还是减数***优选地传递这种嵌合DNA的一个拷贝给子代细胞的细胞、以及由这种的细胞构成或基本上由这种细胞构成的多细胞器官。这样的宿主细胞不但可以是原核生物如细菌，而且可以是真核生物如酵母。来自真核生物组织培养物的细胞，如植物或动物如哺乳动物的细胞培养物，可以预见稳定地整合嵌合DNA。根据本发明的一个优选的实施方案，提供了这样的植物，其基本上由基因组内整合了一个或多个所述嵌合DNA的细胞组成，同时其能够优选地以孟德尔模式传递一个或多个拷贝给子代。通过根据本发明的嵌合DNA转录和翻译的作用，那些产生CAH的细胞将显示出对氨基氰增强的抗性。尽管在植物细胞中控制DNA转录的原理还不总能完全清楚，但构建能够在经受氨基氰选择的组织如愈伤组织、种子、胚发生组织或分生组织中表达(或以组成型表达)的嵌合DNA现在已是常规方法。常规应用的、适用于转化的多聚核苷酸以组成型方式表达的转录起始区域是可以获得于花椰菜花叶病毒的启动子、著名的35S RNA与19S RNA转录启动子、根癌土壤杆菌的所谓的T-DNA启动子。尤其要提到的是胭脂碱合成酶启动子、章鱼碱合成酶启动子(如公开于EP0 122 791 B1)和甘露碱合成酶启动子。另外，植物启动子也可以用，其可能基本上为组成型，例如水稻的肌动蛋白基因启动子。尽管必须清楚：组成型的高水平启动子应该在进行选择的组织中可以表达，但是启动子的选择并不关键。人们进一步发现某类元件即所谓的增强子的重复可以显著提高其所控区域下的DNA表达水平(例如参见：Kay R.等人，1987，科学 236，1299-1302：CaMV35S启动子-343～-90之间的序列重复增强了该启动子的活性)。除了35S启动子，单独地或双重地被增强的高水平启动子的实例是光可诱导的二磷酸核酮糖羧化酶小亚基(rbcSSU)启动子和叶绿素a/b结合蛋白(Cab)启动子。本发明也预期了杂交启动子，其包含由物理上相互连接的不同启动子区域构成的元件。其中一个周知的实例是所谓的CaMV增强的甘露碱合成酶启动子(美国专利5,106,739)，其包含甘露碱合成酶启动子与CaMV增强子相连的元件。
特别是对于单子叶植物的转化，在启动子与选择性标记基因之间采用内含子增强表达。
术语“启动子”因此指结构基因上游的一段DAN区域，参与RNA聚合酶及其它蛋白质的识别和结合而起始转录。“植物启动子”是能够启动植物细胞内转录的启动子。“组成型启动子”是在大多数环境条件下和发育或细胞分化状态下具有活性的启动子。
对于本发明，组成型启动子是优选的，因为转化体的选择可能在多种阶段和多种组织中进行。因此，组成型启动子不限制选择的可能性。
就这一方面来说，选择合适的组成型启动子是重要的，因为在同样的转化过程中可采用其它的启动子。众所周知启动子的复制对所述启动子控制的基因的表达有影响。因为选择性标记的表达的目标仅仅是用于选择同时用目标基因转化的植物，因此必须牢记对选择性标记和目标基因采用同样的启动子可能产生问题。
关于转录终止子区域的必要性，普遍认为这样一个区域可以增强植物细胞中转录的可靠性以及效率。因此本文强烈地推荐对其的使用。
关于本发明在不同植物种上的应用，必须提到的是本发明的一个特定实施方案仅以转基因番茄、马铃薯、水稻以及拟南芥(Arabidopsis)植物作为实例，事实上实际的应用并不限于这些植物种类。
尽管本发明的一些实施方案目前可能无法实施，如由于一些植物种类到目前为止还难以进行遗传转化，在这样的植物上实施本发明仅仅是一个时间的问题而不是原则的问题，因为所指的遗传转化的难易与本发明所示的实施方案无关。
“植物的转化”是指将DNA导入植物的任何方法。这样的转化方法应该没有必要含有一个再生和/或组织培养周期。
植物种类的转化现在对于相当大数量的植物种类来说是常规的，包括双子叶植物和单子叶植物。原则上任何转化方法都可以用来将根据本发明的嵌合DNA导入合适的祖先细胞。方法可以适当地选自：适合于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等人，1982，自然(Nature) 296，72-74；Negruti I.等人，1987年6月，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)8，363-373)、原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等人，1985，生物/技术(Bio./Technol.) 3，1099-1102)、显微注射到植物材料(Crossway A.等人，1986，分子普通遗传〔Mol.Gen.Genet.〕 202，179-185)，(DNA或RNA包被的)粒子轰击多种植物材料(Klein T.M.等人，1987，自然 327，70)，用(非完整的)病毒感染，植物中通过植物的渗透或成熟花粉或微孢(EP0 301 316)或类似器官的转化完成的根癌土壤杆菌介导的基因转移。根据本发明一种优选的方法包含土壤杆菌介导的DNA转移。尤其优选的是应用所谓的二元载体技术(如EP A120 516和美国专利4,940,838中所描述)。
番茄转化优选地基本上按照Van Roekel等人所描述的进行(VanRoekel，J.S.C.等人，植物细胞报道(Plant Cell Rep.)， 12，644-647)。马铃薯的转化优选地基本上按照Hoekema等人所描述的进行(Hoekema，A.等人， 7，273-278，1989)。
虽然单子叶植物被认为难以进行遗传转化，但却能够被转化，而且可育的转基因植物可以由转化细胞或胚、或其它植物材料再生。目前，对于单子叶植物转化优选的方法是对胚、外植体或悬浮细胞进行微粒子轰击、直接吸收DNA或(组织)电穿孔法(Shimamoto等人，自然 338，274-276，1989)。通过微粒子轰击将编码phosphinothricin乙酰转移酶(一种使除草剂phosphinothricin失去活性的酶)的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因导入玉米悬浮培养物的胚发生细胞已经获得了转基因玉米植株(Gordon-Kamm，植物细胞(Plant Cell)，2，603-618，1990)。通过选择胚发生愈伤组织以建立胚发生悬浮培养物，小麦植株已由胚发生的悬浮培养物得到再生(Vasil，生物技术， 8，429-434，1990)。对于这些作物，组合几种转化***以使本发明能够应用于单子叶植物。
单子叶植物，包括商业上重要的作物如水稻和玉米也能够通过土壤杆菌菌株进行DNA转移(参见WO94/00977；EP0 159 418 B1；Gould J、Michael D、Hasegawa O、Ulian EC、Peterson G、Smith RH，植物生理学〔Plant.Physiol.〕，95，426-434，1991)。
要获得能够表达一个以上嵌合基因的转基因植物，大量的可供选择方法如下：
A.DNA的应用，如在二元质粒上的T-DNA，携带大量的、与第二种选择性标记基因物理连接的经修饰的基因。本方法的优点是嵌合基因物理地连接，因此以一个孟德尔位点转移。在这方面本发明特别有用，因为对于第二种选择性标记，它可以使其被连接到已经存在的目标选择性标记基因的旁边。因此进行再转化体的选择时可以不考虑第一种选择性标记的性质。
B.各自已经能够表达一个或多个嵌合基因的转基因植物，优选地为与选择性标记基因相连的嵌合基因，用来自含有一个或多个与另一个选择性标记基因相连的嵌合基因之转基因植物的花粉进行转基因植物的交叉授粉。然后由此杂交获得的种子可以在两个选择性标记存在的基础上进行选择，或在嵌合基因本身存在的基础上进行选择。从所选种子获得的植物然后可以用于进一步的杂交。原则上，嵌合基因不是在单个位点上，因此基因可能隔离为几个独立的位点。此处，选择两个选择性标记的可能性也是本发明的优势之一。
C.许多复合嵌合DNA分子的应用，如质粒，每一个都有一个或多个嵌合基因和选择性标记。如果共转化的频率高，那么仅以一个选择性标记为基础的选择是足够的。在其它情况下，以一个以上选择性标记为基础的选择是优选的。
D.用新的嵌合DNA(其任选地包含一个选择性标记基因)连续转化已经含有第一个、第二个(等等)嵌合基因的转基因植物。如在方法B中，嵌合基因原则上不是单一位点，因此嵌基因可能隔离为几个独立的位点。
E.上面所提方案的综合。
实际的方案可能取决于很容易确定的几点考虑，例如双亲品系的目标(直接种植、用于育种计划、用于生产杂交种)，但是对所述的发明并不十分关键。
虽然对本发明没有必要，但众所周知实践中所有的植物都可以由培养的细胞或组织再生。虽然再生的含义因植物种类的不同而异，但是一般首先提供的是转化的原生质体悬浮液或含有转化的外植体的培养皿。由器官发生或胚发生可以直接或间接(从愈伤组织)诱导出幼芽，随后生根。除了选择性化合物，培养基将普遍含有多种氨基酸和激素，例如植物生长素、细胞***素。高效的再生将依赖培养基、基因型和培养过程。如果这三个可变的因素得到控制，再生通常是可以再次产生和可以重复的。
在将待转化的基因序列稳定地整合到转基因植物中之后，被它们赋予的显著特性可以通过有性杂交转移到其它植物中。大量的标准育种技术中的任何一种都可以应用，这取决于于待交配的物种。
实施例1
编码氨基氰水合酶(CAH)的真菌基因在异源表达盒中的克隆
a.用于转化双子叶植物的构件
构件pMOG874含有来自土壤真菌疣孢漆斑菌氨基氰水合酶基因的编码区域，其有效地连接到CaMV 35S启动子和CaMV 35S终止子上。此嵌合基因在二元载体pBI101，替换了β-葡糖醛酸糖苷酶编码区域和胭脂碱合成酶终止子，(Jefferson等人。EMBO杂志 6，3901，1987)。
此构件的获得是通过PCR，采用植物表达载体pRT101的XhoI和SstI位点之间的引物P1和P2在899bp CAH(位置在Maier-Greiner等人发表的序列的235-1197。(1991)美国国家科学院学报，88：4260-4264)的cDNA片段5′末端加入一个XhoI位点，在其3′末端加入一个SstI位点，
P1：5′ACCGAGCTCGAATTCGGCACGAGGTTGACATGATACTTC
CTG3′和
P2：5′GACCTCGAGAATTCGGCACGAGGTACGATCTACTTCCTA
GC3′，
这两个位点都属于***到pRT101的35S启动子和35S终止信号之间的多接头(Topfer等人，1987，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，15：5890)。
然后用PstI剪切嵌合基因，用T4DNA聚合酶使凸出的末端削平，平端克隆此片段到pBIN19的SmaI位点(Bevan，M.，核酸研究， 12：8711-8721，1984)。
在pMOG1156构件中，一个附加的β-葡糖醛酸糖苷酶基因有效地与35S启动子和35S终止子连接，以Xhol/SalI片段***到pMOG874的SalI位点中。
除了新的CAH选择性标记，两构件都含有传统的、连接到如其在pBIN19中一样的胭脂碱合成酶启动子和胭脂碱终止子上的NPTII选择性标记。
b.用于转化单子叶植物的构件
以与构件pMOG874相同的方法将表达盒克隆到高拷贝载体(pRT101，Topfer.，R.等人，核酸研究，15，5890，1987)中，结果见pMOG873(图8)。
通过在pMOG22的多接头的EcoRI与SmaI位点之间引入一个KpnI限制位点，制备一个pMOG22的衍生物(图3，1990年1月29日保藏于真菌菌种保藏中心，荷兰，保藏号CBS 101.90)。此多接头的方向也是反的。这个质粒，被命名为pMOG1005，在左右T-DNA边界之间含有一个潮霉素抗性基因(图4)。1.7Kb表达盒包含35S启动子和35S终止子控制下的cah基因，在HindIII与BamHI限制位点之间克隆该表达盒。这个质粒被命名为pMOG1278(图5)。二元载体pMOG1259(图6)是pMOG1278的衍生物，在SalI限制位点含有GUS表达盒，如在Vancanneyt，G等人(分子普通遗传， 220，245-250)中描述。
不同于pMOG18的制备(Sijmos，P.C.等人，生物技术。 8，217-221，1990)，pMOG1253在作为EcoRI-HindIII片段的一个表达盒中含有双重增强的35S启动子、ALMV RNA4先导序列、GUS基因和nos终止子。用SnaBI和MscI消化质粒p35 GUS INT(Vancanneyt，1990)。分离所得的含有GUS基因和ST-LSl内含子编码区的部分的426bp片段，并克隆到用SnaBI和MscI线性化的pMOG18中。从所得的质粒中分离3189bp的EcoRI-HindIII片段并克隆到pMOG22，产生pMOG1253(图7)。
通过将来自pMOG22的潮霉素表达盒克隆到高拷贝载体pMOG18的HindIII位点来制备pMOG617(图9)。
实施例2
马铃薯的转化
下面描述的是用于利用根癌土壤杆菌转化马铃薯(Solanamtubarosom cv.Kardal)茎段的方法。采用转接3-8周后离体培养的马铃薯植物茎节的外植体。在24℃16小时的光照周期(1700lux)和21℃8小时的暗周期下将该植物培养在多重培养基(MUM)上(各种培养基的成分可以在表2中找到)。切大约5mm的茎段到用洗涤培养基(WAM)浸泡过的无菌滤纸上，收集于装有洗涤培养基的烧瓶中。达到大约300个外植体时，用前培养培养基(PRM)代替洗涤培养基。在与上面描述相同的条件下于80转/分钟培养烧瓶大约24小时。所有用于本研究中的二元载体都含有作为植物选择性标记的nptII基因和作为细菌选择性标记的nptII。质粒pMOG410额外地携带了含有一个内含子的嵌合gus基因(Vancanneyt等人。分子普通遗传，220，245-250，1990)。质粒pMOG11560额外地携带了gus基因和编码氨基氰水合酶的嵌合cah基因。质粒pMOG874额外地携带了cah基因。在卡那霉素的选择下这些质粒保持在大肠杆菌(E.coli)和根癌土壤杆菌中。
用在本研究的土壤杆菌菌株在C58染色体背景上携带一个利福平选择性标记。该辅助菌株EHA105的构建描述于Hood等人(1993)，转基因研究2，208-218。
土壤杆菌在含有抗生素(20mg/l利福平，100mg/l卡那霉素)LB培养基中培养过夜。用无抗生素的LB将过夜培养物稀释到OD600＝0.1，培养大约2小时的时间后至OD600＝0.3。室温下于1600xg离心细菌悬浮液15分钟。用洗涤培养基再悬浮细菌，用于共培养实验。从烧瓶除去前培养基培养基，用土壤杆菌悬浮液替换。烧瓶培养20分钟，之后用洗涤培养基漂洗外植体两次。外植体在无菌滤纸上干燥，并在含有共培养培养基(COM)的平板上培养48小时。然后，将外植体转接到后培养培养基(POM)并培养72小时。然后将外植体转接到含有几种浓度的氨基氰或卡那霉素的芽诱导培养基上(SIM)。两周后在同样的培养基上传代培养外植体，大约三周后将外植体置于如上所述的含有氨基氰或卡那霉素的幼芽延长培养基(SEM)上。当幼芽大到足以切下时，将它们转接到根诱导培养基上(RIM)。然后将能够生根的幼芽转接到含有50mg/l氨基氰或30mg/l卡那霉素的根诱导培养基上。同时通过应用组织化学GUS分析测试生根幼芽之小叶是否表达了gus基因，确定幼芽的转基因性质。显然对于pMOG1156，转基因幼芽在含氨基氰的培养基上生根完全与gus基因的表达相关。
表1马铃薯茎段的转化频率
pMOG1156(cah-gus-nptII)
再生期间的选择(mg/l)  接种的外植体数量  切下的幼芽数量  生根的幼芽数量  Gus阳性幼芽的数量
氨基氰40  48  15  2  2
氨基氰30  48  50  12  12
氨基氰20  48  56  6  6
卡那霉素50  48  26  16  16
PMOG410(gus-nptII)
再生期间的选择(mg/l)  接种的外植体数量  切下的幼芽数量  生根的幼芽数量  Gus阳性幼芽的数量
氨基氰40  62  0  0  0
氨基氰30  62  10  0  0
氨基氰20  62  48  0  0
卡那霉素50  58  24  13  12
PMOG874(cah-nptII)
再生期间的选择(mg/l)  接种的外植体数量  切下的幼芽数量  生根的幼芽数量  Gus阳性幼芽的数量
氨基氰40  58  10  1  n.d.
氨基氰30  58  40  8  n.d.
氨基氰20  58  81  2  n.d.
卡那霉素50  58  34  26  n.d.
n.d.：未测定。
表2各种培养基的组成
培养基： WAM PRM COM POM SIM SEM RIM MUM
MS粗盐 1×MS 1×MS 1×MS 1×MS 1×MS 1×MS 1/2×MS 1/2×MS
维生素 B5 B5 B5 B5 B5 B5 1/2R3 1/2R3
蔗糖 3％ 3％ 3％ 3％ 3％ 3％ 1％ 1％
琼脂 0.8％ 0.8％ 0.8％ 0.8％ 0.8％ 0.8％ 0.8％
MES(克/l) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
pH 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8
玉米素核(mg/l) - 0.5 0.5 3.0 3.0 0.3 - -
2，4-D - 1.0 1.0 - - - - -
吲哚丁酸(IBA) - - - - - - 0.1 -
头孢氨噻 - - - 200 200 200 100 -
万古霉素 - - - 100 100 100 50 -
MS：Murashige和Skoog，生理学〔Physiol.) 15，473-479，1962
B5：Gamborg B5，Gamborg，Orl等人，实验细胞研究(Exp.CellRes.)， 50，151-158，1986
实施例3
番茄的转化
下面描述的是适用于应用根癌土壤杆菌转化番茄(Lycopersiconesculentum cv.Money Maker)的子叶的方法。用于这种转化方法的二元载体和土壤杆菌菌株与上面所描述的一致。在24℃16小时光照周期(1700lux)和21℃8小时暗周期下番茄幼苗在萌发培养基(GEM)上萌发(各种培养基的成分可在表4中找到)。将5-7日龄幼苗的子叶外植体切下，置于浸泡过洗涤培养基(WAM)的无菌滤纸上，并置于含有共培养培养基(COM)的平板上。每平板上大约含有50个外植体，在与上面所述相同的条件下培养过夜。
仔细地将预接种的外植体在土壤杆菌接种液中浸没20分钟。
在无菌滤纸上将预接种的外植体吸干并在第二套共培养平板上培养48小时。处理中，在含有后培养培养基(POM)的平板上将外植体培养72小时，之后将外植体转移到含有几种浓度的氨基氰或卡那霉素的芽诱导培养基(SIM)上。外植体每3周在同样的培养基上传代培养一次。大约8-12周后，将幼芽切下并置于根诱导培养基(RIM)上。然后将能生根的幼芽转移到含有50mg/l氨基氰或30mg/l卡那霉素的根诱导培养基上。与此同时，用组织化学GUS分析测试生根的幼芽之小叶是否表达了gus基因。
表3番茄子叶外植体的转化结果
pMOG1156(guS-nptII-cah)
再生期间的选择(mg/l)  接种的外植体数量  切下的幼芽数量  生根的幼芽数量  gus阳性幼芽的数量
氨基氰40  30  5  3  3
氨基氰30  30  5  0  0
氨基氰20  30  0  0  0
卡那霉素100  30  5  3  4
pMOG410(gus-nptII)
再生期间的选择(mg/l)  接种的外植体数量  切下的幼芽数量  生根的幼芽数量  Gus阳性幼芽的数量
氨基氰40  30  0  0  0
氨基氰30  30  3  0  0
氨基氰20  30  0  0  0
卡那霉素100  30  4  3  3
pMOG874(cah-nptII)
再生期间的选择(mg/l)  接种的外植体数量  切下的幼芽数量  生根的幼芽数量  Gus阳性幼芽的数量
氨基氰40  35  1  1  n.d.
氨基氰30  35  0  0  n.d.
氨基氰20  35  2  0  n.d.
卡那霉素100  35  4  1  n.d.
n.d.：未测定。
表4各种培养基的组成
培养基： WAM COM POM SIM RIM GEM
MS粗盐 1× 1× 1× 1× 1× 1/2×
维生素 B5 B5 B5 B5 B5 B5
蔗糖 3％ 3％ 3％ - 1％ 1％
葡萄糖 - - - 1％ - -
琼脂 - 0.8％ 0.8％ 0.8％ 0.8％ 0.8％
MES(克/l) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
pH 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8
玉米素核苷(mg/l) - 2.0 2.0 2.0 - -
吲哚乙酸(IAA) - 0.1 0.1 0.1 - -
2，4-D - 0.05 - - - -
吲哚丁酸(IBA) - - - - 0.25 -
羧苄青霉素 - - - 500 -
头孢氨噻 - - 200 - 200 -
万古霉素 - - 50 - - -
Acetosyringone(mM) - 0.2 - - - -
实施例4
拟南芥的转化
下面描述的是适用于应用根癌土壤杆菌转化拟南芥(Arabidopsisthaliana cv.C24)根段的方法。用于这种转化方法的二元载体与上面所描述的一致。
在80转/分、24℃的16小时光照周期(1700lux)和21℃的8小时暗周期下，6mg拟南芥种子在含有液体萌发培养基(GM)的烧瓶中萌发(各种培养基的成分可在表4中找到)。在无菌培养皿中分离9日龄幼苗的根，并收集到萌发培养基(GM)的液滴中。将根切成大约3-5mm的段，将大约100个外植体均匀地展布在一个尼龙膜(O8cm)上，将膜置于含有愈伤组织诱导培养基(CIM)的平板上。在上面所述相同的条件下将平板培养3天。
用于本研究的土壤杆菌菌株在C58染色体背景中携带一个利福平选择性标记。辅助菌株MOG101的构建描述于Hood等人(1993)。土壤杆菌在含有抗生素(利福平20mg/l、卡那霉素100mg/l)的LB培养基中培养过夜。过夜培养物用无抗生素LB培养基1∶10稀释并培养大约3小时。细菌悬浮液室温下于1600xg离心15分钟。将细菌重新悬浮于GM中并调整到OD600＝0.1，用于共培养。
含有大约100个外植体的膜与土壤杆菌悬浮液培养2分钟，在无菌滤纸上干燥以去除多余的细菌。将附着外植体的膜在CIM平板上培养48小时。用液体GM漂洗膜和外植体后，将它们置于含有几种浓度的氨基氰或卡那霉素的芽诱导培养基(SIM)的平板上培养。5天后转移附着外植体的膜到相同的培养基(SIM)上传代培养。2周后进行第二次传代培养。大约共培养4周后，每个氨基氰浓度切下60株幼芽，置于含有30mg/l氨基氰的芽延长培养基(SEM)的平板上。依据它们转基因的特征，将能够生根的幼芽通过应用组织化学GUS分析测试小叶和花是否表达了gus基因。
进行三种实验。将由实验98-8和98-11获得的幼芽转移到含有30mg/1氨基氰的生根培养基(SEM)上。将实验98-13获得的幼芽转移到含有与选择培养基(SIM)相同浓度的生根培养基(SEM)上，结果见表4a。将从卡那霉素选择(50mg/l)获得的幼芽转移到含25mg/l卡那霉素的生根培养基上。
表4拟南芥根转化必须培养基
培养基成分 培养基 GM  CIM SIM  SEM
成分 大量元素 B5  B5 B5  MS
微量元素 B5  B5 B5  MS
维生素 B5  B5 B5  B5
蔗糖(g/l)  10
葡萄糖(g/l) 20  20 20
Daichin琼脂(g/l)  10 10  10
激素 2，4-D  0.5
激动素  0.05
2-ip 5
吲哚乙酸(IAA) 0.15
抗生素 万古霉素 100  50
羧苄青霉素 500
头孢氨噻  100
用pMOG410转化的根外植体不能在含氨基氰的培养基上再生。甚至20mg/l的氨基氰已足以阻止用缺失cah基因的构件转化的外植体再生。在20-40mg/l氨基氰下，观察到一些愈伤组织发育，但在50mg/l及更高浓度时，外植体不能生存并完全变为褐色。
另一方面，用cah基因(pMOG1156)转化的外植体可以在所有氨基氰浓度下再生，甚至在80mg/l。在低浓度下，幼芽的再生比用卡那霉素的快。
虽然可获得更多的幼芽，但每种处理仅收获60-65个幼芽，置于生根培养基上。在较低的氨基氰浓度下，发育出与用卡那霉素选择时同样数量的幼芽(大约每个培养皿中70-100个)。
在用氨基氰选择的时候，在愈伤组织发育和GUS表达与用pMOG1156(图4b)转化的根外植体之间存在明显的相关。氨基氰0mg/l(NS)下获得的幼芽的GUS分析显示没有染色，表明要获得转基因幼芽，氨基氰是必需的。
表4a.用pMOG1156转化拟南芥的结果
 实验98-8  实验98-11  实验98-13
 氨基氰的浓度(mg/l)  植株数量1  生根的幼芽百分率2  植株数量  生根的幼芽百分率  植株数量  生根的幼芽百分率
 C20  0  0  1  1.7  3  4.8
 C30  4  6.3  2  3.2  9  14.5
 C40  5  8.2  3  4.5  1  1.6
 C50  nd  nd  5  8.1  0  0
 C60  5  8.2  nd  nd  4  6.0
 C80  9  13.8  10  15.6  8  11.4
 K50  29  46.8  19  47.5  14  20.6
(1)：植株总数为发育成植株并能够在含氨基氰培养基上生根的幼芽的总量。
(2)：生根的幼芽百分率＝植株的数量÷出芽植株的总数量×100％
(3)：染成蓝色的植株相对于植株数量的百分率
表4b.通过氨基氰或卡那霉素选择获得表达GUS拟南芥植株的百分率
 pMOG410  pMOG1156
 处理  C3305  C305  与处理相同的浓度5
 C20  nd  01  0
 C30  nd  75-100  78
 C40  nd  40-100  100
 C50  nd  80  nd.
 C60  nd  80  100
 C80  nd  67-90  100
 K450  1002  82-92  100
(1)：染蓝植株的百分率
(2)：所有pMOG410的幼芽在卡那霉素25mg/l上生根
(3)C＝氨基氰(mg/l)
(4)K＝卡那霉素(mg/l)
(5)生根培养基中的浓度
实施例5
水稻的转化
下面描述的是适用于应用根癌土壤杆菌菌株LBA1119-pMOG1295(携带cah基因)和菌株LBA1119-pMOG1253(对照)转化来源于水稻(Oryza sativa cv.Taipei 309)成熟胚盾片的方法。在28℃黑暗处，将无菌去壳的水稻种子在装有愈伤组织诱导培养基(CIM)的平板上萌发(各种培养基的成分可在表5中找到)。3周后，分离来源于盾片的胚发生愈伤组织，并在同样的条件下在同样的培养基上传代培养。2-3周后，将胚发生愈伤组织切成大约2-3mm的段，在含有CIM的平板中培养4天。用于本研究的土壤杆菌菌株在C58染色体背景中携带一个利福平选择性标记。辅助菌株EHA105的构建参见Hood等人所述(1993)。土壤杆菌在含有抗生素(利福平20mg/l、卡那霉素100mg/l)的AB培养基中培养4天。将土壤杆菌收集到LIM中并将OD600调整到1.0-1.5。此悬浮液用于共培养。将愈伤组织与土壤杆菌悬浮液培养10分钟，在无菌滤纸上干燥以去除多余的细菌。在25℃黑暗处，将愈伤组织在共培养培养基(COM)上培养48小时。每个氨基氰浓度培养50个pMOG1259愈伤组织和20个pMOG1253愈伤组织。采用下面浓度的氨基氰：0、15、30、60、100、150、200、300和500mg/l。潮霉素采用50mg/l的浓度。在28℃黑暗处，将愈伤组织培养于含有几种浓度的氨基氰或潮霉素的初次选择培养基(FSM)平板中。3周后，将愈伤组织转移到含相同浓度氨基氰或潮霉素的胚诱导培养基I(EIMI)上。再过3周，在含相同浓度氨基氰或浓度增加的潮霉素(75mg/l)的胚诱导培养基II(EIMII)上传代培养愈伤组织。将愈伤组织转移到含有与FSM、EIMI、EIMII期间相同浓度的氨基氰的芽诱导培养基(SIM)上，并在28℃12小时光照周期(2600LUX)和12小时暗周期下培养。大约在愈伤组织转移到SIM上3周后，幼芽再生，切下并置于含前温室培养基(PGM)的广口瓶中。在100mg/l或更高的氨基氰浓度下没有愈伤组织形成。在15mg/l的氨基氰下，源于两种构件的愈伤组织再生频率相同(pMOG1253为16个愈伤组织中7个、pMOG1295为44个中17个可以再生)。在30mg/l的氨基氰下，仅11个pMOG1295的愈伤组织显示出绿色的愈伤组织发育，6个能够再生。
表5.水稻(Oryza Sativa Taipei 309)转化必需培养基
培养基成分 培养基 CIM COM LIM FSM EIMI  EIMII  SIM  PGM
成分(g/l) 大量元素 N6 R2 R2 R2 LS  LS  LS  1/2MS
微量元素 B5 R2 R2 R2 LS  LS  LS  1/2MS
维生素 B5 R2 R2 R2 LS  LS  LS  1/2B5
蔗糖 30 30 30  30  40  10
葡萄糖 10 10  20
琼脂糖I型 7 7 7  7  7
phytagel 2.5  2.5
pH 5.8 5.2 5.2 6.0 5.8  5.8  5.8  5.8
激素(mg/l) 2，4-D 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5  2.5
吲哚乙酸(IAA)  0.5
BAP  0.3
NAA  0.05
添加剂 脯氨酸(mg/l) 500
谷氨酰胺(mg/l) 500
酪蛋白的酶解产物(mg/l) 300
Acetosyringone(μM)cocosnutwater(ml) 100 100 100 100
抗生素(mg/l) 万古霉素 100 100  100  100
头孢氨噻 400 100  100  100
实施例6
通过微粒枪转化水稻
下面描述的是适用于应用微粒流入枪(PIG)转化水稻(Oryza sativacv.IR52)的非形态发生细胞悬浮液的方法，参照Finer等人的方法(植物细胞报道，11，323-328，1992)。
水稻的非形态发生细胞的长期悬浮培养物，在液体LS-4(Linsmaier和Skoog，生理学植物，18，100-127，1962)培养基每周的间隔传代培养一次，并在28℃下黑暗处培养于摇床(110转/分)上。(LS-培养基的成分见表6)。最后一次传代培养3-4天后，将1.5ml此细胞悬浮液(大约1.5×106个细胞)均匀地涂布在滤纸上(Whatman 4号)，接着置于固化的LS-4培养基上在28℃黑暗处培养24小时，此后直接用于轰击。对于微粒子轰击采用自制的微粒流入枪〔PIG)，参照Finer等人的方法(1992)。将用pMOG617(35S-gus和35S-hyg)或pMOG873(35S-cah)  包被的300μg钨微粒装到微粒支持物上。通过2.5巴的氦气脉冲加速微粒且必须穿过一个500μm的、置于微粒支持物下2cm处的金属停止屏。悬浮细胞置于微粒支持物下15cm处。轰击前将PIG抽真空到30毫巴。轰击后将细胞在28℃下黑暗处培养3天。然后将携带细胞的滤纸转移到含不同浓度氨基氰或50mg/l潮霉素B的固体LS-4培养基上(见表6)。传代培养每9天重复一次。4-6周后，将可见的抗性微愈伤组织转移到新鲜的含各自选择性试剂的LS-4培养基上。从两实验中，发现用pMOG617转化的外植体中7+41个对潮霉素有抗性，而对于用pMOG873的转化，在第一个实验中，在20mg/l的氨基氰下存活7个外植体(第二个实验的结果还未得到)，0+4个外植体在40mg/l的氨基氰下保持存活。在50mg/l或更高的浓度下，没有外植体形成。通过测试正在发育的愈伤组织部分是否存在用pMOG873转化的愈伤组织的DNA，证实转基因的性质。在40mg/l的氨基氰下，4个存活的外植体中有1个在对cah基因的PCR实验中呈现阳性。
表6水稻转化必需的培养基
液态LS-4  固态LS-4
大量元素 LS  LS
微量元素 LS  LS
维生素 LS  LS
蔗糖(g/l) 30  30
琼脂糖I型(g/l) -  7
pH 5.8  5.8
2，4-D(mg/l) 4  4
表7 pMOG617
选择性试剂(mg/l)  平板的数量 抗性克隆 gus阳性
氨基氰20  4
氨基氰30  2
氨基氰40  4
氨基氰50  2
氨基氰60  2
氨基氰70  2
氨基氰80  2
潮霉素50  8
pMOG873
选择性试剂(mg/l)  平板数量 抗性克隆 PCR阳性
氨基氰0  4
氨基氰20  6
氨基氰30  8
氨基氰40  8
氨基氰50  7
氨基氰60  4
氨基氰70  4
氨基氰80  2
潮霉素50  4
实施例7
玉米致死曲线
用水制备10和100mg/l的氨基氰贮存溶液，过滤除菌。将等份的贮存溶液于-20℃下贮存。通过将MS培养基(4.4g)、蔗糖(20g)、2-4D(2.0mg)和琼脂(8g)加入到1升水中制备培养基。高压蒸汽灭菌后，加入适量的氨基氰(0、10、30、50、100、150mg/l氨基氰)将培养基倒入9cm的培养皿中。按照上面培养基减去琼脂制备BMS液。
通过三种方法，将BMS细胞加到含氨基氰的培养基上：
a.将BMS细胞悬浮液加到falcon试管中并除去液体。然后将BMS细胞以大约5mm直径的块排列在琼脂表面，每个平板上5块，每个浓度3个平板，同时在每个培养皿的底上标记每块的轮廓；
b.将大约0.5ml包装的细胞体积和1.5ml BMS液加到琼脂表面，将细胞精细地涂在琼脂表面。每种处理设三个平板。
c.大约0.5ml包装的细胞体积和1.5ml BMS液加到置于琼脂表面的滤纸上。细胞均匀地涂在滤纸表面，每种处理设一个平板。
用微孔带密封平板并在25℃下黑暗中培养。7天和14天后观察细胞的生长。
结果
第8天
8天后评价BMS细胞在氨基氰上的生长。
排列在对照培养基表面的BMS细胞块体积增加，并生长超出了它们的起始轮廓。在10mg/l氨基氰上的细胞没有生长超出它们的起始轮廓，但细胞块的高度增加，形成一个不均匀的表面。随氨基氰浓度的增加，可见生长轻微的减少，在50mg/l氨基氰下观察到对生长的影响最大。
涂布在对照培养基表面的细胞生长良好，并致密地覆盖了培养基表面。在最低水平的氨基氰(10mg/l)下观察到生长显著减少，不过，明显可见到细胞密度增加。在30mg/l的氨基氰下，可见在细胞密度上的轻微增加，但在较高的浓度下难以区分不同的生长速率。
在所有浓度的氨基氰下生长的细胞保持牛奶样白色，未见细胞变成褐色。
第15天(表9)
在氨基氰下15天后，在10mg/l下BMS细胞生长减少仍然很明显，不过，排列在块中的细胞已经生长超出它们的起始轮廓。直接涂在琼脂表面的细胞呈现出与排列在块中的细胞相似的反应，即在30mg/l以上观察到生长明减小。在50mg/l以上未呈现生长迹象，同时块的表面保持很平，但细胞颜色仍是乳白色的。对于涂到滤纸上的细胞观察到相似的反应。不过，在所有滤纸的表面，可以观察到升高的小瘤块，但是其不能进一步发育成菌落，并明显地含有由BMS悬浮液中普通大小的混合细胞群体形成的较大的细胞集聚体。
取各水平氨基氰下的细胞块作为样品用于光学显微镜下观察。随氨基氰水平的增加，死亡细胞数量增加，死亡细胞的细胞内含物收缩，与细胞壁分离，而且暗色体内的淀粉粒数量增加。将细胞重新悬浮于水中，用FDA染色在紫外光下观察。
表9
氨基氰水平(mg/l) 观察结果
0 正常的健康细胞偶然夹杂死亡细胞。
10 胁迫症状。零星的死亡细胞块散布于健康细胞之间。大约5％死亡。
30 显著地不同于对照细胞。淀粉粒积累。死亡细胞的细胞内含物收缩与细胞壁分离。大约15-20％死亡。
50 十分不同于浓度为30mg/l氨基氰的情况。死亡细胞的数量和淀粉粒的积累增加。大约50％死亡。
100 大部分细胞死亡。微小的、透明的球形物体可能是累积在细胞中的小油滴。细胞体积变小。大约90％死亡。
150 大部分细胞死亡。由于淀粉粒和苯酚的积累，细胞显得颜色较深。在死亡细胞团中可见到零星的活细胞。大约95-98％死亡。
用0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100mg/l浓度的氨基氰重复实验。结果与上述实验相似，即对于聚集成块状的细胞，在10mg/l下可见到生长略有减少。氨基氰20mg/l的浓度下，细胞块生长未超过其起始轮廓，但是在较低的浓度(＜50mg/l)下，细胞块呈现高度上的增加〔随浓度增高减小〕。高于50mg/l，细胞块呈现出轻微的浅橙色。
将细胞涂布于琼脂或滤纸表面上的结果是相似的，其中10mg/l的浓度下呈现轻微的生长〔大约起始细胞数量的二倍〕，而在20mg/l和更高的浓度下，呈现生长抑制现象。
实施例8
香蕉〔Musa)中的致死曲线
为了检验氨基氰作为用于香蕉转化的选择性标记的潜力，用Grandnain的6日龄可再生的胚发生悬浮液建立两个致死曲线。6日龄胚发生的悬浮液(Ed6b)培养物，常规地浸没在含有4.32g/lMS盐、45g/l蔗糖、标准1倍浓度MS维生素、100mg/l谷氨酰胺、100mg/l醇、100mg/l生物素、100mg/l麦芽提取物的M2 2，4-D液中(pH5.3)，高压蒸汽灭菌后加入1.2mg/l 2，4-D和0.8mg/l毒莠定。
将培养物过滤(＞250μ，＜710μ)，将大约50μl等份过滤培养物以300μl液体体积用移液管加到两个致死曲线培养基上，如下面详述〔每平板三个重复〕。在其后的三周内监控培养物的生长和存活，21天后通过FDA染色评价细胞的存活。
致死曲线培养基A：M2/MS/1.0 2，4-D(除了只有1.0mg/l 2，4-D、无毒莠定和增加了2.25g/l gelrite外，与M2/MS/2，4-D一致)：此培养基促进胚发生愈伤组织而不是胚的快速***和生长。
致死曲线培养基B：M2/SH/0.5Pic、0.5 2，4-D(除了只有0.5mg/l 2，4-D和0.5mg/l毒莠定、SH盐(4.32g/l)代替了MS、增加了2.25g/l gelrite外，与M2/MS/2，4-D一致)：此培养基促进胚的早期发育，该胚通过转移到另外的培养基可以成熟并萌发。
高压蒸汽灭菌后，将氨基氰加到两类型培养基上达到0、20、30、50、75、100、150mg/l的浓度。
结果描述于表10，其中关于细胞生长的数据是大致的肉眼观察估计值，不是愈伤组织体积的精确测量值。在浓度大于75mg/l之前，培养物没有显著的肉眼可见的变黑和苯酚的释放。一般地培养物只是停止生长，伴随细胞***被广泛地抑制。甚至在20mg/l的低浓度下，氨基氰抑制胚发生愈伤组织生长的40-50％，而没有导致显著的肉眼可见的破坏。在此处测试的最低浓度下，胚发生完全得到抑制。
表10氨基氰浓度对香蕉细胞培养的结果
培养基  氨基氰浓度  FDA估计的活细胞百分数 胚形成(平均)  愈伤组织生长百分数
M2/MS/2，4-D  0  95％ N/A  +100％
M2/MS/2，4-D  20  60％ N/A  +30％
M2/MS/2，4-D  30  50％ N/A  +20％
M2/MS/2，4-D  50  20％ N/A  0
M2/MS/2，4-D  75  10％ N/A  0
M2/MS/2，4-D  100  10％ N/A  0
M2/MS/2，4-D  150  0 N/A  0
M2/SH/0.5Pic+0.5 2，4-D  0  95％ 51  N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2，4-D  20  50％ 0  N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2，4-D  30  40％ 0  N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2，4-D  50  30％ 0  N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2，4-D  75  20％ 0  N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2，4-D  100  10％ 0  N/A
M2/SH/0.5Pic+0.5 2，4-D  150  0 0  N/A
                            序列表(1)一般信息：(i)申请人：
(A)姓名：MOGEN International nv
(B)街道：Einsteinweg 97
(C)城市：Leiden
(E)国家：荷兰
(F)邮政编码：2333CB
(G)电话：31-(0)71-5258282
(H)传真：31-(0)71-5221471(ii)发明名称：选择性标记(iii)序列数目：4(v)计算机可读形式；
(A)介质类型：磁盘
(B)计算机：IBM兼容机
(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatnetIn Release#1.0 Version#1.25(EPO)(2)SEQ.ID.NO.1的信息：(i)序列特征；
(A)长度：900个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型；cDNA(iii)假拟；非(iii)反义；否(vi)初始来源；
(A)生物；疣孢漆斑菌(ix)特征；
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：47..782(xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述；GTACGATCCT ACTTCCTCGC TTATCTGCTC TAAACGATTC AACAAG  ATG TCT TCT55
                                                Met Ser Ser
                                                 1TCA GAA GTC AAA GCC AAC GGA TGG ACT GCC GTT CCA GTC AGC GCA AAG103Ser Glu Val Lys Ala Asn Gly Trp Thr Ala Val Pro Val Ser Ala Lys
  5                  10                  15GCC ATT GTT GAC TCC CTG GGA AAG CTT GGT GAT GTC TCC TCA TAT TCT151Ala Ile Val Asp Ser Leu Gly Lys Leu Gly Asp Val Ser Ser Tyr Ser20                  25                  30                  35GTG GAA GAT ATC GCG TTC CCT GCG GCA GAC AAA CTT GTT GCC GAG GCA199Val Glu Asp Ile Ala Phe Pro Ala Ala Asp Lys Leu Val Ala Glu Ala
             40                  45                  50CAG GCC TTT GTG AAG GCC CGA TTG AGT CCC GAA ACC TAC AAT CAC TCC247Gln Ala Phe Val Lys Ala Arg Leu Ser Pro Glu Thr Tyr Asn His Ser
         55                  60                  65ATG CGC GTT TTC TAC TGG GGA ACC GTC ATC GCG AGA CGT TTA CTT CCC295Met Arg Val Phe Tyr Trp Gly Thr Val Ile Ala Arg Arg Leu Leu Pro
     70                  75                  80GAG CAA GCT AAA GAC TTG TCT CCA AGT ACA TGG GCA CTG ACA TGT CTT343Glu Gln Ala Lys Asp Leu Ser Pro Ser Thr Trp Ala Leu Thr Cys Leu
 85                  90                  95CTG CAT GAC GTT GGT ACT GCG GAG GCA TAC TTT ACA TCT ACA CGA ATG391Leu His Asp Val Gly Thr Ala Glu Ala Tyr Phe Thr Ser Thr Arg Met100                 105                 110                 115TCC TTC GAT ATT TAC GGT GGC ATT AAG GCT ATG GAG GTG CTC AAG GTC439Ser Phe Asp Ile Tyr Gly Gly Ile Lys Ala Met Glu Val Leu Lys Val
            120                 125                 130CTT GGG AGT AGC ACC GAC CAG GCT GAG GCT GTT GCC GAG GCC ATC ATT487Leu Gly Ser Ser Thr Asp Gln Ala Glu Ala Val Ala Glu Ala Ile Ile
        135                 140                 145CGT CAT GAG GAT GTG GGG GTA GAT GGC AAC ATC ACA TTC CTC GGT CAG535Arg His Glu Asp Val Gly Val Asp Gly Asn Ile Thr Phe Leu Gly Gln
    150                 155                 160TTG ATC CAG CTG GCT ACG CTT TAT GAC AAT GTC GGG GCC TAC GAT GGG583Leu Ile Gln Leu Ala Thr Leu Tyr Asp Asn Val Gly Ala Tyr Asp Gly
165                 170                 175ATT GAT GAT TTT GGT AGC TGG GTT GAT GAC ACC ACA CGC AAC AGT ATC631Ile Asp Asp Phe Gly Ser Trp Val Asp Asp Thr Thr Arg Asn Ser Ile180                 185                 190                 195AAC ACG GCA TTC CCA CGA CAT GGT TGG TGT TCT TGG TTT GCC TGC ACG679Asn Thr Ala Phe Pro Arg His Gly Trp Cys Ser Trp Phe Ala Cys Thr
            200                 205                 210GTT CGT AAG GAA GAA AGT AAC AAG CCT TGG TGC CAC ACA ACG CAT ATC727Val Arg Lys Glu Glu Ser Asn Lys Pro Trp Cys His Thr Thr His Ile
        215                 220                 225CCT CAG TTC GAT AAA CAG ATG GAA GCG AAC ACT TTG ATG AAG CCT TGG775Pro Gln Phe Asp Lys Gln Met Glu Ala Asn Thr Leu Met Lys Pro Trp
    230                 235                 240GAG TAA C TCTGAGTAAG CAGAGAATAT TTAGCCGGGT AGCTATAGAT GAATCTGGAC832Glu  *
245AAATTCAGGC ACATTTGGTT TCACGATACA GGTATTGGAA ATAGCTTGCA GGAAGGTATC892ATGTCAAC900(2)SEQ.ID.NO.2的信息：(i)序列特征；
(A)长度：245个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型；蛋白质(xi)SEQ.ID.NO.2的序列描述；Met Ser Ser Ser Glu Val Lys Ala Asn Gly Trp Thr Ala Val Pro Val1               5                  10                  15Ser Ala Lys Ala Ile Val Asp Ser Leu Gly Lys Leu Gly Asp Val Ser
         20                  25                  30Ser Tyr Ser Val Glu Asp Ile Ala Phe pro Ala Ala Asp Lys Leu Val
     35                  40                  45Ala Glu Ala Gln Ala Phe Val Lys Ala Arg Leu Ser Pro Glu Thr Tyr
 50                  55                  60Asn His Ser Met Arg Val phe Tyr Trp Gly Thr Val Ile Ala Arg Arg65                  70                  75                  80Leu Leu Pro Glu Gln Ala Lys Asp Leu Ser Pro Ser Thr Trp Ala Leu
             85                  90                  95Thr Cys Leu Leu His Asp Val Gly Thr Ala Glu Ala Tyr Phe Thr Ser
        100                 105                 110Thr Arg Met Ser Phe Asp Ile Tyr Gly Gly Ile Lys Ala Met Glu Val
    115                 120                 125Leu Lys Val Leu Gly Ser Ser Thr Asp Gln Ala Glu Ala Val Ala Glu
130                 135                 140Ala Ile Ile Arg His Glu Asp Val Gly Val Asp Gly Asn Ile Thr Phe145                 150                 155                 160Leu Gly Gln Leu Ile Gln Leu Ala Thr Leu Tyr Asp Asn Val Gly Ala
            165                 170                 175Tyr Asp Gly Ile Asp Asp Phe Gly Ser Trp Val Asp Asp Thr Thr Arg
        180                 185                 190Asn Ser Ile Asn Thr Ala Phe Pro Arg His Gly Trp Cys Ser Trp Phe
    195                 200                 205Ala Cys Thr Val Arg Lys Glu Glu Ser Asn Lys Pro Trp Cys His Thr
210                 215                 220Thr His Ile Pro Gln Phe Asp Lys Gln Met Glu Ala Asn Thr Leu Met225                 230                 235                 240Lys Pro Trp Glu  *
            245(2)SEQ.ID.NO.3的信息：(i)序列特征；
(A)长度：43个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型；cDNA(iii)假拟；非(xi)SEQ.ID.NO.3的序列描述；ACCGAGCTCG AATTCGGCAC GAGGTTGACA TGATACCTTC CTG43(2)SEQ.ID.NO.4的信息：(i)序列特征；
(A)长度：42个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型；cDNA(iii)假拟；非(xi)SEQ.ID.NO.4的序列描述；GACCTCGAGA ATTCGGCACG AGGTACGATC CTACTTCCTC GC
                  42

Claims (13)

1.氨基氰水合酶作为一种选择性标记的应用。
2.氨基氰水合酶作为一种选择性标记在植物转化实验中的应用。
3.权利要求2的应用，特征在于用编码氨基氰水合酶的核苷酸序列转化植物。
4.权利要求3的应用，特征在于使用如在SEQ ID NO：1中描述的核苷酸序列。
5.用于选择转化植物的方法，包括：
a.构建含有氨基氰水合酶的编码序列和目标基因的载体，其中氨基氰水合酶是选择标记，
b.转化所述载体到植物或植物部分或植物细胞，和
c.在含有氨基氰的培养基中培养所述转化体。
6.根据权利要求5的方法，特征在于采用SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
7.氨基氰用于选择由含有编码目的基因和氨基氰水合酶的核苷酸序列的载体转化的植物的应用，其中氨基氰水合酶是选择标记。
8.表达盒，其包含编码氨基氰水合酶的核苷酸序列和目标基因，其中氨基氰水合酶是选择标记。
9.包含根据权利要求8的表达盒的载体。
10.包含根据权利要求9的载体的宿主细胞。
11.根据权利要求10的宿主细胞，其特征在于宿主细胞是土壤杆菌。
12.用根据权利要求9的载体转化的植物细胞。
13.利用根据权利要求11的宿主细胞转化的植物细胞。
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