CN114657203A - 一种菠菜转基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及植物遗传转化领域，特别地涉及菠菜的遗传转化。具体而言，本发明建立了一种新的菠菜转基因方法，其可以采用农杆菌或基因枪来进行。

Description

一种菠菜转基因的方法
技术领域
本申请涉及植物遗传转化领域，特别地涉及菠菜的遗传转化。具体而言，本发明建立了一种新的菠菜转基因方法，其可以采用农杆菌或基因枪来进行。
背景技术
菠菜(Spinacia oleracea L.)是世界范围最主要的绿叶蔬菜之一，它富含许多有价值的营养和抗氧化因子和矿物质[1]，例如维生素、类胡萝卜素、类黄酮和小麦酚类物质[2]。
目前，已经有一些再生体系的成功报道。早在1996年，日本科学家Komai等使用6种基础培养基对来自8个品种的菠菜实生苗的子叶、上胚轴、根和叶片诱导愈伤，其中3个品种表现出60％的胚性愈伤诱导率。1997年，Knoll等以菠菜实生苗的根尖和根中部为外植体，经过20um/L NAA和5um/L GA3共同作用诱导产生愈伤，进而分化成整株菠菜苗[3]。1999年报道了世界上第一例农杆菌介导的转基因菠菜，之后的研究人们更多的专注于提高菠菜再生和转化的效率。首先，科学家们尝试了利用菠菜的不同部位作为外植体诱导愈伤而获得转基因植株。1999年，Zhang等将菠菜子叶侵染之后，通过1mg/L 6BA+0.4mg/L NAA诱导获得了抗卡那霉素的转基因植株，Southern检测证明了目的基因整合到染色体上[4]。2009年，日本科学家利用菠菜叶片侵染含外源基因Cry1AC的农杆菌后，诱导愈伤组织分化成苗，获得抗卡那霉素的转基因植株，经过T1代验证证明外源DNA成功地整合到菠菜染色体[1]，并证明由根尖诱导的愈伤获得较高的转化率。该转化***利用PPT作为筛选剂，产生具有GFP表达的芽的愈伤比率为24±6％，转化周期超过了6个月[5]。无论使用何种外植体，至今所有报道的菠菜转基因成功的例子均通过胚性愈伤途径获得转基因植株[1,2,4,5]。
但是，通过胚性愈伤途径获得转基因植株，其缺点是培养周期长，基因型依赖性大，易产生畸形再生苗。为解决现有技术的缺点，本发明使用含有分生组织的菠菜外植体，通过多芽途径获得再生苗。该方法操作简单，培养周期较短，受基因型限制小，再生苗表型正常等多个优点。
发明内容
本发明通过使用具有分生能力的菠菜外植体创建了两种菠菜转化体系(其可采用农杆菌介导的转化和基因枪转化)。(1)使用成熟种子作为外植体的菠菜转化体系，在此所述外植体为含有茎尖和侧芽等分生组织细胞的所有菠菜成熟种子组织，包含一切含有具有分生能力的细胞的组织部位，不仅限于子叶节、下胚轴和子叶。(2)使用不同幼苗阶段的下胚轴作为外植体的转化方法，所述下胚轴含有所有的分生组织，包括顶端和所有的侧生分生组织。所述外植体为包含分生细胞的所有菠菜幼苗组织。
在本发明中，将外源DNA导入植物细胞，所述转化技术包括但不限于农杆菌介导的转化、基因枪转化、PEG介导的DNA直接摄入原生质体、电穿孔、细胞穿透肽或晶须硅等。
在本发明中，对于农杆菌介导的转化，可以使用不同的农杆菌物种，包括但不限于根癌农杆菌和发根农杆菌。适合的根癌农杆菌菌株包括所有可侵染植物细胞的菌株，例如EHA101、LBA4404、AGL1等。
在本发明中，使用含有目标基因和编码抗壮观霉素的aadA基因的重组载体转化菠菜外植体、细胞。使用壮观霉素对上述转化后的菠菜外植体、细胞、芽组织进行筛选培养，以aadA基因作为选择标记。具体地，将壮观霉素添加在芽诱导、伸长和生根培养基中以选择未被杀死和/或未被抑制的菠菜细胞、芽组织。具体地，壮观霉素在芽诱导培养基中的浓度为25-100mg/L。优选地，外植体在含有25mg/L壮观霉素的芽诱导培养基上培养4-7天后，将外植体转移到含有75mg/L壮观霉素的芽诱导培养基上。具体地，壮观霉素在芽伸长培养基中的浓度为35mg/L。具体地，壮观霉素在生根培养基中的浓度为15mg/L。
在本发明中，使用植物生长调节剂刺激菠菜细胞增殖、分化和再生。具体地，所述植物生长调节剂为0.05mg至1mg/L的噻二唑苯基脲(以下简称TDZ)，或者其与任何一种细胞***素(例如苄氨基嘌呤(以下简称6-BA)，0.2mg/L至1mg/L)或生长素的组合。具体地，所述预处理培养基还包括乙酰丁香酮(以下简称AS)。
在本发明中，在菠菜再生和农杆菌转化过程(包括幼芽的发育、幼芽的伸长以及成苗过程)中使用硝酸银，这在菠菜芽诱导、芽伸长和生根阶段促进了菠菜绿色健康苗的形成并且减少难于成活的黄化苗。
在一个方面，本发明涉及一种菠菜转基因方法，其包括将选定的包含具有分生能力的细胞的菠菜外植体进行转化，将经转化的菠菜外植体使用植物生长调节剂进行诱导以产生多芽，所产生的芽点进一步分化成菠菜芽，使所述菠菜芽伸长并长出正常的根，从而得到转化后再生的完整菠菜植株。
在另一个方面，本发明涉及一种菠菜转基因方法，其包括：1)菠菜种子消毒和萌发，获得包含具有分生能力的细胞的菠菜外植体；2)农杆菌侵染，其包括：将在步骤1)中所获得的外植体进行农杆菌浸染；3)芽诱导，其包括：将在步骤2)的侵染后的外植体转至含有植物生长调节剂的筛选培养基以进行芽诱导；4)芽伸长，其包括：将在步骤3)中诱导出的芽转入芽伸长培养基，在芽伸长培养之后转入生根培养基，并且在生根之后移栽到土壤中。
在另一个方面，本发明涉及一种菠菜转基因方法，其包括：1)菠菜种子消毒和萌发，获得包含具有分生能力的细胞的菠菜外植体；2)基因枪轰击，其包括：对在步骤1)中所获得的外植体实施基因枪轰击；3)芽诱导，其包括：将在步骤2)的基因枪轰击后的外植体转至含有植物生长调节剂的筛选培养基以进行芽诱导；4)芽伸长，其包括：将在步骤3)中诱导出的芽转入芽伸长培养基，在芽伸长培养之后转入生根培养基，并且在生根之后移栽到土壤中。在一个优选的实施方案中，在步骤3)中，将所述外植体以下述方式放在滤纸上：将外植体平摆在滤纸上，外植体之间互不接触；或者数个外植体聚拢摆放在滤纸上，堆积在一起。
在一个优选的实施方案中，所述外植体来自于萌发1至7天的菠菜种子。在一个进一步优选的实施方案中，所述外植体来自于萌发1至3天的菠菜种子。
在另一个优选的实施方案中，所述外植体是从3-10天幼苗中分离而来的包含顶端和腋芽/叶腋分生组织细胞的下胚轴。在一个进一步优选的实施方案中，所述外植体是通过下述方式分离的：去除子叶和上胚轴的连接部位的子叶与真叶，同时切除上胚轴的底部，剩余的下胚轴组织用作外植体。
在另一个优选的实施方案中，所获得的外植体通过下述方式对外植体靠近生长点部位进行创伤处理：用刀片划痕或剥离，用尖锐工具刺击，采用超声波处理。
在另一个优选的实施方案中，在进行农杆菌侵染时，实施一种或多种能够增强农杆菌侵染的操作，例如离心、抽真空和超声波。在一个进一步优选的实施方案中，所述超声波的频率为45千赫兹至28千赫兹。在一个进一步优选的实施方案中，所述超声波的处理时间为10秒至40秒。
在另一个优选的实施方案中，所述植物生长调节剂选自细胞***素、生长素和赤霉素。在一个进一步优选的实施方案中，所述细胞***素选自噻二唑苯基脲即TDZ、激动素、玉米素和6-苄氨基嘌呤即6-BA；所述生长素选自吲哚乙酸即IAA和吲哚丁酸即IBA；所述赤霉素为GA3。在一个进一步优选的实施方案中，所述植物生长调节剂添加在MS培养基中，所述植物生长调节剂为TDZ，浓度0.05-1mg/L。
在另一个优选的实施方案中，所述筛选培养基包含TDZ，其使用时间为7-42天。
在另一个优选的实施方案中，在所述筛选培养基中添加细胞***素的组合，特别地0.05-1mg/L TDZ+0.2-1mg/L 6-BA、0.05-1mg/L TDZ+0.8-1.2mg/L玉米素或者0.05-1mg/L TDZ+0.8-1.2mg/L激动素。
在另一个优选的实施方案中，向所述芽伸长培养基添加GA3、6-BA和/或IAA，或者不添加任何植物生长调节剂。
在另一个优选的实施方案中，在芽诱导、芽伸长和生根阶段，在培养基中添加硝酸银，所述硝酸银的浓度为0.1mg/L-5mg/L。在一个进一步优选的实施方案中，所述硝酸银的浓度为1mg/L。
本发明所提供的菠菜转基因方法具有以下优点。
(1)本发明使用含有分生细胞的外植体，通过植物生长调节剂的诱导直接产生多芽，继而诱导成苗。在植物细胞诱导阶段避开了产生愈伤组织，从而降低了转化对菠菜基因型的依赖，降低了染色体变异的风险。相对于已报导方法通过愈伤途径的长周期(超过6个月)，本发明的方法使得转化周期可算短至2-3个月。
(2)通过各种处理和预培养，使得外源基因更容易导入到菠菜细胞中，并优化了基因的导入方式。
(3)外植体分离方法简单，快速，不需要在显微镜下操作从而改善了在显微镜下分离外植体造成的人体工程学问题，包括双眼的疲劳。
附图说明
图1为本发明利用发芽1-3天成熟种子外植体菠菜转化方法流程图。A.菠菜种子发芽；B.多芽诱导；C.芽伸长；D.生根；E.转基因苗移栽至温室。
图2显示了菠菜成熟种子外植体和幼苗外植体转化苗的聚合酶链式反应(PCR)检测结果，被检测的转基因植株为15株。图2-1显示15株转基因植株均为阳性植株；图2-2显示样品中均没有扩增出农杆菌染色体片段。其中“M”代表DNA marker；“WT”代表非转基因植株；“+”代表阳性对照，即p24545质粒样品；“-”代表阴性对照，即水作为扩增样品；***数字代表各个转基因菠菜样品。
图3显示了菠菜幼苗作为外植体未经农杆菌转化芽诱导、芽伸长和生根过程。
图4显示了菠菜幼苗作为外植体转化瞬时表达情况。基因表达水平1：大于1％和小于30％的外植体再生部位的面积有GFP基因表达。基因表达水平2：大于30％和小于50％的外植体再生部位的面积有GFP基因表达。基因表达水平3：大于50％和等于100％的外植体再生部位的面积拥有GFP基因表达。
图5显示了菠菜幼苗作为外植体农杆菌转化流程包括农杆菌侵染、抗性芽诱导、抗性芽伸长和生根。
图6利用基因枪法轰击品种1获得的转基因抗性植株。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：使用成熟种子作外植体的农杆菌转化方法
1.1.构建菠菜转化载体p24545，并转入农杆菌EHA101中待用
p24545为双元转化载体，包括两个基因表达盒，即第一个表达盒为烟草花叶病毒35S启动子驱动的GFP基因；第二个表达盒为拟南芥EF启动子驱动aadA基因。
1.2.转基因菠菜植株的获得
图1展示了使用成熟种子作为外植体的转化流程。
菠菜种子消毒：选取具有农艺性状的菠菜品种1的种子，70％酒精表面消毒3分钟后，用含有0.1％吐温-20的去离子水，在30-60℃下在160-200转/分钟的摇床上处理40-80分钟；之后，在含有0.1％吐温-20的1％次氯酸钠溶液中，在30-60℃下在160-200转/分钟的摇床上处理40-80分钟，用无菌水将处理过的种子清洗3-5次待用。该方式既可使种子正常萌发，又可以完全去除微生物的污染。
菠菜种子萌发：在无菌培养皿里放置一张无菌滤纸，放入1ml的菠菜萌发培养基SpBGM0.5MS(2.2g/L MS盐/维生素、30g/L蔗糖、0.5g/L MES，pH5.8)(表12)，将30-50粒消毒后的菠菜种子置于滤纸上，于21±1℃和黑暗下萌发24小时。种子萌发时间可以是24小时至3天。
本实施例的萌发培养基主要成分是2.2g/L MS盐，也可以是4.4g/L。可以是固体培养基，也可以是液体培养基。也可以使用其他组织培养中常用的盐，例如B5、N6等。
预处理外植体：萌发1至7天后，从中间将菠菜种子切开，去除种皮、子叶和真叶，将裸露的含有分生能力的组织放入SpCMLiq(表13)+40mg/L AS培养基中。外植体全部分离之后，使用侵染液清洗，然后超声波处理20秒-1分钟，优选40秒。
本实施例的预处理外植体的方法，可以使用手术刀、针、针头或者其它锋利的锐物在顶端分生组织造成伤害，然后对外植体实施侵染；也可以使用手术刀、针、针头或者其它锋利的锐物在顶端分生组织造成伤害后再实施超声波处理；也可以使用手术刀、针、针头或者其它锋利的锐物在顶端分生组织造成伤害后再实施离心处理5-10分钟；也可以不使用手术刀、针、针头或者其它锋利的锐物造成伤害，而是直接使用超声波处理；也可以不使用手术刀、针、针头或者其它锋利的锐物造成伤害，而是直接离心处理5-10分钟。
农杆菌菌液的制备：将含有p24545质粒的农杆菌从-80℃冰箱取出，在含有适当抗生素的YP培养基上划线培养，在28℃黑暗条件下培养2-3天。选取YP培养基上的菌落，在新的YP培养基上继续培养1天。刮取菌落，转移到含有10ml侵染培养液的50ml离心管中，涡旋震荡，使农杆菌完全悬浮在侵染液中，将农杆菌稀释到OD660＝0.2-1.0，待用。
农杆菌侵染：将分离或预处理好的菠菜外植体置于含有10ml侵染液的离心管中，将离心管置于水浴超声波处理40秒，然后置于摇床上以100转/分钟处理30分钟，或者静置1-2小时。
将侵染后的外植体完全去除残留的农杆菌菌液，转移到含有一张预先用1ml液体培养液湿润的3M滤纸的培养皿中，将培养皿封口后置于21±1℃下黑暗培养2-4天。
菠菜芽组织的筛选和再生：将共培养后的菠菜芽组织转移到添加了壮观霉素的芽诱导筛选培养基spSIM8(表14)培养4-7天。筛选培养条件为21±1℃，光照8小时，黑暗16小时。
菠菜多芽的诱导和筛选：将已经筛选4-7天的组织转移到高浓度筛选的芽诱导培养基spSIM7(表15)上3-6周，中间继代一次。筛选培养条件为21±1℃，光照8小时，黑暗16小时。
多芽的伸长和筛选：待抗性芽形成且生长到1cm之后得到抗性苗，然后移栽到伸长和筛选培养基spSEM9(表16)中。伸长培养条件为21±1℃，光照8小时，黑暗16小时。
生根和筛选：待抗性苗伸长至2-3cm时，可以移栽至生根和筛选培养基SpSR7(表17)培养基上。或者将抗性苗在20mg/L IBA(吲哚丁酸)的MS培养基里处理两个小时以后，移到SpSR7培养基上直到生根。培养条件为21±1℃，光照8小时，黑暗16小时。
1.3.实验结果
1.3.1.不同预处理方法对转化效率的影响
本实施例中采用多种方法预处理分离的菠菜外植体，经转化的菠菜抗性芽比率如表1所示。
表1.不同预处理方法对转化效率的影响
Figure BDA0002850913440000081
表1所示，超声波强度范围在45千赫兹至28千赫兹，超声波时间长度为10-40秒；离心强度固定为600g，离心时间5分钟，次数为1-2次。优选地，超声波45千赫兹30秒。
1.3.2.不同植物生长调节剂及组合对不同菠菜品种外植体再生的影响
本实施例中，采用不同的植物生长调剂组合处理不同品种的菠菜外植体，以便确定植物生长调节剂组合对菠菜外植体诱导成芽的影响。表2为未转化的菠菜品种1在不同浓度植物生长调节剂及组合下诱导多芽的实例，基础培养基为MS培养基。表3为未转化的菠菜品种2在不同浓度植物生长调节剂及组合下诱导多芽的实例。
表2.不同植物生长调节剂及组合诱导菠菜品种1多芽的比率
Figure BDA0002850913440000082
表3.不同植物生长调节剂及组合诱导菠菜品种2多芽的比率
Figure BDA0002850913440000091
表2所示是菠菜品种1的再生实验结果，其表明1mg/L玉米素和0.05mg/L TDZ能够有效促进菠菜品种1的多芽诱导。
表3所示是菠菜品种2的再生实验结果，其表明1mg/L玉米素和0.2mg/L TDZ能够有效促进菠菜品种2的多芽诱导。
以上结果表明，本实施例的方法可以用于诱导不同菠菜品种产生多芽。品种1和品种2的多芽诱导率最高可达90％和63％。成功诱导多芽，进而将多芽培养成完整植株，从而得到转基因植株。因此本实施例的方法可以实现多种菠菜品种的转化。
1.3.3.壮观霉素的筛选浓度对成芽的影响
本实施例对于抗生素的浓度进行了比较，表4为共培养之后，筛选培养基中筛选剂不同浓度的比较实验结果。在该实验中，诱导多芽过程中共历经两步筛选，每步3周。第一步筛选剂为壮观霉素，剂量分别为25mg/L和50mg/L；第二步筛选剂为壮观霉素，剂量为50mg/L。结果表明，壮观霉素为25mg/L的第一步筛选的处理的抗性绿芽比率是壮观霉素为50mg/L的第二步筛选的处理的抗性绿芽比率的2.5倍。因此，优选的筛选剂量为第一步筛选浓度低于第二步筛选浓度，所获得的抗性绿芽比率优于第一步筛选浓度与第二步筛选浓度相同的处理所获得的抗性绿芽比率。
表4.筛选浓度对成芽的影响
Figure BDA0002850913440000092
1.3.4.转化效率
本实施例使用萌发1天和3天的菠菜种子作为外植体(如表5所示)。在显微镜下将带有生长点的组织分离待农杆菌侵染，具体方法参照1.2的描述。如表5所示，A处理使用了萌发1天的种子作为外植体，B处理使用萌发3天的种子作为外植体。A和B处理采用的预处理方式皆为28千赫兹超声波处理10秒。参照1.2描述的方法共培养、芽诱导筛选、芽伸长和生根。芽诱导筛选培养基的植物生长调节剂为1mg/L TDZ和0.8mg/L6-BA的组合。外植体在筛选剂壮观霉素含量为25mg/L的芽诱导培养基诱导4天后，转移至壮观霉素含量为75mg/L的培养基上继续诱导3-4周，转移至芽伸长和生根培养基上继续培养。如表5所示，以萌发1天或者3天的种子作为外植体经农杆菌侵染，筛选培养后均可获得稳定转化的转基因植株。
表5.菠菜品种1的转化效率
Figure BDA0002850913440000101
1.4.PCR或者Taqman验证转基因的植株
当菠菜抗性转化苗在伸长或者生根培养基上至4厘米以上时，取一片菠菜叶片，提取DNA，使用PCR扩增验证p24545载体的GFP基因是否已经转入菠菜转化苗，同时用农杆菌的内源基因序列作为参考以排除因农杆菌污染而引起的假阳性扩增。GFP基因引物为：引物1，GATCACCGGCGAGGGCATCGG；引物2，CTGCGGTCCTCGCGGGTCAGC，扩增片段大小为546个碱基。农杆菌菌株的引物为：引物1，ATTTACGGCCCGGAAAGCTCC；引物2，CGAACCGAACATGACGCCGATC，扩增片段大小为500个碱基。
PCR的验证结果如图2所示，15株转基因植株均为阳性植株，且没有扩增出农杆菌染色体片段。
本实施例使用农杆菌直接侵染具有分生能力的组织，在TDZ等植物生长调节剂的刺激下产生多芽，进而诱导成苗。基于此，该方法具有操作简单，周期短，依赖于基因型程度低，表型正常等特点。
泡发的1-3天的成熟种子或者苗作为外植体，将具有分生能力的组织浸没在农杆菌中，经过共培养、诱导、伸长和生根等步骤，这一系列的流程操作简单。本转化方法不诱导愈伤，减少了脱分化和脱分化后再生的步骤，而直接将分生细胞诱导成苗，从而使得整个转化流程的时间缩短，从侵染开始最快可以8周得到生根的菠菜转基因抗性植株。
经PCR检测阳性的转基因植株表型均正常。
实施例2：使用菠菜幼苗作为外植体的农杆菌转化方法
2.1.构建菠菜转化载体p24545，并转入农杆菌EHA101中待用。
2.2.转基因菠菜植株的获得
菠菜种子消毒：(见实施例1中的1.2部分)。
菠菜种子萌发：将种子放置在种子萌发培养基SIM14(表27)上发芽生长7天，温度21±1℃，黑暗条件。
分离外植体：萌发7天后，获得含有分生组织的下胚轴，切除子叶与真叶及上胚轴的底部，剩余大约3毫米长的组织用作外植体供转化。
农杆菌侵染：使用液体培养基spCMliq(表13)加入40mg/L AS重悬农杆菌并且将OD660调整到0.5备用。侵染：将30-60个外植体置于装有10ml侵染液的50ml离心管中，边分离外植体，边将外植体放入管中，待全部分离之后，加入产品规格为10％的
Figure BDA0002850913440000111
F68摇匀至终浓度0.1％。然后将置于真空(900mBar)下15分钟，在500g条件下离心两次，每次离心5分钟，在黑暗条件下以120转/分钟摇动30分钟，最后将侵染液吸出。
共培养：将一张无菌的滤纸放入25毫米×90毫米的培养皿，在滤纸的中央加入100微升的液体培养基spCMliq(表13)并含有40mg/L AS，将侵染过的外植体10个为单位聚成球状。将6个聚成的球状外植体置于液体培养基周围。将培养皿用Para film封口膜缠绕培养皿两圈，将培养皿严密封好。将培养皿置于21℃，暗光条件下，共培养4天。
筛选：将共培养后的外植体置于芽诱导培养基SM15(表18)约3周，然后转移到低筛选压培养基SM15_1(表19)直到绿色的小芽形成，或者将共培养之后的外植体置于筛选诱导培养基SM15直到形成绿色小苗。将绿色小苗转移到芽伸长培养基SM22(表20)或者SM22_1(表21)上直到得到大约1厘米长的高度，然后将小芽转移到培养基SM28_1(表22)上进一步伸长培养大约3周以得到高质量的幼苗。将伸长的健康绿苗转移到生根培养基SR3(表23)或者SR3-1(表24)上直到根形成。
2.3.实验结果
2.3.1.使用菠菜幼苗为外植体建立的再生体系
菠菜品种1的芽诱导(图3)：0.5mg/L和1mg/L的TDZ分别与0.4mg/L和0.8mg/L的6-BA组合，使用3至8天的幼苗的包含顶端分生组织和叶腋分生组织的上胚轴(大约0.3至0.5厘米长)诱导多芽(表6，图3)。
表6.不同植物生长调节剂及其组合
对在幼苗(萌发3-8天)的分生组织上诱导多芽的影响
Figure BDA0002850913440000121
对幼苗分生组织诱导多芽较优的植物生长调节剂组合是0.5mg/L TDZ与0.4mg/L6-BA搭配。植物生长调节剂组合1mg/L TDZ+0.8mg/L6-BA+0.1或0.2mg/L IAA的组合也能诱导66.7％和53.8％的外植体形成多芽。
如表7所示，在芽诱导阶段，硝酸银的使用促进了健康芽的形成。添加1mg/L的硝酸银的处理，健康芽比率提高了23％，不健康芽比率降低了57％。在诱导培养基里面额外添加5ml 200X B5维生素(200X B5维生素包括20g/L肌醇、0.2g/L烟酸、0.2g/L维生素B6、2g/L维生素B1)，添加硝酸银的处理与不添加硝酸银的处理相比，健康芽比率提高了67％，而不健康芽比率降低了65％。这些结果表明，硝酸银促进健康芽的形成，抑制不健康芽的产生。
表7.硝酸银促进菠菜多芽的诱导
Figure BDA0002850913440000131
*5ml 200X B5维生素(200X B5维生素包括20g/L肌醇、0.2g/L烟酸、0.2g/L维生素B6、2g/L维生素B1)。
芽伸长(图3)：在芽伸长阶段，0.3mg/L 6-BA与0.1mg/L GA3的组合或者0.35mg/LIAA都可以诱导芽的伸长。芽伸长培养基中添加0.3mg/L 6-BA和0.1mg/L GA3，额外添加1mg/L硝酸银和5ml 200X B5维生素的处理相比未添加硝酸银和B5维生素的处理，健康苗比率增加了183％，而不健康苗比率降低了82％(表8)。在芽伸长培养基添加0.35mg/L IAA，额外添加1mg/L硝酸银和5ml 200X B5维生素的处理相比未添加硝酸银和B5维生素的处理，健康苗比率增加了225％，而不健康苗比率降低了60％(表8)。因此，从所述数据中得知，在伸长培养基中额外添加硝酸银和B5维生素促进了健康绿苗的形成。菠菜品种1的生根培养基中加入1.5mg/L的IAA最高可以诱导85.7％的小苗生根(表9)。
表8.硝酸银在芽伸长阶段对健康芽形成的促进作用
Figure BDA0002850913440000132
*5ml 200X B5维生素(200X B5维生素包括20g/L肌醇、0.2g/L烟酸、0.2g/L维生素B6、2g/L维生素B1)。
表9.IAA对菠菜生根的影响
Figure BDA0002850913440000141
由此可见，建立了使用含有顶端分生组织和叶腋分生组织的上胚轴为外植体的菠菜再生方法(图4)。
2.3.2.以幼苗为外植体的农杆菌转化结果
农杆菌侵染：
农杆菌的侵染和共培养方法如2.2部分中所述，图5为共培养之后GFP在菠菜组织中的瞬时表达情况。外植体经过抽真空15分钟/离心5分钟，120转/分钟摇动30分钟处理后再与农杆菌共培养4天后，77％的外植体获得有效侵染(表10)。外植体没经过抽真空15分钟/离心5分钟处理，15％的外植体获得有效侵染(表10)。
菠菜品种1的稳定转化实验结果：
转化方法如上所述，实验表明4.7％和5.3％的外植体获得了抗壮观霉素的GFP阳性和PCR阳性苗(表11)。获得了稳定的菠菜转化植株(图6)。
表10.菠菜与农杆菌共培养4天后GFP的瞬时表达
Figure BDA0002850913440000142
表11.菠菜品种1的稳定转化
Figure BDA0002850913440000143
2.4.PCR或者Taqman验证转基因的整合(与上述成熟种子方法相同)
本实施例使用农杆菌直接侵染含有分生组织(包括顶端和所有侧端分生组织)的下胚轴外植体，在TDZ与6-BA等植物生长调节剂结合下诱导，产生多芽，发育成苗。该方法有效快速，在大约1个月时间里高达88％的外植体产生多芽(1个外植体产生高达20多个幼芽)。高达86％的伸长芽在约1个月时间里产生根成苗。该方法具有操作简单，转化生长周期短(2至3个月)，依赖于基因型程度低，表型正常等。该再生和转化方法直接诱导多芽没有诱导愈伤组织，减少了脱分化和再分化造成的遗传突变的不正常苗的形成。在所使用的外植体来源于不同幼苗阶段的下胚轴的再生和转化方法中，外植体分离方法简单，快速，不需要在显微镜下操作从而改善了在显微镜下分离外植体造成的人体工程学问题，包括双眼的疲劳。
实施例3：使用成熟种子作为外植体的基因枪转化方法
3.1.构建菠菜转化载体p24545并且在AatII位点线性化。
3.2.转基因菠菜植株的获得
菠菜种子消毒：(见实施例1中的1.2部分)。
菠菜种子萌发：(见实施例1中的1.2部分)。
预处理外植体：萌发一天后，将种子切开，去除种皮、子叶和真叶，将植物组织放入高渗培养基SposmT1(表25)上在21℃黑暗条件下处理4-6小时，外植体摆放位于培养基正中央。
弹药的制备：将适量金粉、氯化钙、亚精胺与DNA混合，将DNA包裹在金粉表面。
金粉携带DNA轰击外植体：待外植体预处理4-6小时之后，将处理的材料摆放到固体培养基置于SposmT1(表25)的中央，置于基因枪摆放植物材料的位置操作基因枪中轰击材料，压力1100psi，外植体与终止屏的距离为6厘米。
菠菜分生组织块的芽诱导和筛选：轰击后的外植体在SposmT1(表25)上培养24小时后转移到芽诱导和筛选培养基SpSIM11(表26)。图6为基因枪转化后筛选4周的再生苗。伸长和生根培养基可参考实施例1和实施例2。
本实施例使用外植体类型与实施例1中所使用的外植体一致，即泡发的1-3天的种子或者苗作为外植体。将含有分生能力的组织摆放在固体培养基上，使用基因枪将包裹DNA的金粉轰击植物组织，经过筛选、伸长和生根等步骤再生成苗，这一系列的流程操作简单。本转化方法不诱导愈伤，减少了脱分化和脱分化后再生的步骤，而直接将分生细胞诱导成苗，从而使得整个转化流程的时间缩短。菠菜组织被轰击后三周出现抗性再生芽。
本申请中所使用的一些培养基如下：
表12
Figure BDA0002850913440000161
表13
Figure BDA0002850913440000162
表14
Figure BDA0002850913440000171
表15
Figure BDA0002850913440000172
表16
Figure BDA0002850913440000181
表17
Figure BDA0002850913440000182
表18
Figure BDA0002850913440000191
表19
Figure BDA0002850913440000192
表20
Figure BDA0002850913440000201
表21
Figure BDA0002850913440000202
表22
Figure BDA0002850913440000211
表23
Figure BDA0002850913440000212
表24
Figure BDA0002850913440000221
表25
Figure BDA0002850913440000222
表26
Figure BDA0002850913440000231
表27
Figure BDA0002850913440000232
参考文献
1.Jin Hua Bao等人,Agrobacterium-mediated transformation of spinach(Spinaciaoleracea)with Bacillus thuringiensis cry1Ac gene forresistanceagainst two common vegetable pests.Plant Biotechnology 26,2009,249-254.
2.JAWERIA GUL等人,Agrobacterium-mediated transformation ofSpinaciaoleracea L.through a synthetic chitinase gene inducing resistance tofungal pathogens.Pak.J.Bot.,47(SI):193-198,2015.
3.K.A.Knoll,K.C.Short,I.S.Curtis,J.B.Power,M.R.Davey.Shootregeneration from cultured root explants of spinach(Spinacia oleracea L.):asystem for Agrobacterium transformation.Plant Cell Reports,1997,17:96-101.
4.H.-X.Zhang,J.A.D.Zeevaart.An efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and regeneration system for cotyledons of spinach(Spinacia oleracea L.).Plant Cell Reports,1999,18:640-645.
5.Quyen Van Nguyen等人,Evaluation of factors influencingAgrobacterium-mediated spinach transformation and transformant selection byEGFP fluorescence under low-selective pressure.In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant,2013,49:498-509.
6.Fuminori Komai,Ichiro Okuse,Takashi Harada.Somatic embryogenesisand plant regeneration in culture of root segments of spinach(Spinaciaoleracea L.).Plant Science,1996 113,203-209.

Claims (18)

1.一种菠菜转基因方法，其包括：
1)菠菜种子消毒和萌发，获得包含具有分生能力的细胞的菠菜外植体；
2)农杆菌侵染，其包括：将在步骤1)中所获得的外植体进行农杆菌浸染；
3)芽诱导，其包括：将在步骤2)的侵染后的外植体转至含有植物生长调节剂的筛选培养基以进行芽诱导；
4)芽伸长，其包括：将在步骤3)中诱导出的芽转入芽伸长培养基，在芽伸长培养之后转入生根培养基，并且在生根之后移栽到土壤中。
2.一种菠菜转基因方法，其包括：
1)菠菜种子消毒和萌发，获得包含具有分生能力的细胞的菠菜外植体；
2)基因枪轰击，其包括：对在步骤1)中所获得的外植体实施基因枪轰击；
3)芽诱导，其包括：将在步骤2)的基因枪轰击后的外植体转至含有植物生长调节剂的筛选培养基以进行芽诱导；
4)芽伸长，其包括：将在步骤3)中诱导出的芽转入芽伸长培养基，在芽伸长培养之后转入生根培养基，并且在生根之后移栽到土壤中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述外植体来自于萌发1至7天的菠菜种子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述外植体来自于萌发1至3天的菠菜种子。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述外植体是从3-10天幼苗中分离而来的包含顶端和腋芽/叶腋分生组织细胞的下胚轴。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述外植体是通过下述方式分离的：去除子叶和上胚轴的连接部位的子叶与真叶，同时切除上胚轴的底部，剩余的下胚轴组织用作外植体。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所获得的外植体通过下述方式对外植体靠近生长点部位进行创伤处理：用刀片划痕或剥离，用尖锐工具刺击，采用超声波处理。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行农杆菌侵染时，实施一种或多种能够增强农杆菌侵染的操作，例如离心、抽真空和超声波。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述超声波的频率为45千赫兹至28千赫兹。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述超声波的处理时间为10秒至40秒。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物生长调节剂选自细胞***素、生长素和赤霉素。
12.根据权利要求11所述的方法，所述细胞***素选自噻二唑苯基脲即TDZ、激动素、玉米素和6-苄氨基嘌呤即6-BA；所述生长素选自吲哚乙酸即IAA和吲哚丁酸即IBA；所述赤霉素为GA3。
13.根据权利要求12所述的方法，所述植物生长调节剂添加在MS培养基中，所述植物生长调节剂为TDZ，浓度0.05-1mg/L。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选培养基包含TDZ，其使用时间为7-42天。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述筛选培养基中添加细胞***素的组合，特别地0.05-1mg/L TDZ+0.2-1mg/L 6-BA、0.05-1mg/L TDZ+0.8-1.2mg/L玉米素或者0.05-1mg/L TDZ+0.8-1.2mg/L激动素。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，向所述芽伸长培养基添加GA3、6-BA和/或IAA，或者不添加任何植物生长调节剂。
17.根据权利要求1或2所述的方法，在芽诱导、芽伸长和生根阶段，在培养基中添加硝酸银，所述硝酸银的浓度为0.1mg/L-5mg/L。
18.根据权利要求17所述的方法，所述硝酸银的浓度为1mg/L。
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