CN114645013A - 一种通过物理途径促进干细胞分化的材料及方法 - Google Patents
一种通过物理途径促进干细胞分化的材料及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114645013A CN114645013A CN202011498178.5A CN202011498178A CN114645013A CN 114645013 A CN114645013 A CN 114645013A CN 202011498178 A CN202011498178 A CN 202011498178A CN 114645013 A CN114645013 A CN 114645013A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- microspheres
- hematopoietic
- stem cells
- nanospheres
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 title abstract description 14
- 238000013459 approach Methods 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 76
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 claims abstract description 68
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 61
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 57
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 50
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 43
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 34
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 53
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 30
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 28
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 25
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 21
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 claims description 10
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 10
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 claims description 10
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims description 4
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 abstract 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 12
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 11
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 11
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 7
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000003746 surface roughness Effects 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000002960 bfu-e Anatomy 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 1
- 210000004892 erythrocyte colony-forming unit Anatomy 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 210000004891 granulocyte-monocyte colony-forming unit Anatomy 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000024155 regulation of cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002660 stem cell treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0641—Erythrocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/20—Small organic molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/30—Synthetic polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种通过物理途径促进干细胞分化效率的材料及方法，具体公开了一种促进人胚胎干细胞向造血相关细胞亚型分化的颗粒基底材料，所述颗粒基底材料是由微球和纳米球通过自组装在一容器中或基底表面形成；所述的微球与纳米球的粒径尺寸比例为1:0.01‑0.3。本发明还公开了上述颗粒基底经由自组装干燥后所形成的二维基底作为人胚胎干细胞扩增的材料，经过材料扩增后的干细胞可提升后续向造血细胞分化的效率，提升造血干组细胞或血细胞数量至少3倍以上。本发明的方法首次利用颗粒材料提高了人胚胎干细胞向造血细胞分化的效率，材料制备工艺简单，并优化了造血细胞的生产过程，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种物理途径促进干细胞分化的材料及方法。
背景技术
造血干细胞移植治疗血液***疾病是最早应用于临床的干细胞技术，也是目前唯一在全球范围均获得认可的干细胞治疗技术。但造血干细胞来源有限，体外扩增难度大，难以满足临床治疗中足数量和高质量的要求。人类多能干细胞(hPSC)，包括hESC和hiPSC，是有希望产生血样细胞的来源。hPSCs的造血潜力在治疗与地中海贫血[1]或血友病[2]等血液相关疾病方面有着重要的应用。已经建立了几种共培养分化***，例如OP9基质细胞和主动脉-性腺-中肾源性基质细胞(AGM-S3)[3]，用于生成类血细胞。这些***利用自然界启发的微环境在体外刺激确定的造血作用。这些***可用于鉴定关键基因在正常或异常造血中的功能。例如，AGM-S3共培养***可用于检查受关键基因影响的造血作用的详细细胞和分子机制[4-6]。它在筛选促进人类造血功能的化合物方面也具有潜在的实用性，它有可能建立使用AGM-S3共培养***进行化合物功能筛选的高通量筛选***[7]。但是，目前的体外血细胞生成方法在质量和数量上都不能满足临床需求[8]。因此，非常需要提高hPS-HCs的造血分化效率。
cSAPs(颗粒晶体膜)为本课题组自主研发的一种由不同尺寸和化学组分胶体颗粒组成的新基质材料家族[9]。晶体颗粒可以进行预修饰或后修饰，最终提供cSAPs复杂表面和化学组分[10]，从而使表面形貌、粗糙度、亲水性、化学性质、甚至刚度不同。在cSAPs上前期已经研究了人类干细胞和成体细胞的行为[11,12]，成功在cSAPs上建立了将人类成纤维细胞重编程为人诱导多能干细胞(hiPSC)的方法[13]，证明了cSAPs显示出调控细胞粘附以及细胞命运的潜力。
目前将hESCs分化在体外诱导分化为造血细胞的常用方法主要有三种:一种是拟胚体分化诱导法，一种是ESCs与造血基质细胞共培养法，另一种公司将ESCs培养在细胞外的基质蛋白上的无基质细胞培养法。其中与小鼠主动脉性腺中肾区机制细胞(AGM)能很好的将ESCs诱导成造血干/祖细胞，并且诱导出的造血干/祖细胞比例更高。但相对于临床应用所需细胞数量而言，现有体外诱导方法的效率较低，并且成本较高。现有提高体外分化效率和降低分化成本的方法主要包括：优化分化培养基配方；使用半渗透膜保存培养基找那个需要补充的分子；采用更便宜的模拟物替代细胞因子；添加特定的小分子增加红细胞前难题细胞的扩增效率；建立永生化红祖细胞的细胞系；利用基因操作在基因水平上调红细胞的分化及扩增效率等。虽然这些方法在一定程度上达到了提高分化效率、降低分化成本的目的，但本专利所述方法在操作技术和成本、分化效率方面优于现有方法，能更大程度的简单高效低成本获得更多造血干/祖细胞及红系细胞。
参考文献
[1]E.P.Papapetrou,Gene and Cell Therapy forβ-Thalassemia and SickleCell Disease with Induced Pluripotent Stem Cells(iPSCs):The Next Frontier,AdvExp Med Biol 1013(2017)219-240.
[2]J.J.Wang,Y.Kuang,L.L.Zhang,C.L.Shen,L.Wang,S.Y.Lu,X.B.Lu,J.Fei,M.M.Gu,Z.G.Wang,Phenotypic correction and stable expression of factor VIII inhemophilia A mice by embryonic stem cell therapy,Genet Mol Res 12(2)(2013)1511-21.
[3]M.H.Ledran,A.Krassowska,L.Armstrong,I.Dimmick,J.
R.Lang,S.Yung,M.Santibanez-Coref,E.Dzierzak,M.Stojkovic,R.A.Oostendorp,L.Forrester,M.Lako,Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cellson stromal cells derived from hematopoietic niches,Cell Stem Cell 3(1)(2008)85-98.
[4]J.Zeng,H.Zhang,Y.Liu,W.Sun,D.Yi,L.Zhu,Y.Zhang,X.Pan,Y.Chen,Y.Zhou,G.Bian,M.Lai,Q.Zhou,J.Liu,B.Chen,F.Ma,Overexpression of p21 Has InhibitoryEffect on Human Hematopoiesis by Blocking Generation of CD43+Cells via Cell-Cycle Regulation,Int J Stem Cells 13(2)(2020)202-211.
[5]W.Sun,J.Zeng,J.Chang,Y.Xue,Y.Zhang,X.Pan,Y.Zhou,M.Lai,G.Bian,Q.Zhou,J.Liu,B.Chen,F.Ma,RUNX1-205,a novel splice variant of the human RUNX1gene,has blockage effect on mesoderm-hemogenesis transition and promotioneffect during the late stage of hematopoiesis,J Mol Cell Biol 12(5)(2020)386-396.
[6]B.Chen,J.Teng,H.Liu,X.Pan,Y.Zhou,S.Huang,M.Lai,G.Bian,B.Mao,W.Sun,Q.Zhou,S.Yang,T.Nakahata,F.Ma,Inducible overexpression of RUNX1b/c in humanembryonic stem cells blocks early hematopoiesis from mesoderm,J Mol Cell Biol9(4)(2017)262-273.
[7]J.Chang,W.Sun,J.Zeng,Y.Xue,Y.Zhang,X.Pan,Y.Zhou,M.Lai,G.Bian,Q.Zhou,J.Liu,B.Chen,F.Guo,F.Ma,Establishment of an in vitro system based onAGM-S3 co-culture for screening traditional herbal medicines that stimulatehematopoiesis,J Ethnopharmacol 240(2019)111938.
[8]I.Moreno-Gimeno,M.H.Ledran,M.Lako,Hematopoietic differentiationfrom human ESCs as a model for developmental studies and future clinicaltranslations.Invited review following the FEBS Anniversary Prize received on5 July 2009 at the 34th FEBS Congress in Prague,Febs j 277(24)(2010)5014-25.
[9]P.-Y.Wang,H.Thissen,P.Kingshott,Modulation of human multipotentand pluripotent stem cells using surface nanotopographies and surface-immobilised bioactive signals:A review,Acta Biomaterialia 45(2016)31-59.
[10]F.S.Diba,N.Reynolds,H.Thissen,P.-Y.Wang,P.Kingshott,TunableChemical and Topographic Patterns Based on Binary Colloidal Crystals(BCCs)toModulate MG63 Cell Growth,Advanced Functional Materials 29(39)(2019)1904262.
[11]C.Cui,J.Wang,D.Qian,J.Huang,J.Lin,P.Kingshott,P.-Y.Wang,M.Chen,Binary Colloidal Crystals Drive Spheroid Formation and Accelerate Maturationof Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes,ACS AppliedMaterials&Interfaces 11(4)(2019)3679-3689.
[12]P.-Y.Wang,H.Thissen,P.Kingshott,Stimulation of earlyosteochondral differentiation of human mesenchymal stem cells using binarycolloidal crystals(BCCs),ACS applied materials&interfaces 8(7)(2016)4477-4488.
[13]P.Y.Wang,S.S.Hung,H.Thissen,P.Kingshott,R.C.Wong,Binary colloidalcrystals(BCCs)as a feeder-free system to generate human induced pluripotentstem cells(hiPSCs),Scientific reports 6(2016)36845.
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种颗粒晶体膜，以及包含所述颗粒晶体膜的细胞培养容器，并验证了所述颗粒晶体膜能够促进干细胞的增殖，并诱导其分化成为造血干细胞、造血祖细胞以及红系细胞。
本发明一个方面提供了一种促进干细胞向造血相关细胞分化的颗粒晶体膜，所述颗粒晶体膜由微球和纳米球通过在基底表面自组装制成；
所述的微球选自氧化无机微球或聚合物有机微球；
所述的纳米球选自表面进行化学修饰的纳米球。
所述的微球的粒径为1μm-6μm，；
所述的纳米球的粒径选自30nm-500nm；且微球与纳米球的粒径比例为2:0.03-0.5。
在本发明的技术方案中，所述的纳米球的粒径为50nm-200nm，优选为40nm-120nm。
在本发明的技术方案中，所述的微球的粒径为1μm-3μm；优选为1.5μm-2.5μm。
在本发明的技术方案中，氧化无机微球选自二氧化硅微球，聚合物有机微球选自聚苯乙烯微球、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球。
在本发明的技术方案中，微球与纳米球的粒径比例为2:0.05-0.1。
在本发明的技术方案中，所述化学修饰指纳米球表面进行了化学基团的修饰，更优选地，所述化学基团选自羧基。
在本发明的技术方案中，所述的微球和纳米球的数量比为1:10000～1:60000。
优选地，所述的微球和纳米球的数量比为1:10000-1:15000，或1:50000-1:60000。
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体膜中微球和纳米球的粒径比为2:0.08-0.12，更优选为2：0.1。
在本发明的技术方案中，所述颗粒晶体膜的接触角小于30°，优选小于25°。
在本发明的技术方案中，所述颗粒晶体膜的粗糙度为190-230nm。
本发明另一个方面提供了一种细胞培养的容器，所述容器具有本发明上述的颗粒晶体膜的表面。
在本发明的技术方案中，所述的容器种类选自细胞培养皿、细胞培养板、细胞爬片。
在本发明的技术方案中，所述的容器与细胞接触的表面上具有本发明上述的颗粒晶体膜。
本发明另一个方面提供了诱导干细胞向功能细胞分化的方法，所述方法包括以下步骤：
1)采用本发明所述的颗粒晶体膜表面培养干细胞，进行增殖培养；
2)诱导步骤1)增殖后的干细胞分化。
在本发明的技术方案中，所述的功能细胞选自造血细胞、造血干细胞、造血祖细胞、红系细胞中的至少一种。
在本发明的技术方案中，所述步骤2)诱导的方法包括物理诱导、化学诱导或生物诱导方法，例如采用与主动脉-性腺-中肾细胞共培养诱导干细胞向造血细胞、造血干细胞、造血祖细胞、红系细胞分化。
本发明再一个方面提供了一种制备具有促进干细胞分化的表面的方法，所述方法包括在基底上形成上述颗粒晶体膜的步骤。
进一步地，上述方法包含以下步骤：
1)配制二氧化硅微球与粒径和的纳米球的分散液；
2)将分散液分散在基底表面，并使二氧化硅微球与粒径和纳米球在重力沉降作用下聚集在基板表面并蒸发分散液中的溶剂形成颗粒晶体膜。
本发明再一个方面提供了上述颗粒晶体膜的用途，所述用途为作为培养干细胞进行分化的表面，或者作为进行培养干细胞的表面。
本发明再一个方面提供了上述颗粒晶体膜的用途，所述用途为提高或维持干细胞干性状态的用途。优选地，所述用途为通过提高干细胞干性状态，促进干细胞向造血干细胞、造血祖细胞、红系细胞分化的用途。
本发明再一个方面提供了上述颗粒晶体膜的用途，所述用途为提高干细胞向造血干细胞、造血祖细胞或红系细胞分化的用途。
本发明再一个方面提供了上述颗粒晶体膜的用途，所述用途为提高干细胞向以下细胞分化的数量或比例的用途，所述细胞为表达C34和CD43的细胞、表达C34且不表达CD43的细胞、不表达C34且表达CD43的细胞、表达C34且表达CD45的细胞、表达C34且不表达CD45的细胞、不表达C34且表达CD45的细胞，或表达GPA且表达CD71的细胞。
在本发明的技术方案中，所述的干细胞选自人胚胎干细胞(hESCs)、人诱导多潜能干细胞(hiPSCs)。
本发明再一个方面提供了一种经诱导催化处理的干细胞，所述的干细胞在被诱导前在本发明所述颗粒晶体膜上进行过培养。
在本发明的技术方案中，在本发明所述颗粒晶体膜上进行过培养为所述干细胞在培养过程中与本发明所述的颗粒晶体膜进行过接触，
本发明再一个方面提供了本发明上述经诱导催化处理的干细胞在制备治疗造血障碍疾病的制剂中的用途。
在本发明的技术方案中，所述的人胚胎干细胞是利用未经过体内发育的受精14天以内的人胚胎分离或者获取干细胞的。
本发明利用自主装技术制备的颗粒晶体膜cSAPs材料培养人胚胎干细胞(hESCs)，通过cSAPs材料表面化学和物理性质对hESCs进行预刺激，使从cSAPs上收获的hESCs在造血细胞分化诱导条件下分化为造血干/祖细胞和红系细胞的效率提高，在数量上和细胞质量上得到提升。hESCs在cSAPs上增殖培养3代以上后取下，与AGM细胞共培养进行造血细胞诱导。cSAPs自身的物理形貌和化学性质对hESCs的干性维持产生影响，使之处于较高干性和较高可诱导分化状态，从而在于诱导条件下分化为造血干/祖细胞和红系细胞的效率提高。
有益效果
1)本专利所述方法在操作技术和成本、分化效率方面优于现有方法，能更大程度的简单高效低成本获得更多造血干/祖细胞及红系细胞。
2)本发明可提高胚胎干细胞向造血干细胞、造血祖细胞以及红系血细胞分化的效率；
3)本发明所用提高胚胎干细胞向血细胞分化效率的方式不需要添加外源因子，提高了所得造血细胞的安全性；
4)本发明用颗粒晶体膜(cSAPs)对胚胎干细胞预刺激，cSAPs利用物理形貌和化学性质对hESCs的干性维持产生影响，使之处于较高干性和较高可诱导分化状态，从而提高胚胎干细胞向造血细胞分化的效率。
5)本发明的产品制备方法简单，制备原料经济且其不需要苛刻的保存条件，更有利于商品化。
附图说明
图1：不同组合cSAPs表面形貌的扫描电镜图，扫描电镜的比例尺为5μm。
其中，TCPS为聚苯乙烯细胞培养板，#1代表实施例1中5μm二氧化硅微球与400nm聚苯乙烯(PS)纳米球，2#代表实施例1中5μm二氧化硅微球与200nm聚苯乙烯纳米球，3#代表实施例1中2μm二氧化硅微球与65nm聚苯乙烯纳米球，4#代表实施例1中2μm二氧化硅微球与50nm羧基化的聚苯乙烯(PSC)纳米球制备的颗粒晶体膜材料cSAP#4，5#代表实施例1中2μm二氧化硅微球与100nm羧基化的聚苯乙烯(PSC)纳米球制备的颗粒晶体膜材料cSAP#5。
图2：在TCPS培养板、覆盖cSAP#1、cSAP#2、cSAP#3、cSAP#4和cSAP#5的培养板上培养H1 hESCs的细胞形态。
图3：在TCPS培养板、覆盖cSAP#4和cSAP#5的培养板上传代3次后H1 hESCs上干性因子OCT4/SOX2/SSEA4的免疫染色结果。
图4：实施例2中hESCs与AGM细胞共培养诱导向造血细胞分化，第8天和第14天流式分析细胞表面标志物的表达。
图5：本发明实施例2实验验证流程图。
图6：本发明实施例2中hESCs与AGM细胞共培养诱导向造血细胞分化，第8天和第14天流式分析结果。
图7：实施例2中继续培养14天后进行集落形成实验分析结果。
图8：实施例2中测序结果及分析。
图9：cSAP#1-5样品的接触角。
图10：cSAP#1-5样品的粗糙度。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明提供了一种促进干细胞向造血相关细胞分化的颗粒晶体膜，所述颗粒晶体膜由微球和纳米球通过在基底表面自组装制成；所述的微球选自二氧化硅微球、聚苯乙烯微球、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球；所述的纳米球选自表面进行化学修饰的纳米球；所述的微球的粒径为1μm-6μm；所述的纳米球的粒径选自30nm-200nm；且微球与纳米球的粒径比例为2:0.03-0.5。
在本发明的一些实施例中，所述的纳米球的粒径选自40nm-120nm。
在本发明的一些实施例中，所述的微球的粒径为1.5μm-2.5μm。
在本发明的一些实施例中，微球与纳米球的粒径比例为2:0.05-0.1。
在本发明的一些实施例中，所述颗粒晶体膜的接触角小于30°，优选小于25°。
在本发明的一些实施例中，所述化学修饰指纳米球表面进行了化学基团的修饰。在本发明的一些优选的实施例，所述化学基团选自羧基。
在一些更优选的实施例中，化学修饰的纳米球选自羧基化的聚苯乙烯纳米球、羧基化的聚苯乙烯纳米球、羧基化的聚甲基丙烯酸甲酯纳米球中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，所述的微球和纳米球的数量比为1:10000～1:60000。在本发明的一些优选的实施例中，所述的微球和纳米球的数量比为1:10000-1:15000，或1:50000-1:60000。
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体膜中微球和纳米球的粒径比为2:0.08-0.12，更优选为2：0.1。
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体膜由2μm的二氧化硅微球和100nm羧基化的聚苯乙烯纳米微球通过自组装在基底表面形成。优选地，所述的二氧化硅微球和纳米球的数量比为1:10000～1:15000。
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体膜由2μm的二氧化硅微球和50nm羧基化的聚苯乙烯纳米微球通过自组装在基底表面形成。优选地，所述的二氧化硅微球和纳米球的数量比为1:50000～1：60000。
本发明还提供了一种细胞培养的容器，所述容器具有本发明上述的颗粒晶体膜的表面。
在本发明的一些实施例中，所述的容器种类选自细胞培养皿、细胞培养板、细胞爬片。
在本发明的一些实施例中，所述的容器与细胞接触的表面上具有本发明上述的颗粒晶体膜。
本发明一些实施例还提供了一种促进干细胞向功能细胞分化的方法，所述方法包括以下步骤：
1)采用本发明所述的颗粒晶体膜表面培养干细胞，进行增殖培养；
2)诱导步骤1)增殖后的干细胞分化；
所述的功能细胞选自造血细胞、造血干细胞、造血祖细胞、红系细胞中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，所述步骤2)诱导的方法包括物理诱导、化学诱导或生物诱导方法，例如采用与主动脉-性腺-中肾细胞共培养诱导，或者采用小鼠骨髓基质细胞诱导干细胞向造血细胞、造血干细胞、造血祖细胞、红系细胞分化。
本发明一些具体实施例提供了一种制备具有促进干细胞分化的表面的方法，所述方法包括在基底上形成上述颗粒晶体膜的步骤。
进一步地，上述方法包含以下步骤：
1)配制二氧化硅微球与纳米球的分散液；
2)将分散液分散在基底表面，并使二氧化硅微球与粒径和纳米球在重力沉降作用下聚集在基板表面并蒸发分散液中的溶剂形成颗粒晶体膜。
本发明一些具体实施例提供了上述颗粒晶体膜的用途，所述用途为作为培养干细胞进行分化的表面，或者作为进行培养干细胞的表面。
本发明一些具体实施例提供了上述颗粒晶体膜的用途，所述用途为提高或维持干细胞干性状态的用途。优选地，所述用途为通过提高干细胞干性状态，促进干细胞向造血干细胞、造血祖细胞、红系细胞分化的用途。
本发明一些具体实施例提供了上述颗粒晶体膜的用途，所述用途为提高干细胞向造血干细胞、造血祖细胞或红系细胞分化的用途。
本发明一些具体实施例提供了上述颗粒晶体膜的用途，所述用途为提高干细胞向以下细胞分化的数量或比例的用途，所述细胞为表达C34和CD43的细胞、表达C34且不表达CD43的细胞、不表达C34且表达CD43的细胞、表达C34且表达CD45的细胞、表达C34且不表达CD45的细胞、不表达C34且表达CD45的细胞，或表达GPA且表达CD71的细胞。
在本发明一些技术方案中，所述的干细胞选自人胚胎干细胞(hESCs)、人诱导多潜能干细胞(hiPSCs)。
本发明一些具体实施例提供了一种经诱导催化处理的干细胞，所述的干细胞在被诱导前在本发明所述颗粒晶体膜上进行过培养。
在本发明的技术方案中，在本发明所述颗粒晶体膜上进行过培养为所述干细胞在增殖培养过程中与本发明所述的颗粒晶体膜进行过接触，或者是在本发明所述的颗粒晶体膜表面进行增殖。
本发明一些具体实施例提供了本发明上述经诱导催化处理的干细胞在制备治疗造血障碍疾病的制剂中的用途。
在本发明中，所述的干细胞是利用未经过体内发育的受精14天以内的人胚胎分离或者获取干细胞的。
在本发明中，所述造血相关细胞选自造血干细胞、造血祖细胞、红系细胞或血细胞。
实施例1颗粒晶体膜cSAPs材料的制备
将粒径为5μm二氧化硅微球与粒径为400nm聚苯乙烯(PS)纳米球分散在溶剂中，颗粒数量比例为1：25000～1：50000，并将分散液分散在基板表面，二氧化硅微球与羧基化的聚苯乙烯纳米球在重力沉降作用下聚集在基板表面，然后上述微球和纳米球之间通过静电作用在基板表面排布形成多级结构的颗粒晶体膜cSAP#1。
将粒径为5μm的二氧化硅微球与粒径为200nm的聚苯乙烯纳米球分散在溶剂中，颗粒数量比例为1：20000～1：40000，并将分散液分散在基板表面，二氧化硅微球与聚苯乙烯纳米球在重力沉降作用下聚集在基板表面，然后上述微球和纳米球之间通过静电作用在基板表面排布形成多级结构的颗粒晶体膜cSAP#2。
将粒径为2μm的二氧化硅微球与粒径为65nm的聚苯乙烯纳米球分散在溶剂中，颗粒数量比例为1：30000～1：60000，并将分散液分散在基板表面，二氧化硅微球与聚苯乙烯纳米球在重力沉降作用下聚集在基板表面，然后上述微球和纳米球之间通过静电作用在基板表面排布形成多级结构的颗粒晶体膜cSAP#3。
将粒径为2μm的二氧化硅微球与粒径为50nm的羧基化的聚苯乙烯(PSC)纳米球分散在溶剂中，颗粒数量比例为1：50000～1：60000，并将分散液分散在基板表面，二氧化硅微球与50nm羧基化的聚苯乙烯纳米球在重力沉降作用下聚集在基板表面，然后上述微球和纳米球之间通过静电作用在基板表面排布形成多级结构的颗粒晶体膜cSAP#4。
将2μm二氧化硅微球与100nm羧基化的聚苯乙烯(PSC)纳米球分散在溶剂中，颗粒数量比例为1：10000～1：15000，并将分散液分散在基板表面，二氧化硅微球与100nm羧基化的聚苯乙烯纳米球在重力沉降作用下聚集在基板表面，然后上述微球和纳米球之间通过静电作用在基板表面排布形成多级结构的颗粒晶体膜cSAP#5。
采用扫描电镜分别观察聚苯乙烯细胞培养板、cSAP#1-5产品的形貌特征，结果参见图1，实验结果显示，cSAP#1-5在基板表面形成了均匀的排列，形成了多级结构。
分别检测cSAP#1-5样品的亲水性能，各样品的亲水接触角如图9所示。各样品的接触角为#1：85.8±3.5、#2：96.8±4.6、#3：31.8±1.1、#4：32.3±3.2、#5：25.8±2.4。各样品的表面粗糙度为#1：225.91±15.343nm、#2：116.371±10.599nm、#3：154.873±14.241nm、#4：83.03±5.669nm、#5：212±11.95nm。
实施例2胚胎干细胞的培养和诱导分化
对于胚胎干细胞培养以及诱导分化实验流程示意图参见图4。
胚胎干细胞(hESCs)的培养
分别采用聚苯乙烯组织培养板、cSAP#1-5表面对人胚胎干细胞(hESCs)进行培养：将H1 hESCs在聚苯乙烯细胞培养板、覆盖cSAP#1、cSAP#2、cSAP#3、cSAP#4和cSAP#5涂层的细胞培养板。进行增殖培养，观察细胞克隆形态。实验结果见图2。其中，在cSAP#1-3上细胞形态异常，而在cSAP#4和cSAP#5上细胞克隆形态更均匀，克隆内细胞更均匀致密。虽然不希望被理论所束缚，但是有可能是由于cSAP#4和cSAP#5表面的羧基化的聚苯乙烯(PSC)纳米球中携带的羧基基团为表面带来表面特性，更适合细胞培养条件，所以在其上生长的细胞实现了更好的形态。
根据细胞克隆形态，选择cSAP#4和cSAP#5进行后续培养。传代3次后对细胞的干性分子标记OCT4/SSEA4/SOX2进行免疫荧光染色鉴定。
实验结果见图3。实验结果显示hESCs在覆盖cSAP#4和cSAP#5涂层的细胞培养板上能够维持干性因子表达。
胚胎干细胞(hESCs)的诱导分化：
分别将聚苯乙烯细胞培养板、覆盖在cSAP#4和cSAP#5涂层的细胞培养板上传代3次后的细胞转移到主动脉-性腺-中肾细胞(AGM)上进行共培养14天，诱导hESCs向造血干/祖细胞和红系细胞分化，分别在第8天和第14天时通过细胞流式分析仪分析CD34/CD43/CD45/CD71/GPA在分化后细胞表面的表达。
实验结果见图4和图6。实验结果显示在第8天时，覆盖在cSAP#4和cSAP#5涂层的细胞培养板增殖培养获得的细胞中经过诱导后CD34+的细胞，即造血干细胞数量显著高于仅采用普通聚乙烯细胞培养板培养的细胞，尤其是cSAP#5组细胞数量显示其是普通聚乙烯细胞培养板组的约2-5倍。说明颗粒晶体膜涂层能够显著增加胚胎干细胞增殖同时诱导向造血干细胞祖细胞的转化。
对于第14天的结果，显示了cSAP#5组细胞数量依然明显高于普通聚乙烯细胞培养板组的细胞数量，且相比于第8天时的结果，也有显著增加，说明cSAP#5组颗粒晶体膜涂层对于胚胎干细胞增殖阶段的影响能够在其分化时持续作用。
在第14天时还进行了GPA+CD71+细胞的分选，其中GPA是红系细胞表面重要的标志物，同时CD71也是红系细胞表面重要的分子，二者共同表达显示了红系细胞趋向成熟。因此，实验结果显示颗粒晶体膜涂层cSAP#5组能够促进对于胚胎干细胞向红系细胞分化，而cSAP#4组显示出比TCPS组稍差的结果。
在第14天时还进行了较成熟血细胞(CD34-CD43+，或CD34-CD45+)的分选，对于对较成熟的血细胞的诱导分化，cSAP#4组显示出比TCPS组稍差的结果。
对14天分化后的细胞继续进行14天培养，进行造血干细胞集落形成实验分析。实验结果见图7。结果显示在cSAP#4和cSAP#5上培养过的造血干细胞在粒－单核细胞集落形成单位(CFU-GM)、红细胞集落形成单位(CFU-E)、红细胞早期集落形成单位BFU-E、混合集落形成单位(CFU-MIX)的集落含量均高于TCPS表面。与细胞分选结果相同，cSAP#4和cSAP#5相比于TCPS显示了更强的向造血干细胞诱导分化效果。
对在cSAP#5上传代3次后的细胞进行测序分析，实验结果见图8。结果表明，cSAP#5改变了H1 hESCs的基因表达模式，差异表达基因主要集中在Mineral absorption、Longevity regulating、Toll-like receptor、HIF1a、Notch、Focal adhesion、TGF-beta、PI3K-Akt、MAPK等信号通路。
综上所述，实验结果显示经过cSAP#5和cSAP#4表面培养的胚胎干细胞，能够诱导其向造血干细胞的转化，其诱导转化的效果远远高于普通培养表面培养后的细胞。而且，cSAP#5诱导胚胎干细胞向造血干细胞的能力又远高于cSAP#4。同时，cSAP#5还显示出了诱导hESCs向各种类型血细胞分化的效率有显著性提高。虽然不希望被理论束缚，但是不同的表面对于造血干细胞的诱导作用有可能和其表面粗糙度相关，因而，在不同粒径颗粒组成的表面上显示了不同的分化诱导活性。cSAP#5比cSAP#4显示了更大的粗糙度，可以认为在特定粗糙度下的表面能够实现对胚胎干细胞的诱导，促进其向造血干细胞和红系细胞转化。综上所述，本发明发现了当纳米球表面进行了化学基团的表面修饰，更适合细胞培养条件，在其上生长的细胞实现了更好的形态。进一步地，还需要实现特定粗糙度的表面，这样的表面能够实现更好的干细胞向造血相关细胞的分化诱导活性。
Claims (12)
1.一种促进干细胞向造血相关细胞分化的颗粒晶体膜，其特征在于，所述颗粒晶体膜由微球和纳米球通过自组装在基底表面形成；
所述的微球选自氧化无机微球或聚合物有机微球；
所述的纳米球选自表面进行化学修饰的纳米球；
所述的微球的粒径为1μm-6μm；
所述的纳米球的粒径选自30nm-500nm；且微球与纳米球的粒径比例为2:0.03-0.5；
优选地，氧化无机微球选自二氧化硅微球，聚合物有机微球选自聚苯乙烯微球、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球；
优选地，表面进行化学修饰的纳米球选自表面进行羧基修饰的纳米球，更优选为表面进行羧基修饰的聚苯乙烯纳米球。
2.根据权利要求1所述的颗粒晶体膜，其特征在于，所述的微球和纳米球的数量比为1:10000～1:60000。
3.一种细胞培养的容器，其特征在于，所述的容器与细胞接触的表面上具有如权利要求1或2所述的颗粒晶体膜；优选地，所述的容器的种类选自细胞培养皿、细胞培养板、细胞爬片。
4.一种诱导干细胞向功能细胞分化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)采用权利要求1或2所述的颗粒晶体膜表面或者采用权利要求3所述的细胞培养的容器，培养干细胞，进行增殖培养；
2)诱导步骤1)增殖后的干细胞分化；
优选地，所述的功能细胞选自造血细胞、造血干细胞、造血祖细胞、红系细胞中的至少一种。
5.一种制备具有诱导干细胞分化的表面的方法，其特征在于，所述方法包括在基底上形成权利要求1或2所述的颗粒晶体膜的步骤。
6.如权利要求1或2所述的颗粒晶体膜的用途，其特征在于，所述用途为作为培养干细胞进行分化的表面，或者作为进行培养干细胞的表面。
7.如权利要求1或2所述的颗粒晶体膜的用途，其特征在于，所述用途为提高或维持干细胞干性状态的用途；优选地，所述用途为通过提高或维持干细胞干性状态，促进干细胞向造血相关细胞分化的用途。
8.如权利要求1或2所述的颗粒晶体膜的用途，其特征在于，所述用途为提高干细胞向造血干细胞、造血祖细胞或红系细胞分化的用途。
9.如权利要求1或2所述的颗粒晶体膜的用途，其特征在于，所述用途为提高干细胞向以下细胞分化的数量或比例的用途，所述细胞为表达C34和CD43的细胞、表达C34且不表达CD43的细胞、不表达C34且表达CD43的细胞、表达C34且表达CD45的细胞、表达C34且不表达CD45的细胞、不表达C34且表达CD45的细胞，或表达GPA且表达CD71的细胞。
10.一种经诱导催化处理的干细胞，其特征在于，所述的干细胞在被诱导前在权利要求1-6任一项所述颗粒晶体膜上进行过培养。
11.根据权利要求10所述的经诱导催化处理的干细胞在制备治疗造血障碍疾病的制剂中的用途。
12.如权利要求1或2颗粒晶体膜，或者如权利要求3所述容器，或者如权利要求4或5所述的方法，或者如权利要求6-9，11任一项所述的用途，或者权利要求10所述的干细胞，其特征在于，所述干细胞选自人胚胎干细胞、人诱导多潜能干细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011498178.5A CN114645013B (zh) | 2020-12-17 | 2020-12-17 | 一种通过物理途径促进干细胞分化的材料及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011498178.5A CN114645013B (zh) | 2020-12-17 | 2020-12-17 | 一种通过物理途径促进干细胞分化的材料及方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114645013A true CN114645013A (zh) | 2022-06-21 |
| CN114645013B CN114645013B (zh) | 2024-04-19 |
Family
ID=81991102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011498178.5A Active CN114645013B (zh) | 2020-12-17 | 2020-12-17 | 一种通过物理途径促进干细胞分化的材料及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114645013B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102504430A (zh) * | 2011-12-19 | 2012-06-20 | 东南大学 | 用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜及其制备方法 |
| CN110908145A (zh) * | 2019-12-13 | 2020-03-24 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种具有不可逆温度响应性的光子晶体材料及其制备方法 |
| CN111849218A (zh) * | 2019-04-26 | 2020-10-30 | 深圳先进技术研究院 | 材料的表面改性方法及其改性后的材料和应用、医疗产品 |
| CN111944688A (zh) * | 2019-05-14 | 2020-11-17 | 深圳先进技术研究院 | 生物制品的制作方法、生物制品和应用 |
| US20200377836A1 (en) * | 2019-06-02 | 2020-12-03 | Shenzhen Institutes Of Advanced Technology | Membrane and method for culture and differentiation of cells |
-
2020
- 2020-12-17 CN CN202011498178.5A patent/CN114645013B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102504430A (zh) * | 2011-12-19 | 2012-06-20 | 东南大学 | 用于诱导干细胞定向分化的纳米多孔生物材料薄膜及其制备方法 |
| CN111849218A (zh) * | 2019-04-26 | 2020-10-30 | 深圳先进技术研究院 | 材料的表面改性方法及其改性后的材料和应用、医疗产品 |
| CN111944688A (zh) * | 2019-05-14 | 2020-11-17 | 深圳先进技术研究院 | 生物制品的制作方法、生物制品和应用 |
| US20200377836A1 (en) * | 2019-06-02 | 2020-12-03 | Shenzhen Institutes Of Advanced Technology | Membrane and method for culture and differentiation of cells |
| CN110908145A (zh) * | 2019-12-13 | 2020-03-24 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种具有不可逆温度响应性的光子晶体材料及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114645013B (zh) | 2024-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Talkhabi et al. | Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art | |
| Badenes et al. | Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems | |
| Chen et al. | Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction | |
| Pettinato et al. | Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells | |
| Hookway et al. | Aggregate formation and suspension culture of human pluripotent stem cells and differentiated progeny | |
| Abbasalizadeh et al. | Technological progress and challenges towards cGMP manufacturing of human pluripotent stem cells based therapeutic products for allogeneic and autologous cell therapies | |
| Zweigerdt | Large scale production of stem cells and their derivatives | |
| US10913929B2 (en) | Method of differentiating stem cells | |
| Liu et al. | Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells | |
| CN105745321B (zh) | 用于产生工程化心肌(ehm)的方法 | |
| CN112041428A (zh) | 用于在悬浮培养物中分化人多能干细胞系的方法 | |
| Chen et al. | Biomaterial-assisted scalable cell production for cell therapy | |
| US8802431B2 (en) | Population of multipotent cardiac precursor cells derived from human blastocysts derived stem cells | |
| JP2012509085A (ja) | マイクロキャリア上での多能性幹細胞の培養 | |
| Joddar et al. | Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures | |
| US9074182B2 (en) | Differentiated pluripotent stem cell progeny depleted of extraneous phenotypes | |
| Newland et al. | Macroporous heparin-based microcarriers allow long-term 3D culture and differentiation of neural precursor cells | |
| WO2009030092A1 (en) | Culture medium and method for in vitro culturing human adult primary mesenchymal stem cells on a large scale, primary mesenchymal stem cells obtained by the method, the uses thereof | |
| Yukawa et al. | Embryonic body formation using the tapered soft stencil for cluster culture device | |
| WO2019033482A1 (zh) | 一种人多能干细胞的定向分化方法 | |
| Abraham et al. | Role of bioinspired polymers in determination of pluripotent stem cell fate | |
| CN114645013B (zh) | 一种通过物理途径促进干细胞分化的材料及方法 | |
| CN110951686A (zh) | 一种造血干细胞体外扩增培养体系和方法 | |
| WO2022126473A1 (zh) | 一种通过物理途径促进干细胞分化的材料及方法 | |
| CN115537387A (zh) | 一种无支架3d微组织及其构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |