CN111849218A - 材料的表面改性方法及其改性后的材料和应用、医疗产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种材料的表面改性方法及其改性后的材料和应用、医疗产品，涉及材料表面改性技术领域。材料的表面改性方法包括以下步骤：在材料表面通过胶体颗粒自组装的方法形成涂层；其中，胶体颗粒包括粒径为1‑10μm的无机胶体颗粒和粒径为0.05‑0.75μm的有机高分子胶体颗粒，全部或部分所述无机胶体颗粒经过化学修饰，化学修饰包括化学官能团修饰和/或生物活性分子修饰。本发明将胶体颗粒的化学修饰和自组装结合，可实现对材料表面物理和化学性质的同时调控，可以通过选取不同化学修饰的胶体颗粒自组装实现表面化学的区域多样性，方法简单、快捷，可一步大面积构建同时具有多级物理结构和复杂化学的表面。

Description

材料的表面改性方法及其改性后的材料和应用、医疗产品
技术领域
本发明涉及材料表面改性技术领域，具体而言，涉及一种材料的表面改性方法及其改性后的材料和应用、医疗产品。
背景技术
材料的表面改性技术应用范围极为广泛，包括医疗器械或工业防腐等领域。对材料表面的改性可以分为两类：物理结构的改变以及化学性质的改变。表面物理结构的改变方法包括刻蚀、平板印刷(lithography)或翻印技术。表面化学性质的改变方法包括逐层镀膜(layer by layer)、根据表面化学官能团进行针对性反应以及材料表面的非特异性镀层(substrate independent coating)。
现有对表面构建可控的物理结构或者化学性质的改变方式过程繁琐，耗时长。例如，刻蚀需要用到特殊的仪器设备：等离子体、电子、激光或化学刻蚀仪器，且刻蚀之后的表面化学性质均一。翻印技术虽操作较为简易且可较大面积构建表面物理结构，但其所选用的基材、翻印材料以及物理结构的尺寸均具有局限性，且母版的制作仍需借助刻蚀工艺完成，翻印所得的表面化学性质也是均一的。平板印刷技术可以高精度的构建表面物理化学性质，但由于所需时间长、成本高，在大面积的表面修饰应用中受到了很大的约束。
此外，现有的技术无法实现对材料表面物理化学性质的同时调控，常见的方法是先构建物理结构然后对于具有物理结构的表面进行下一步的化学修饰，并且现有的化学修饰手段多为表面均一性修饰，虽然可以通过遮挡-修饰-去遮挡的方法实现表面多重化学区域性的修饰，但此方法也至少需要三个甚至更多步骤实现。
因此，所期望的是提供一种表面改性方法，其能够解决上述问题中的至少一个。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种材料的表面改性方法，将胶体颗粒的化学修饰和自组装结合，在材料表面做出涂层，可实现对材料表面物理和化学性质的同时调控，并且进一步可以通过选取不同化学修饰的胶体颗粒自组装实现表面化学的区域多样性，方法简单、快捷，可一步大面积构建同时具有多级物理结构和复杂化学的表面。
本发明的目的之二在于提供一种材料，采用上述材料的表面改性方法对材料的表面进行改性。
本发明的目的之三在于提供一种上述材料在微生物或细胞培养中的应用。
本发明的目的之四在于提供一种医疗产品，包括上述材料。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，提供了一种材料的表面改性方法，包括以下步骤：
在材料表面通过胶体颗粒自组装的方法形成涂层；
其中，胶体颗粒包括无机胶体颗粒和有机高分子胶体颗粒，全部或部分所述无机胶体颗粒经过化学修饰，化学修饰包括化学官能团修饰和/或生物活性分子修饰；所述无机胶体颗粒的粒径为1-10μm，所述有机高分子胶体颗粒的粒径为0.05-0.75μm；
优选地，自组装采用蒸发诱导法。
优选地，在本发明技术方案的基础上，所述无机胶体颗粒包括金属氧化物微球和/或非金属氧化物微球，优选包括SiO2微球、TiO2微球或ZnO微球中的一种或几种，进一步优选为SiO2微球；
优选地，所述化学修饰包括一类或几类不同的化学修饰；
优选地，在本发明技术方案的基础上，化学官能团包括卤素、氨基、甲基丙稀酰乙基磺基甜菜碱、巯基、环氧基、丙烯酰基或叠氮基团中的一种；
优选地，生物活性分子包括具有RGD序列的短肽、多肽、化学小分子、抗生素或生长因子中的一种。
优选地，所述有机高分子胶体颗粒包括修饰与未修饰的聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、壳聚糖微球、聚己内酯微球、聚二甲基硅氧烷微球、明胶微球、聚乳酸微球，聚丙烯酸微球中的一种或几种；
优选地，所述有机高分子胶体颗粒包括化学修饰的有机高分子胶体颗粒，优选包括羧基化的聚苯乙烯微球。
优选地，在本发明技术方案的基础上，无机胶体颗粒和有机高分子胶体颗粒的直径比为4-200：1，优选为4-100：1。
优选地，在本发明技术方案的基础上，上述材料的表面改性方法，包括以下步骤：
(a)对无机胶体颗粒进行化学修饰，得到化学修饰的无机胶体颗粒，将化学修饰的无机胶体颗粒与水混合，得到无机胶体颗粒悬浊液；
(b)将有机高分子胶体颗粒与水混合，得到有机高分子胶体颗粒悬浊液；
(c)将无机胶体颗粒悬浊液与有机高分子胶体颗粒悬浊液混合，得到混合胶体颗粒悬浊液；
(d)将混合胶体颗粒悬浊液滴加至材料表面，或将材料表面浸入混合胶体颗粒悬浊液中；干燥和固定后得到涂层；
(e)对涂层中的经过化学修饰的无机胶体颗粒的修饰基团上进行化学修饰，得到表面改性后的材料。
优选地，在本发明技术方案的基础上，步骤(a)中的化学修饰方式包括自由基聚合、阴离子聚合或阳离子聚合，优选包括以下聚合反应的任意一种：
(i)原子转移自由基聚合；
(ii)单电子转移自由基聚合；
(iii)可逆加成-断裂链转移聚合；
优选地，步骤(e)中的进一步修饰方式包括表面引发聚合，巯基-烯烃反应、环氧基-氨基反应或叠氮-炔烃反应。
优选地，步骤(c)中混合胶体颗粒悬浊液中无机胶体颗粒总体积与有机高分子胶体颗粒总体积之比为0.1-77，优选为0.5-3；
优选地，步骤(d)中干燥采用自然蒸发；
优选地，步骤(d)中固定采用加热固定，优选加热温度为110-200℃，加热时间为1-20min，优选为1-5min。
第二方面，提供了一种材料，采用上述材料的表面改性方法对材料的表面进行改性。
第三方面，提供了一种上述材料在微生物或细胞培养中的应用。
第四方面，提供了一种医疗产品，包括上述材料；
优选地，所述医疗产品包括微生物或细胞培养工具；
优选地，所述医疗产品包括生物医药抗菌材料。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明材料的表面改性方法通过采用包括化学修饰后的无机胶体颗粒和有机高分子胶体颗粒进行自组装，在材料表面形成涂层，实现对材料表面的改性。本发明将胶体颗粒的化学修饰和自组装相结合，通过胶体颗粒自组装实现表面物理结构的构建，通过组装前采用化学修饰的无机胶体颗粒实现表面化学性质的构建，该方法实现了对材料表面物理和化学性质的同时调控，同时，可以同时将多种化学修饰在自组装前的胶体颗粒表面，可以通过选取不同化学修饰的胶体颗粒自组装实现表面化学的区域多样性，扩大了胶体颗粒自组装构建微纳米界面的使用范围。
本发明的方法简单、快捷，可一步大面积构建同时具有多级物理微纳米结构和复杂化学的表面，改性后的表面可用于体外微生物和细胞培养，调控微生物和细胞的粘附与生长行为，也可用于生物在材料表面界面行为的模拟。
附图说明
图1为本发明一种实施方式的材料的表面改性方法的过程示意图；
图2为本发明一种实施方式的胶体颗粒自组装的过程示意图；
图3为本发明一种实施方式的胶体颗粒自组装后修饰方法示意图(其中图3中A为双胶体颗粒自组装表面组装后修饰反应示意图，图3中B为多胶体颗粒自组装表面组装后反应示意图)；
图4为本发明实施例3、实施例10和实施例11改性后表面的水接触角示意图(其中图4中左侧为实施例3改性后表面的水接触角示意图，图4中中间为实施例11改性后表面的水接触角示意图，图4中右侧为实施例10改性后表面的水接触角示意图)；
图5为本发明实施例3和实施例8改性后表面的XPS扫描图(其中图5中左侧为实施例3改性后表面的XPS扫描图，图5中右侧为实施例8改性后表面的XPS扫描图)；
图6为本发明实施例3-实施例6自组装后形成的表面的SEM图(其中图6中A为实施例3自组装后形成的表面的SEM图，图6中B为实施例5自组装后形成的表面的SEM图，图6中C为实施例4自组装后形成的表面的SEM图，图6中D为实施例6自组装后形成的表面的SEM图，图6中E为实施例7自组装后形成的表面的SEM图，图6中F为实施例8自组装后形成的表面的SEM图，图6中G为实施例9自组装后形成的表面的SEM图，图6中H为实施例11自组装后形成的表面的SEM图)；
图7为细菌粘附试验结果荧光染色图；
图8为细菌粘附试验结果面积覆盖统计图；
图9为细胞粘附试验结果图；
图10为细胞粘附统计结果图；
图11为细胞生长试验结果荧光染色图；
图12为细胞活性测量结果统计图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
根据本发明的第一个方面，提供了一种材料的表面改性方法，包括以下步骤：在材料表面通过胶体颗粒自组装的方法形成涂层；其中，胶体颗粒包括无机胶体颗粒和有机高分子胶体颗粒，全部或部分所述无机胶体颗粒经过化学修饰，化学修饰包括化学官能团修饰和/或生物活性分子修饰；无机胶体颗粒的粒径为1-10μm，有机高分子胶体颗粒的粒径为0.05-0.75μm。
现有技术对于材料表面进行单一的物理或化学修饰的技术已基本纯熟，但针对其表面的物理和化学性质同时进行调控的领域仍缺少一个简易快捷且可对大面积表面进行改性的方法。
本发明提出了一种利用化学修饰的无机胶体颗粒与有机高分子胶体颗粒进行自组装得到涂层的方式实现对材料表面物理和化学性质的同时调控。
这里的“材料表面”指具有二维表面的材料，即在材料的平面表面上进行改性，材料表面一般为亲水性平面，对材料的材质不作限定，包括但不限于高分子材质(如PS(Polystyrene，聚苯乙烯)或PET(Polyethylene terephthalate，聚对苯二甲酸类塑料)等)，无机非金属材质(如硅或石英等)，或金属材质(如不锈钢或钛合金等)表面。
胶体颗粒(colloidal particle)是粒径在10μm以下的颗粒，分散于连续的液态介质而形成的胶体分散体系称为胶体。
自组装是指由一种或多种单分散胶体粒子组装并规整排列而形成的有序结构。这里的胶体颗粒自组装是由一种或多种单分散胶体粒子组装成有序的二维平面结构，即在材料表面(基体)上形成涂层。
对具体的自组装方式不作限定，典型但非限制性的方式例如为毛细作用(如蒸发诱导：将胶体分散液滴在亲水基片上，形成一弯液，随着溶剂蒸发，在毛细作用和对流迁移作用的共同影响下，粒子所受的力会使粒子向薄层区移动，最终形成二维有序结构)或重力沉降等，自组装过程会涉及毛细现象和布朗运动等作用。
本发明胶体颗粒包括全部或部分经过化学修饰的无机胶体颗粒，无机胶体颗粒的粒径为1-10μm，有机高分子胶体颗粒的粒径为0.05-0.75μm。
无机胶体颗粒的粒径典型但非限制性的例如为1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm。有机高分子胶体颗粒的粒径典型但非限制性的例如为0.05μm、0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.55μm、0.6μm、0.65μm、0.7μm或0.75μm。
大颗粒的无机胶体颗粒和小颗粒的有机高分子胶体颗粒通过自组装，形成二维有序结构。
无机胶体颗粒
本发明的无机胶体颗粒中全部或部分颗粒是经过化学修饰的，即只要无机胶体颗粒中有化学修饰的颗粒即可，可以全是化学修饰的颗粒，也可以是部分化学修饰的颗粒。
对无机胶体颗粒的种类不作限定，可以是金属氧化物颗粒(如TiO2微球、ZnO微球等)，也可以是非金属氧化物颗粒(如SiO2微球等)，优选为SiO2微球。
对化学修饰的类别也不作限定，可以是一类化学修饰(一种修饰基团)，也可以是几类不同的化学修饰(几种不同的修饰基团)。对一类化学修饰中所含的修饰基团的个数也不作限定，一类化学修饰中可以具有一个化学修饰基团，也可以具有多个不同的化学修饰基团。化学修饰包括但不限于化学官能团修饰或生物活性分子修饰。化学官能团修饰的化学官能团典型但非限制性的例如为卤素、氨基、甲基丙稀酰乙基磺基甜菜碱、巯基、环氧基、丙烯酰基或叠氮基团；生物活性分子典型但非限制性的例如为含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)序列的短肽、抗菌多肽(例如含有色氨酸-精氨酸-色氨酸-色氨酸-赖氨酸-色氨酸-色氨酸序列多肽)、化学小分子(例如两性离子小分子类[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵，抗生素类万古霉素，信号分子类1-丙烯酰基-4-(2-氟苯基)-5-亚甲基吡咯烷-2-酮等)或生长因子(胰岛素、类胰岛素生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板来源生长因子、成纤细胞生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素、红细胞生长素、皮质醇或甲状腺素等)。
例如一种实施方式，无机胶体颗粒为一种(例如为SiO2微球)，那么SiO2微球中可以包含同一类的化学修饰的SiO2微球(例如SiO2-X)，也可以包含多种不同类的化学修饰的SiO2微球(例如SiO2-X、SiO2-Y、SiO2-Z等等的任意两种以上组合)，其中X、Y、Z表示不同的修饰基团。
例如另一种实施方式，无机胶体颗粒为几种(例如为SiO2微球和TiO2微球的组合)，那么SiO2微球和TiO2微球中可以包含同一类化学修饰的SiO2微球(例如SiO2-X)和/或TiO2微球(例如TiO2-X)，也可以包含多种不同类的化学修饰的SiO2微球和/或TiO2微球(例如SiO2-X、SiO2-Y、SiO2-Z、TiO2-X1、TiO2-Y2、TiO2-Z3等等的任意两种以上组合)，其中X、Y、Z、X1、Y2、Z3表示不同类别的修饰基团。
有机高分子胶体颗粒
对有机高分子胶体颗粒的种类不作限定，典型但非限制性的例如为修饰与未修饰的聚苯乙烯(PS)微球、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球、壳聚糖微球、聚己内酯微球、聚二甲基硅氧烷微球、明胶微球、聚乳酸微球，聚丙烯酸微球的一种或几种。
有机高分子胶体颗粒可以未经修饰的颗粒，也可以是带修饰基团的颗粒，还可以是未经修饰的颗粒和带修饰基团的颗粒的组合。有机高分子胶体颗粒是经过化学修饰的，有机高分子胶体颗粒优选为羧基化的聚苯乙烯(PSC)微球。
本发明材料的表面改性方法通过采用包括化学修饰后的无机胶体颗粒和有机高分子胶体颗粒进行自组装，在材料表面形成涂层，实现对材料表面的改性。本发明将胶体颗粒的化学修饰和自组装相结合，通过胶体颗粒自组装实现表面物理结构的构建，通过组装前采用化学修饰的无机胶体颗粒实现表面化学性质的构建，该方法实现了对材料表面物理和化学性质的同时调控，同时，可以同时将多种化学修饰在自组装前的胶体颗粒表面，可以通过选取不同化学修饰的胶体颗粒自组装实现表面化学的区域多样性，扩大了胶体颗粒自组装构建微纳米界面的使用范围。本发明的方法简单、快捷，可一步大面积构建同时具有多级物理微纳米结构和复杂化学的表面。
在一种实施方式中，无机胶体颗粒和有机高分子胶体颗粒的直径比为4-200：1，直径比是指两种颗粒之间单独对比，无机胶体颗粒的直径和有机高分子胶体颗粒的直径之比，例如为4:1、5:1、6:1、7:1、12.5：1或100:1，优选为4-100：1。
通过两种微球的尺寸选择合适的体积比有助于获得结构均一有序、厚度适宜的涂层表面。
在一种实施方式中，一种示例性的材料的表面改性方法，如图1所示，包括以下步骤：
(S1)对无机胶体颗粒进行化学修饰，得到化学修饰的无机胶体颗粒，将化学修饰的无机胶体颗粒与水混合，得到无机胶体颗粒悬浊液；
(S2)将有机高分子胶体颗粒与水混合，得到有机高分子胶体颗粒悬浊液；
(S3)将无机胶体颗粒悬浊液与有机高分子胶体颗粒悬浊液混合，得到混合胶体颗粒悬浊液；
(S4)将混合胶体颗粒悬浊液滴加至材料表面，或将材料表面浸入混合胶体颗粒悬浊液中；
(S5)干燥；
(S6)固定，得到涂层；
(S7)对涂层中的经过化学修饰的无机胶体颗粒的修饰基团上进行化学修饰，得到表面改性后的材料。
步骤(S1)中的化学修饰典型但非限制性的例如为对无机胶体颗粒进行表面接枝，接枝的方法例如为自由基聚合、阴离子聚合、阳离子聚合、开环聚合及可控自由基聚合(包括原子转移自由基聚合((Atom Transfer Radical Living Polymerization，ATRP)、可逆加成-断裂链转移聚合(Reversible Addition-fragmentation Chain-transferPolymerization，RAFT)和单电子转移活性自由基聚合(Single Electron TransferRadical Living Polymerization，SET-LRP)等)。一种示例性的方式为通过原子转移自由基聚合实现对无机胶体颗粒的表面接枝。ATRP是通过把ATRP引发剂键接到无机胶体颗粒(例如SiO2)表面，然后进行表面ATRP聚合，由引发剂(如烷基卤化物RX)、催化剂(如过渡金属卤化物CuBr、CuCl)和络合配位体(如联吡啶等)组成的活性聚合体系，可以在无机颗粒表面接枝各种均聚物、嵌段共聚物、超支化聚合物。
步骤(S2)中也可以先对有机高分子胶体颗粒进行化学修饰，得到化学修饰的有机高分子胶体颗粒，再将化学修饰的有机高分子胶体颗粒与水混合。
一种实施方式中，理论上构成单层颗粒涂层所需胶体颗粒悬浊液的体积的计算方式如下：
设胶体投影面积为Ap(cm2)，胶体颗粒本身密度为ρ(g/cm3)，所需涂层面积为A0(cm2)，胶体颗粒悬浊液重量浓度为w％，胶体颗粒体积为Vp(cm3)，则构成单层颗粒涂层所需胶体颗粒悬浊液的体积V(μL)如式(1)所示：
Figure BDA0002041442290000111
其中，0.95为经验值。
推导过程如下：
令m＝颗粒总重量，N为颗粒总数，则有m＝N×Vp×ρ (2)；
其中：m＝V×w％ (3)；
又令A0＝涂层面积，A1＝颗粒投影面积，则有
Figure BDA0002041442290000112
其中0.95为经验值。
将式(3)(4)代入式(2)并整理后，可得公式(1)。
优选地，步骤(S3)中混合胶体颗粒悬浊液中无机胶体颗粒总体积与有机高分子胶体颗粒总体积之比为0.1-77，例如0.1：1、0.2：1、0.3：1、0.5:1、0.8：1、1：1、2：1、3:1、4:1、5：1、10：1、20：1、30：1、40:1、50:1、60:1、70：1或77：1，优选为0.5-3。2μm大颗粒与65nm小颗粒体积比约为4.7：1，如果使用两种高分子小颗粒体积比约为1.1：1，在0.1-77之间可以铺出来，但效果不如0.5-3之间。
优选地，步骤(S4)对材料表面进行预处理，可根据材料的不同选择不同的预处理方式。例如玻璃片，可以在玻璃片表面旋涂一层聚苯乙烯(PS)起到辅助固定效果(如用2.5g/mL PS的甲苯溶液滴加在1cm直径的玻璃片上旋涂。旋涂条件包括：第一阶段：800rpm、3s；第二阶段：1700rpm、7s)。
优选地，在材料表面加一个限制溶液滴加区域的遮挡装置，比如密封圈(O型圈)，材质为PDMS或PS等。对其形状和材质不作限定，只要是可以将溶液限制在所需材料表面不外溢的装置即可。将混合胶体颗粒悬浊液滴加至材料表面所圈区域内，使混合溶液液面形成负曲率状态，干燥去遮挡后在材料表面得到涂层(如图2)。
优选地，步骤(S5)的干燥采用自然蒸发法进行干燥，将滴加胶体颗粒的材料静置自然挥发干燥(无风状态)，保证滴加胶体颗粒的表面水平。在干燥过程中，通过毛细现象和布朗运动引发胶体颗粒在材料表面的规则排列。
步骤(S6)的固定可以根据材料的不同选取不同的固定方法，优选采用加热固定，例如当基材为玻璃片时，在表面涂层彻底干燥后将玻璃片在加热板上加热固定，优选加热温度为110-130℃，例如110℃、120℃或130℃，加热时间为1-20min，例如1min、2min、5min、10min、15min或20min，优选为1-5min。可以根据有机高分子胶体颗粒的材质不同和最终所需效果的不同选取合适的加热温度及时间，例如，有机高分子胶体颗粒为0.4μm的PS，加热温度在120℃，加热1min可保留有机高分子颗粒(小颗粒)形貌，加热时间为20min有机高分子颗粒(小颗粒)全部融化仅剩无机颗粒(大颗粒)的形貌。同理，若当基材为高分子材料例如(聚对苯二甲酸类塑料)PET时，固定方法可选用使用有机溶剂固定。优选使用甲苯与乙醇的混合溶液(甲苯：乙醇体积比为1：2-1：4)滴加在表面1-20s，优选为2-5s。
优选地，步骤(S7)中的进一步修饰方式例如为在步骤(S1)化学修饰的无机胶体颗粒形成的表面的已经化学修饰的基团的基础上进一步引发聚合，即以化学修饰的无机胶体颗粒的修饰基团继续作为聚合反应的引发点，进行聚合反应，包括但不限于巯基-烯烃反应、环氧基-氨基反应或叠氮-炔烃反应等。
通过采取组装前无机胶体颗粒的修饰以及组装后对于修饰官能团的针对性修饰的策略，扩大了胶体颗粒自组装的应用范围，可灵活选择修饰基团和修饰顺序(组装前修饰还是组装后修饰)，对于一些电性高的化学基团和一些活性蛋白可以选择组装后修饰，因为电性高的化学基团如果提前修饰将会影响自组装的形貌，而活性蛋白组装前修饰，在之后的固定过程中会有失活的风险。该示例性的材料的表面改性方法能简单快速地构建具有多重化学的微纳米界面涂层，扩大了胶体颗粒自组装构建微纳米界面的使用范围：即可以同时将多种化学官能团在自组装前嫁接于胶体颗粒表面，并且这些官能团也可用于组装后再反应。
根据本发明的第二个方面，提供了一种材料，采用上述材料的表面改性方法对材料的表面进行改性。
经过本发明方法改性后的材料表面不仅具有多级物理微纳米结构，而且具有一定的化学性质，可以实现表面化学的区域多样性，扩大了材料改性后界面的应用范围。
根据本发明的第三个方面，提供了一种上述材料在微生物或细胞培养中的应用。
本发明方法改性后的材料表面进行微生物或细胞培养，证实了该表面确实能够影响微生物或细胞的粘附行为，可用于体外微生物和细胞培养，调控微生物和细胞的生长行为，模拟生物界面行为。
根据本发明的第四个方面，提供了一种医疗产品，包括上述材料。
此材料可具有抗菌贴附与允许细胞贴附的特性，为生医材料表面抗菌提供有用的资讯。
医疗产品包括但不限于微生物或细胞培养工具或医疗材料(例如医药抗菌材料)等。
包含本发明改性后材料的医疗产品具有与上述材料相同的优势，对材料表面进行针对性改性，并根据改性后材料表面的物理化学性质，可将材料作为医疗培养工具或材料去使用。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。本发明涉及的各原料均可通过商购获取。
实施例1制备粒径5μm的SiO2-NH2,SiO2-Epoxy(表面带有环氧丙基的二氧化硅微球),SiO2-RGD,SiO2-Br和粒径5μm的SiO2-SBMA
(1)将50mg粒径5μm SiO2球与5mL无水四氢呋喃(THF)加入圆底烧瓶中，通过反复超声，震荡使微球颗粒分散形成均匀的悬浊液；在悬浊液稳定搅拌下加入200μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷，并维持搅拌让其反应24h；反应结束后将混合液转移至离心管中将微球通过离心收集，用THF和酒精分别将微球清洗三次后加热至100℃固定3h，得到SiO2-NH2；
(2)将50mg粒径5μm SiO2球与5mL无水THF加入圆底烧瓶中，通过反复超声，震荡使微球颗粒分散形成均匀的悬浊液；在悬浊液稳定搅拌下加入200μL三乙氧基(3-环氧丙基氧丙基)硅烷，并维持搅拌让其反应24h；反应结束后将混合液转移至离心管中将微球通过离心收集，用无水甲苯和酒精分别将微球清洗三次后加热至100℃固定3h，得到SiO2-Epoxy；
(3)将9mg RGD(5mM)多肽溶解于1.8mL 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲溶液中(pH＝5.5)，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC(160mM)和N-羟基琥珀酰亚胺NHS(80mM)分别加入溶液溶解后置于37℃水浴中搅拌，活化15分钟。之后将(1)中所得SiO2-NH2颗粒(10mg)通过反复震荡超声均匀分散在200μL MES缓冲溶液后加入上述混合溶液并维持稳定搅拌，维持37℃反应24h；反应结束后将混合液转移至离心管中将微球通过离心收集，用去离子水将微球清洗3次后常温干燥，所得产物为SiO2-RGD；
(4)将SiO2-NH2通过反复震荡超声在圆底烧瓶中均匀分散至4mL无水二氯甲烷(DCM)内，加入0.3mL三乙胺并将反应体系放至冰上搅拌15min；缓慢滴入0.2mL(用1mL DCM稀释)溴代异丁酰溴；维持反应体系在冰上反应2h后，常温继续反应22h；反应结束后将混合液转移至离心管中将微球通过离心收集，用DCM和丙酮分别将微球清洗3次后常温干燥，所得产物为SiO2-Br；
(5)将所得产物(SiO2-Br)通过反复震荡超声在圆底烧瓶中均匀分散至5mL水:甲醇＝1:1的混合溶液中，加入2.4g[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(SBMA)搅拌并通氮气除氧20min；于此同时在另一个圆底烧杯中在始终通氮气的情况下将220mg 2’2-联吡啶52mg溴化亚铜(CuBr)溶解于5mL水:甲醇＝1:1的混合溶液中，待完全溶解，溶液呈深红棕色时将此混合液在氮气保护下转移至含有SiO2-Br微球的溶液中，通氮气搅拌两分钟后加入0.2mL抗坏血酸溶液(50mg/mL)并将反应容器密封，在油浴锅中加热至60℃反应12h；反应结束后将混合液转移至离心管中将微球通过离心收集，用80℃去离子水，甲醇和常温去离子水分别将微球清洗三次后常温干燥。所得产物为SiO2-SBMA。
实施例2制备粒径2μm的SiO2-Br和粒径2μm的SiO2-SBMA
步骤(1)采用粒径2μm SiO2球，其余步骤与实施例1相同。
将实施例1和实施例2合成的胶体颗粒SiO2-NH2、SiO2-Br和SiO2-SBMA均通过XPS扫描验证，结果如表1所示。
表1 XPS元素扫描结果(atom％)
Figure BDA0002041442290000161
表1结果表明，相对于SiO2，SiO2-NH2样品中氮元素的出现可以证明氨基的接枝成功；SiO2-Epoxy样品中相比于SiO2样品碳元素与氧元素的比值的增加证明了少量环氧基的接入(测试的SiO2的碳元素与氧元素的比值为0.16，SiO2-Epoxy为0.47，而环氧基单体中两元素比值为2.4，证明少量环氧基的接入，并且膜厚度小于10nm，多出的氧元素信号来自于基底)；SiO2-RGD样品中氮元素的含量相比于SiO2-NH2中氮元素的含量明显增加证明了RGD的接枝成功；同理，SiO2-Br样品(无论5μm还是2μm)中Br元素的出现以及SiO2-SBMA中硫元素和氮元素且硫元素与氮元素比值接近1，均证明了各自反应的成功。
实施例3
一种玻璃片的表面改性方法，包括以下步骤：
(1)将实施例1的5μm的SiO2-Br颗粒与水混合，超声、震荡后形成质量百分浓度10％微球均匀分散的SiO2-Br颗粒悬浊液；
(2)将0.4μm的PSC(羧基化的聚苯乙烯)颗粒与水混合，超声、震荡后形成质量百分浓度10％微球均匀分散的PSC颗粒悬浊液；
(3)以5μm SiO2-Br和0.4μm PSC形成直径为1mm的圆形涂层为例，计算悬浊液加入量：
5μm SiO2-Br微球为单层平铺，胶体SiO2-Br投影面积为19.625μm2，SiO2-Br颗粒密度为2g/cm3，所需涂层面积为0.79cm2，SiO2-Br颗粒悬浊液质量百分浓度为10％，SiO2-Br颗粒体积为65μm3，代入公式(1)中计算得出构成单层SiO2-Br颗粒涂层所需SiO2-Br颗粒悬浊液的体积V为4.97μL；
0.4μm PSC微球为多层平铺，总高度须达到SiO2-Br微球颗粒的直径，故，所需层数＝SiO2-Br微球半径/PSC微球直径，即6层，同理，胶体PSC投影面积为0.126μm2，PSC颗粒本身密度为1.19g/cm3，所需涂层面积为0.79cm2，PSC颗粒悬浊液质量百分浓度为10％，PSC颗粒体积为0.033μm3，代入公式(1)计算得出构成单层颗粒涂层所需PSC颗粒悬浊液的体积为0.24μL，故所需0.4μm PSC颗粒悬浊液总体积为1.42μL；
将SiO2-Br颗粒悬浊液与PSC颗粒悬浊液混合，并通过震荡，超声得到混合胶体颗粒悬浊液；
(4)在玻璃片表面旋涂2.5g/mL的PS的甲苯溶液，旋涂条件：第一阶段：800rpm、3s；第二阶段：1700rpm、7s)，表面放密封圈遮挡，将混合胶体颗粒悬浊液滴加至密封圈内，使液面形成负曲率状态；
(5)无风状态下静置自然挥发干燥；
(6)将玻璃片在加热板上加热固定，加热温度为120℃，加热时间为10min，表面形成涂层。
实施例4
本实施例与实施例3的区别在于，将5μm的SiO2-Br颗粒替换为实施例1中5μm的SiO2-SBMA颗粒。
实施例5
本实施例与实施例3的区别在于，将5μm的SiO2-Br颗粒替换为实施例2中2μm的SiO2-Br颗粒，将0.4μm的PSC颗粒替换为0.1μm的PSC颗粒。
实施例6
本实施例与实施例5的区别在于，将2μm的SiO2-Br颗粒替换为实施例2中2μm的SiO2-SBMA颗粒。
实施例7
本实施例与实施例3的区别在于，将5μm的SiO2-Br颗粒替换为实施例2中5μm的SiO2-RGD颗粒。
实施例8
本实施例与实施例3的区别在于，将5μm的SiO2-Br颗粒替换为实施例2中5μm的SiO2-Epoxy颗粒。
实施例9
本实施例与实施例3的区别在于，将0.4μm的PSC颗粒替换为0.4μm的PMMA颗粒。
实施例10
本实施例在实施例3的基础上，还包括步骤(7)对涂层中含有SiO2-Br胶体颗粒的表面进一步修饰SBMA(如图3中A，即两种颗粒自组装，组装后仅有大颗粒表面具有修饰高分子刷)，具体包括：
将表面放置于可密封的平底容器中并通氮气将空气置换出来，在平底容器中，加入2.4g SBMA到5mL水:甲醇＝1:1的混合溶液中，搅拌并通氮气除氧20min；于此同时在另一个圆底烧杯中在始终通氮气的情况下将220mg 2’2-联吡啶和52mg溴化亚铜(CuBr)溶解于5mL水:甲醇＝1:1的混合溶液中，待完全溶解，溶液呈深红棕色时将此混合液在氮气保护下将两溶液混合，通氮气搅拌2min后加入0.2mL后转移至样品放置的容器中，使带有SiO2-Br的表面完全浸没在反应溶液中(反应溶液根据容器大小等比增加或减少)，加入抗坏血酸溶液(50mg/mL)并将反应容器密封；将容器置于60℃烘箱中反应12h；反应结束后将溶液移除，用80℃去离子水，甲醇和常温去离子水分别将表面清洗3次后常温干燥。
实施例3和实施例10改性后表面的水接触角和XPS扫描图如图4-图5所示。
从图4-图5中可以看出，改性后表面在嫁接SBMA单体反应前后水接触角从113°下降至26°。X射线光电子能谱(XPS)N1s扫描结果也可以看出，反应后SBMA中特征性的季铵基官能团特征峰出现(-N+)，证明了实施例10在实施例3的基础上SBMA单体嫁接成功。
实施例11
本实施例与实施例3的区别在于，将0.4μm的PSC颗粒替换为体积比1:1的0.4μm的PSC颗粒和0.4μm的PMMA颗粒的组合，保持有机胶体颗粒悬浊液中无机胶体颗粒总量不变。
实施例12
本实施例与实施例10的区别在于将实施例3中，5μm的SiO2-Br颗粒替换为体积比2:8的5μm的SiO2-Br颗粒和实施例1中5μm的SiO2颗粒的组合，保持无机胶体颗粒悬浊液中无机胶体颗粒总量不变，后续反应步骤不变(如图3中B，即三种颗粒自组装后结果，在组装前将修饰和未修饰的颗粒预混合，在组装后只有部份大颗粒表面具有修饰高分子刷)。
从图4中可以看出，改变组装前颗粒配比后再进行反应后水接触角从113°下降至42°但未达到实施例10中的26°。证明了SBMA的嫁接是区域性的。
对比例1
本实施例与实施例3的区别在于，将5μm的SiO2-Br颗粒替换为5μm的SiO2颗粒。
对比例2
本实施例与实施例5的区别在于，将2μm的SiO2-Br颗粒替换为2μm的SiO2颗粒。
对实施例3-实施例6自组装后形成的表面进行SEM观察，结果如图6所示，从图6中可以看出，通过SEM证实了本发明胶体颗粒具备自组装能力，表面形成微纳米结构。
试验例1细菌粘附试验
分别使用大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌PAO1(带荧光质粒)在实施例4、6以及对比例1、2自组装后形成的表面进行2小时粘附试验。
试验方法：
取10μ在-80℃冻存的菌液于Luria-Bertani培养基(LB培养基)上划线培养。第二天从中取3-5处菌落，加入放有50mL LB液体培养基的150mL锥形瓶中，置于37℃恒温摇床摇动培养(120r/min)18h，获得菌液用LB培养液稀释至1.0×108/mL(吸光度值约为A600＝0.1)，再将此菌液用LB培养液稀释10倍(即最终细菌浓度为1.0×107/mL)使用。将样品表面放置于24孔板内(此批样品直径14mm)，修饰后的表面向上，每孔加入1mL菌液后放入37℃恒温孵箱静置培养两小时。两小时候将样品取出，用PBS清洗3遍，去除为黏附的细胞，对于PAO1，由于细菌自带绿色荧光，清洗后直接用显微镜观察，大肠杆菌的样品将被置于新的24孔板内，每孔加入1mL2.5％的戊二醛水溶液固定15分钟，之后用去离子水清洗一次，每孔加入0.3mL 1.3μg/mL碘化丙锭溶液(PI)染色15分钟。染色完成后用去离子水清洗3次，通过倒置荧光显微镜(奥林巴斯)观察结果。
测试表面：玻璃片，5SiO2：对比例1自组装后形成的表面；5SiO2-SBMA：实施例4自组装后形成的表面；5SiO2-ATRP：实施例10化学修饰后行成的表面；2SiO2：对比例2自组装后形成的表面；2SiO2-SBMA：实施例6自组装后形成的表面；结果如图7-图8所示。
从图7-图8中可以看出，所有嫁接SBMA的材料均发现了细菌数量的减少，(对于大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌，其修饰后表面细菌粘附量分别为未修饰的34％和50％。)侧面证明了SBMA分子的嫁接无论是在组装前还是在自组装后进行均是可行的并可以影响细菌的粘附行为。
试验例2细胞粘附及生长试验
使用小鼠前成骨细胞(MC 3T3)在对比例1及实施例4自组装后形成的表面进行细胞爬片试验。
试验方法：细胞接种步骤，细胞培养密度达到约80-90％左右，取出细胞培养皿，至无菌操作台内，弃旧培养基；加入约5mL PBS晃洗2次；添加适量0.25％胰酶消化细胞，37℃培养箱内放置2分钟，显微镜下观察细胞呈圆球状脱落，加入新鲜培养基8mL终止消化；吸管吹打部分没有完全脱的细胞，转移细胞溶液至15mL离心管，1100rpm离心3三分钟，弃上层废液，加入4-5mL新鲜培养基吹打混匀底层细胞；使用细胞计数板，计算细胞总数量。
将样品表面放置于24孔板内(此批样品直径14mm)，修饰后的表面向上，按5×103每孔接种细胞于材料表面。培养24小时及72小时后(每24小时更换一次新鲜培养基)，使用4％多聚甲醛固定细胞15分钟。使用F-actin和DAPI分别对细胞骨架和细胞核进行染色20分钟。每孔使用1mL PBS溶液清洗3次后使用荧光显微镜观察结果。
结果如图9所示。图9中测试样品分别为：玻璃片，5SiO2：对比例1自组装后形成的表面；5SiO2-SBMA：实施例4自组装后形成的表面；5SiO2-ATRP：实施例10化学修饰后行成的表面；2SiO2：对比例2自组装后形成的表面；2SiO2-SBMA：实施例6自组装后形成的表面细胞培养24小时后细胞骨架染色的结果。
从图10统计的结果可以看出，相比于玻璃片自组装的材料对于MC 3T3细胞一天粘附的面积和细胞形状均有所改变，但对于修饰SBMA和未修饰SBMA的样品差异不大。
图11中测试样品分别为：玻璃片，5SiO2：对比例1自组装后形成的表面；5SiO2-SBMA：实施例4自组装后形成的表面；5SiO2-ATRP：实施例10化学修饰后行成的表面；2SiO2：对比例2自组装后形成的表面；2SiO2-SBMA：实施例6自组装后形成的表面细胞培养三天后细胞骨架染色的结果及细胞活性CCK-8检测结果。
从图12中可看出经过三天的培养，5SiO2-ATRP样品表面细胞数目和活性相较其它表面明显减少，而在组装前修饰SBMA的样品表面细胞数目和细胞活性相比于未修饰样品无明显变化。
可见，本发明通过采用化学修饰的无机胶体颗粒与有机高分子胶体颗粒自组装，能够做出同时具有多种物理和化学性质的表面，细菌和细胞的反应证明了这种表面确实实现了，并对细胞细菌贴附增值有影响。对于研究细菌细胞对于界面物理化学刺激的反应能提供一个良好的平台。
试验例1与例2目的不是选出哪种修饰或者表面是好的，仅意在说明本发明可简单快捷的制备出具有想要物理化学性质的表面，可应用于细菌与细胞行为的研究。比如结合本试验例1及例2中结果可发现实施例6与对比例2表面相比，虽然细菌粘附数量减少，但并未影响细胞的粘附与增值，以此两种表面为基础可以进行细菌抗粘附机理的研究。再比如实施例4与实施例10的样品虽然表面均有SBMA且均可减少细菌粘附但对于细胞增值的却有不同的影响。以此两种表面为基础可以进行材料表面对于细胞增值影响的研究。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种材料的表面改性方法，其特征在于，包括以下步骤：
在材料表面通过胶体颗粒自组装的方法形成涂层；
其中，胶体颗粒包括无机胶体颗粒和有机高分子胶体颗粒，全部或部分所述无机胶体颗粒经过化学修饰，化学修饰包括化学官能团修饰和/或生物活性分子修饰；所述无机胶体颗粒的粒径为1-10μm，所述有机高分子胶体颗粒的粒径为0.05-0.75μm；
优选地，自组装采用蒸发诱导法。
2.按照权利要求1所述的材料的表面改性方法，其特征在于，所述无机胶体颗粒包括金属氧化物微球和/或非金属氧化物微球，优选包括SiO2微球、TiO2微球或ZnO微球中的一种或几种，进一步优选为SiO2微球；
优选地，所述化学修饰包括一类或几类不同的化学修饰；
优选地，化学官能团包括卤素、氨基、甲基丙稀酰乙基磺基甜菜碱、巯基、环氧基、丙烯酰基或叠氮基团中的一种；
优选地，生物活性分子包括具有RGD序列的短肽、多肽、化学小分子、抗生素或生长因子中的一种。
3.按照权利要求1所述的材料的表面改性方法，其特征在于，所述有机高分子胶体颗粒包括修饰与未修饰的聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、壳聚糖微球、聚己内酯微球、聚二甲基硅氧烷微球、明胶微球、聚乳酸微球，聚丙烯酸微球中的一种或几种；
优选地，所述有机高分子胶体颗粒是经过化学修饰的，优选所述有机高分子胶体颗粒为羧基化的聚苯乙烯微球。
4.按照权利要求1所述的材料的表面改性方法，其特征在于，无机胶体颗粒和有机高分子胶体颗粒的直径比为4-200：1，优选为4-100：1。
5.按照权利要求1-4任一项所述的材料的表面改性方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)对无机胶体颗粒进行化学修饰，得到化学修饰的无机胶体颗粒，将化学修饰的无机胶体颗粒与水混合，得到无机胶体颗粒悬浊液；
(b)将有机高分子胶体颗粒与水混合，得到有机高分子胶体颗粒悬浊液；
(c)将无机胶体颗粒悬浊液与有机高分子胶体颗粒悬浊液混合，得到混合胶体颗粒悬浊液；
(d)将混合胶体颗粒悬浊液滴加至材料表面，或将材料表面浸入混合胶体颗粒悬浊液中；干燥和固定后得到涂层；
(e)对涂层中的经过化学修饰的无机胶体颗粒的修饰基团上进行化学修饰，得到表面改性后的材料。
6.按照权利要求5所述的材料的表面改性方法，其特征在于，步骤(a)中的化学修饰方式包括自由基聚合、阴离子聚合或阳离子聚合中的一种，优选包括以下聚合反应的任意一种：
(i)原子转移自由基聚合；
(ii)单电子转移自由基聚合；
(iii)可逆加成-断裂链转移聚合；
优选地，步骤(e)中的进一步修饰方式包括表面引发聚合，包括巯基-烯烃反应、环氧基-氨基反应或叠氮-炔烃反应。
7.按照权利要求5所述的材料的表面改性方法，其特征在于，
优选地，步骤(c)中混合胶体颗粒悬浊液中无机胶体颗粒总体积与有机高分子胶体颗粒总体积之比为0.1-77，优选为0.5-3；
优选地，步骤(d)中干燥采用自然蒸发；
优选地，步骤(d)中固定采用加热固定，优选加热温度为110-200℃，加热时间为1-20min，优选为1-5min。
8.一种材料，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的材料的表面改性方法对所述材料的表面进行改性。
9.一种权利要求8所述的材料在微生物或细胞培养中的应用。
10.一种医疗产品，其特征在于，包括权利要求8所述的材料；
优选地，所述医疗产品包括微生物或细胞培养工具；
优选地，所述医疗产品包括生物医药抗菌材料。
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