CN114642634A - 一种透血脑屏障载药胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种透血脑屏障载药胶束及其制备方法和应用，所述透血脑屏障载药胶束包括由GM1水解产物共价修饰的PLGA形成的胶束和包载于所述胶束中的药物；所述药物为中枢神经***疾病治疗药物。本发明所涉及的透血脑屏障载药胶束不仅能实现透血脑屏障药物递送，还可在不引入其他神经损伤修复药物和材料的情况下，实现抗肿瘤和神经修复的联合给药目的，实现中枢神经药物递送和神经功能改善的双重作用，避免了过多的药物、材料组织积蓄和潜在毒性，具有预防或治疗胶质瘤和其他中枢神经***疾病的巨大潜力。

Description

一种透血脑屏障载药胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种透血脑屏障载药胶束及其制备方法和应用。
背景技术
胶质瘤是中枢神经***最常见的原发性恶性肿瘤，具有高度侵袭性和极差的预后。传统肿瘤手术切除由于其浸润和侵袭性从而受到极大的限制。同时，由脑毛细血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞周足等通过紧密连接构成的血脑屏障***，在防止有毒物质入侵大脑的同时也阻止了大部分药物入脑，使得胶质瘤以及许多的中枢***疾病(如帕金森病和阿尔茨海默病等)的治疗药物在应用中受到限制。因此，设计能协助药物高效透过血脑屏障，且有效到达病灶的安全载体是胶质瘤和颅内疾病治疗的重要研究方向。
目前，血脑屏障的策略主要包括侵入性和非侵入性，但大多数侵入性方法存在潜在的神经损伤和颅内感染的风险。随着纳米技术的发展，非侵入性透血脑屏障的纳米载体的颅内给药得到了快速发展。但值得注意的是大多数纳米材料存在脑组织内不可降解积聚、或降解代谢途径不明确等问题，且纳米材料繁琐的制备过程中还存在安全性和稳定性问题。
尽管越来越多的透血脑屏障给药***被开发用于胶质瘤和脑部疾病治疗，如：脂质体、聚合物/无机材料纳米粒、树状大分子等材料的纳米载体、自组装胶束等。但目前构成前述给药***的载体材料的有效性、安全性、大规模制备可行性和稳定性仍有待进一步提高和明确，且大多载体材料处于实验室研究阶段，临床转化较为困难。因此，迫切需要寻找新的方法来提高药物载体的透血脑屏障效率，同时具有极好的生物安全性和稳定性。
单唾液酸四己糖神经节苷脂(Monosialotetrahexosylganglioside，GM1)含有亲水性糖链和亲脂性神经鞘胺醇和脂肪酸结构，是哺乳动物神经节苷脂的主要种类。GM1在神经发生、神经细胞生长和分化中起着不可或缺的作用，可以促进受损神经元的存活，现有研究大多聚焦于GM1的神经修复功能评价。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种透血脑屏障载药胶束及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种透血脑屏障载药胶束，所述透血脑屏障载药胶束包括由GM1水解产物共价修饰的PLGA形成的胶束和包载于所述胶束中的药物；所述药物为中枢神经***疾病治疗药物。
本发明所涉及的透血脑屏障载药胶束不仅能实现透血脑屏障药物递送，还可在不引入其他神经损伤修复药物和材料的情况下，实现抗肿瘤和神经修复的联合给药目的，实现中枢神经药物递送和神经功能改善的双重作用，避免了过多的药物、材料组织积蓄和潜在毒性，具有预防或治疗胶质瘤和其他中枢神经***疾病的巨大潜力。本发明以阿霉素为抗肿瘤模型药物，通过胶质瘤模型在体评价试验得到该透血脑屏障载药胶束具有非常优秀的抗胶质瘤效应和神经功能改善效应，本发明为胶质瘤和其他中枢神经***疾病的非侵入性药物递送提供了一种颇具转化应用前景的新策略。
优选地，所述中枢神经***疾病治疗药物包括阿霉素、雷帕霉素、紫杉醇、多西他赛、羟基喜树碱、异长春花碱、金刚烷胺或卡巴拉汀中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述中枢神经***疾病包括胶质瘤、垂体瘤、脑膜瘤、脑卒中、帕金森或阿尔茨海默中的任意一种。
本发明所涉及的透血脑屏障载药胶束可用于预防或治疗包括胶质瘤、垂体瘤、脑膜瘤、脑卒中、帕金森和阿尔茨海默等在内的中枢神经***疾病。
优选地，所述GM1水解产物共价修饰的PLGA是由单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物通过酰胺键连接得到的；所述单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002842321180000031
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的数均分子量为6-12kDa，例如6kDa、8kDa、10kDa或12kDa等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
进一步优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸中乳酸结构单元与羟基乙酸结构单元的摩尔比为(50-80):(20-50)，其中(50-80)中的具体点值可以选择50、60、70、75或80等，其中(20-50)中的具体点值可以选择20、30、40或50等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的透血脑屏障载药胶束的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将GM1水解产物共价修饰的PLGA溶液滴加至正在搅拌的水溶液中，形成空白胶束；
(2)将药物溶液滴加至正在搅拌的空白胶束溶液中，静置，透析，得到所述透血脑屏障载药胶束。
本发明所涉及的透血脑屏障载药胶束的制备方法操作相对简单，适用于工业化生产，颇具转化应用前景。
优选地，步骤(1)所述GM1水解产物共价修饰的PLGA溶液的溶剂包括二甲基甲酰胺、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、氯仿或乙酸乙酯中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(1)所述溶液的浓度为4-40mg/mL，例如4mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选10-14mg/mL。
上述GM1水解产物共价修饰的PLGA溶液的浓度特定选择为4-40mg/mL是因为该条件下能使最终制备得到的透血脑屏障载药胶束的载药量和包封率更高，10-14mg/mL是效果更佳的范围。
优选地，步骤(1)所述滴加的速率为10-100μL/min，例如10μL/min、20μL/min、40μL/min、50μL/min、60μL/min或100μL/min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选40-60μL/min。
优选地，步骤(1)所述水溶液的体积为2-40mL，例如2mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL或40mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选2-10mL。
上述水溶液的体积特定选择为2-40mL是因为该条件下能使最终制备得到的透血脑屏障载药胶束的载药量和包封率更高，2-10mL是效果更显著的范围。
优选地，步骤(2)所述药物溶液的溶剂包括二甲基甲酰胺、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、氯仿或乙酸乙酯中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(2)所述药物溶液的浓度为1-30mg/mL，例如1mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、20mg/mL或30mg/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选2-8mg/mL。
上述药物溶液的浓度特定选择为1-30mg/mL是因为此条件能使最终制备得到的透血脑屏障载药胶束的载药量和包封率更高，2-8mg/mL是效果更显著的范围。
优选地，步骤(2)所述滴加的速率为10-100μL/min，例如10μL/min、20μL/min、40μL/min、50μL/min、60μL/min或100μL/min等，优选40-60μL/min。
优选地，步骤(2)所述静置的温度为2-8℃，例如2℃、4℃、8℃等，时间为18-30h，例如18h、24h或30h等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述透析使用的透析袋截留分子量为8000Da，透析时间为65-96h，例如65h、72h、80h、90h或96h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述透析后再用孔径0.45μm膜过滤样品。
在本发明中，所述GM1水解产物共价修饰的PLGA的制备方法包括如下步骤：
(1’)将式(Ⅰ)所示的单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物、PLGA、三丁胺和1-羟基苯并***混合后在15-37℃下进行反应1-3h；
(2’)将步骤(1’)得到的反应液滴入预冷蒸馏水，形成胶体状沉淀即所述GM1水解产物共价修饰的PLGA。
具体地，上述水解产物与PLGA的摩尔比为1:(0.2-0.4)，例如1:0.2、1:0.3或1:0.4等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
上述水解产物与1-羟基苯并***的摩尔比为1:(1.6-2.0)，例如1:1.6、1:1.8或1:2.0等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
上述水解产物与三丁胺的摩尔比为1:(1.2-1.8)，例如1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7或1:1.8等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
上述反应的温度为15-37℃，例如15℃、20℃、24℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃或37℃等；反应的时间为1-3h，例如1h、2h或3h等；上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
上述预冷蒸馏水的温度为2-8℃，例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明中，所述式(Ⅰ)所示的单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物的制备方法包括如下步骤：
(S1)将GM1与含有30-40mM醋酸钠、0.3-0.5％牛磺脱氧胆酸水合物、50-150mM氯化钙的pH＝5.5-6.0的缓冲溶液混合，搅拌溶解；
(S2)将水解酶SCDase与步骤(S1)得到的溶液混合，于30-40℃下振荡反应10-15h，离心，取上清液冷冻干燥，得到所述式(Ⅰ)所示的单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物。
所述醋酸钠的浓度可以为30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM或40mM等；醋酸钠浓度的过高或过低都会降低单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解效率，在上述浓度范围内其水解效率是最优的。
所述牛磺脱氧胆酸水合物在缓冲溶液中的质量百分含量可以为0.3％、0.38％、0.4％、0.42％、0.45％或0.5％等。
所述氯化钙的浓度可以为50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM或150mM等。
所述缓冲溶液的pH值可以为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0等，pH值可以用冰醋酸进行调节。
所述反应的温度可以为30℃、32℃、35℃、38℃或40℃等。
所述反应的时间可以为10h、11h、12h、13h、14h或15h等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
更具体地，上述离心的转速为10000-14000r/min，例如10000r/min、11000r/min、12000r/min、13000r/min或14000r/min等；离心的时间为3-6min，例如3min、4min、5min或6min等；上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的透血脑屏障载药胶束在制备预防或治疗中枢神经***疾病的药物中的应用。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的透血脑屏障载药胶束在制备预防或治疗颅内肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述颅内肿瘤为胶质瘤。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的透血脑屏障载药胶束不仅能实现透血脑屏障药物递送，还可在不引入其他神经损伤修复药物和材料的情况下，实现抗肿瘤和神经修复的联合给药目的，实现中枢神经药物递送和神经功能改善的双重作用，避免了过多的药物、材料组织积蓄和潜在毒性，具有预防或治疗胶质瘤和其他中枢神经***疾病的巨大潜力。本发明以阿霉素为抗肿瘤模型药物，通过胶质瘤模型在体评价试验得到该透血脑屏障载药胶束具有非常优秀的抗胶质瘤效应和神经功能改善效应，本发明为胶质瘤和其他中枢神经***疾病的非侵入性药物递送提供了一种颇具转化应用前景的新策略。
附图说明
图1是实施例2制得的空白胶束的粒径表征图；
图2是实施例2制得的透血脑屏障载药胶束的粒径表征图；
图3是实施例2制得的空白胶束的Zeta电位表征图；
图4是实施例2制得的透血脑屏障载药胶束的Zeta电位表征图；
图5是DOX在二甲基甲酰胺溶液中的标准曲线；
图6是实施例11中观察小鼠各个器官组织的DiR荧光分布与荧光强度的小动物活体成像图；
图7是实施例12中激光共聚焦显微镜观察斑马鱼脑部的荧光分布情况的结果图；
图8是实施例13中各组C6胶质瘤荷瘤小鼠的生存曲线图；
图9是实施例13中各组C6胶质瘤荷瘤小鼠的神经行为评分图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例所涉及的昆明小鼠购于重庆医科大学；Wistar大鼠购于北京维通利华实验动物有限公司；斑马鱼(flk1：GFP)由重庆大学生物工程学院血管植入物国家地方联合工程实验室提供；其他试验所需的试剂和原料均可通过市售途径购买得到。
实施例1
本实施例制备GM1水解产物共价修饰的PLGA，方法如下：
(1)称取适量的醋酸钠、牛磺脱氧胆酸水合物、氯化钙于烧杯中，加入一定量的三蒸水充分溶解，配制成含35mM NaOAc、0.4％TDC、100mM CaCl2缓冲溶液，并用冰醋酸溶液调节pH至5.8；
(2)称取100mg GM1粉末置于烧杯中，加入20mL上述缓冲液体系，充分搅拌溶解；
(3)充分溶解后转移至50mL离心管中，加入15μL水解酶SCDase，置于恒温(37℃)振荡箱中振荡反应12h；
(4)12000转/分离心5分钟，取上清液；
(5)将制备的水解液经冷冻干燥处理后得到絮状固体，即GM1水解产物；
(6)将50mg GM1水解产物转移至10mL的无水二甲基甲酰胺中溶解，再称量1g PLGA固体，加入后充分搅拌使其完全溶解；
(7)称取10.6mg HOBt加入到上述体系，并小心加入15.3μL三丁胺溶液，25℃下剧烈搅拌反应2h，GM1水解产物与HOBt、三丁胺、PLGA的摩尔比为1:1.8:1.5:0.3；
(8)将反应液缓慢滴加到4℃蒸馏水中，形成胶体状沉淀，用蒸馏水反复洗涤，固体冷冻干燥，得到所述GM1水解产物共价修饰的PLGA。
实施例2
本实施例制备一种透血脑屏障载药胶束，方法如下：
(1)精密天平准确称取由实施例1制得的GM1水解产物共价修饰的PLGA，将其溶解在2.5mL二甲基甲酰胺中，浓度为12mg/mL；
(2)用注射泵将步骤(1)得到的溶液以50μL/min的速度缓慢滴加到正在搅拌的5mL超纯水中，形成空白胶束，将空白胶束在4℃冰箱储存24h，备用；
(3)避光条件下将DOX·HCI粉末溶解于3mL的二甲基甲酰胺溶液中，浓度为5mg/mL；添加三乙胺(三乙胺与DOX·HCI的摩尔比为3:1)搅拌18h，除去盐酸；
(4)用注射泵将脱盐酸后的DOX溶液以50μL/min的速度缓慢滴加到正在搅拌的步骤(2)所制空白胶束溶液中；
(5)溶液于4℃冰箱静置24h，随后转移至透析袋(MWCO：8000)透析72h，除去多余的DOX和DMF等有机溶剂；
(6)用孔径为0.45μm膜过滤器过滤步骤(5)所得溶液，得到所述透血脑屏障载药胶束(记为PLGA-LysoGM1/DOX胶束)。
实施例3
本实施例制备一种透血脑屏障载药胶束，方法与实施例2的区别仅在于步骤(1)中GM1水解产物共价修饰的PLGA的浓度为8mg/mL，其他条件均保持不变。
实施例4
本实施例制备一种透血脑屏障载药胶束，方法与实施例2的区别仅在于步骤(1)中GM1水解产物共价修饰的PLGA的浓度为16mg/mL，其他条件均保持不变。
实施例5
本实施例制备一种透血脑屏障载药胶束，方法与实施例2的区别仅在于步骤(2)中超纯水的体积为20mL，其他条件均保持不变。
实施例6
本实施例制备一种透血脑屏障载药胶束，方法与实施例2的区别仅在于步骤(2)中超纯水的体积为30mL，其他条件均保持不变。
实施例7
本实施例制备一种透血脑屏障载药胶束，方法与实施例2的区别仅在于步骤(3)中DOX·HCI溶液的浓度为1mg/mL，其他条件均保持不变。
实施例8
本实施例制备一种透血脑屏障载药胶束，方法与实施例2的区别仅在于步骤(3)中DOX·HCI溶液的浓度为12mg/mL，其他条件均保持不变。
实施例9
对实施例2制得的空白胶束和透血脑屏障载药胶束进行粒径分析和表面电荷分析：使用动态光散射仪(DLS)表征胶束的粒径和表面电荷，并使用Zetasizer(Nano ZS90，Malvern)通过DLS测量胶束尺寸和Zeta电位，设定仪器参数：透射率为1.57，温度为25℃。结果如图1-图4所示，由图可知：载药前后的平均尺寸分别为110nm(图1)和246.8nm(图2)；电位测量显示表面带负电荷分别为-34.9mV(图3)、-33.2mV(图4)。
实施例10
对实施例2-8制得的透血脑屏障载药胶束进行载药量和包封率的测定：
(1)将DOX粉末溶于二甲基甲酰胺溶液中，并稀释成多个浓度梯度，采用紫外分光光度法绘制DOX在二甲基甲酰胺溶液中的标准曲线，如图5所示，回归方程为：y＝0.021x-0.0089，R2＝0.9999，说明在10μg/mL-45μg/mL浓度范围内，DOX的浓度与吸光度值线性关系良好。
(2)测定载药量和包封率：
量取一定体积的PLGA-LysoGM1/DOX胶束溶液冷冻干燥，记录干燥胶束的重量，加入适量二甲基甲酰胺溶液，搅拌使DOX释放到二甲基甲酰胺溶液中，紫外检测该溶液的吸光度，参照标准曲线计算出胶束中的DOX含量，从而得出胶束的载药量和包封率。
结果如表1所示：
表1
Figure BDA0002842321180000121
由表1数据可知：本发明研究发现药物浓度、共聚物浓度和水相体积均会显著影响本发明所涉及的载药胶束的载药量和包封率，其中在实施例2所示的工艺条件配合下，载药胶束的载药量和包封率指标相对最优，其载药量为3.8％，包封率为61.6％。
实施例11
本实施例采用小动物成像***观察本发明所涉及的透血脑屏障载药胶束进入体内后药物的分布情况：按照实施例2中的方法将药物替换为荧光素DiR，用相同负载方式装载荧光素DiR，制得PLGA-LysoGM1/DiR胶束。
脱去小鼠表面的毛发，健康昆明小鼠按照25μg/只的计量尾部静脉注射0.5mL浓度为50μg/mL的游离DiR溶液、PLGA/DiR纳米粒溶液和PLGA-LysoGM1/DiR胶束溶液，于1、2、4、6、8、24h放入活体成像仪的暗箱平台中，分别拍摄明场下的背景图和暗场下小鼠体内自发特异光子DiR的荧光图，曝光时间400sm，采集780-900nm处的焚光信号，将暗场与明场的背景图叠加后可以直观显示动物体内DiR的分布部位和强度。可以根据小动物活体成像仪下观察和记录小鼠各个器官组织的DiR荧光分布与荧光强度，并评价PLGA-LysoGM1/DiR胶束透BBB的情况。其中PLGA/DiR纳米溶液的制备方式为：将40mg PLGA与4.3mg DiR溶解在2.5mL二甲基甲酰胺中，用注射泵将溶解后的溶液以50μL/min的速度缓慢滴加到正在搅拌的5mL水溶液中，得到PLGA/DiR纳米粒溶液。然后，于4℃冰箱静置24h后转移至透析袋(MWCO：8000)透析24h，以除去残余的DiR和二甲基甲酰胺。最后，用0.45μm孔径的过滤器过滤，并将PLGA/DiR溶液储存于4℃冰箱，备用。
结果如图6所示：注射DiR后可在肝脏中观察到DiR荧光信号的聚集；在注射PLGA/DiR纳米粒后，可观察到与DiR相同的趋势，但在8h和24h时脑中也观察到少量DiR荧光信号；而注射PLGA-LysoGM1/DiR胶束后，整个监测期间可以在小鼠脑中观察到DiR荧光信号，且随着时间的延长，脑部的荧光信号不断增强。该实验结果说明了PLGA-LysoGM1/DiR胶束能透过血脑屏障并将DiR递送到脑部。
实施例12
本实施例采用斑马鱼评价本发明所涉及的透血脑屏障载药胶束的透血脑屏障效应：在注射实验的前5天配鱼(flk1：GFP)，第二天收集胚胎并单独饲养。在斑马鱼受精96小时后，滴加适量的0.4％的鱼安定麻醉剂将斑马鱼麻醉，然后将斑马鱼心脏朝着微量注射器的方向在琼脂糖槽中排列整齐，备用。用拉针仪拉针准备注射用的玻璃毛细针，将拉好的毛细针在显微镜下用手术刀片开口，安放进注射仪器中，将待注射的游离DOX溶液，PLGA/DOX纳米溶液和本发明所涉及的透血脑屏障载药胶束溶液(其中PLGA/DiR纳米溶液的制备方式同实施例11)，吸入玻璃毛细针中开始注射。将针尖刺入斑马鱼心脏中，每条鱼注射量为10nL。将注射完毕的斑马鱼移至载玻片上，头皮朝上，脑部摆正并对称，并用融化后的1％的琼脂糖固定斑马鱼并滴加适量含有0.4％鱼安定麻药小鱼水，最后放上干净的盖玻片。分别在注射后20min时，用激光共聚焦显微镜观察斑马鱼脑部的荧光分布情况。
结果如图7所示：游离的DOX溶液始终局限在脑血管中而无法渗出，并且在PLGA/DOX纳米颗粒的对照组中，具有非常少量DOX穿透血管。相比之下，透血脑屏障载药胶束组，明显有大量DOX荧光渗出血管聚集在脑实质中，说明了本发明所涉及的透血脑屏障载药胶束能透过血脑屏障，与小动物成像实验结果相一致。
实施例13
本实施例探究本发明所涉及的透血脑屏障载药胶束对胶质瘤的抑制效应，方法如下：
建立大鼠C6胶质瘤模型：将C6胶质瘤细胞培养至80％融合度，用0.25％胰蛋白酶消化，收集消化液，离心后去除上清液，加入1mL细胞培养液吹打均匀后制成细胞悬液，吸取10μL细胞悬浮液滴加到细胞计数仪计数，保证细胞悬液浓度为1×105/10μL，置于37℃恒温细胞培养箱中待接种。术前大鼠禁食不禁水12h，注射10％水合氯醛到大鼠腹腔内(3mL/kg)，麻醉后用立体定位仪固定头部，两耳针深入外耳道对称固定，剃去头顶毛发，酒精消毒后，手术刀沿头部正中矢状线纵向剪开头皮，分离膜层暴露顶骨。根据大鼠头部立体定位解剖图谱确定前囟点并做好标记，种瘤坐标位点即以前囟为原点，前囟前1.0cm，中线右侧3.0cm，标记位点。采用颅骨钻垂直钻孔，深达膜，但不刺破硬膜，骨孔直径扩大成约1.0mm的小孔。用微量注射器吸取20μL C6细胞悬浮液后，垂直固定于立体定位仪上，经骨孔中心进针达硬膜下6.0mm后再退针1mm，注射速度为1μL/min，为使细胞得以充分扩散到大脑中，留针5min。再以1μL/min的速度缓慢拔针后，用无菌骨蜡封闭骨孔，再用无菌缝合线缝合头皮，切口消毒，保温饲养。
于C6细胞种瘤后第8天、11天、14天给药：(1)游离DOX溶液(3mg/kg)；(2)PLGA-LysoGM1/DOX胶束溶液；(3)GM1溶液(与胶束组GM1浓度一致)；(4)PLGA/DOX纳米粒(制备方式同实施例11)；(5)对照组(生理盐水)。以生存时间(天)为横坐标，大鼠生存百分数为纵坐标绘制各组大鼠的Kaplan-Meier生存曲线。鉴于胶质瘤的神经损伤是压力、缺血缺氧、化疗药物和放射性毒性等的综合损伤，而该综合损伤会以荷瘤个体的神经行为整体表现。进一步引入Garcia神经行为评定法每天观察和记录荷瘤大鼠的神经行为变化，其评定内容包括自主活动、四肢对称性、前肢，金属丝鼠笼攀缘，刺激双侧躯干反应，触须反应测试等，其评分为3至18分。
大鼠生存曲线如图8所示，由图可知：生理盐水组、DOX溶液、GM1溶液组、PLGA/DOX纳米粒组和PLGA-lysoGM1/DOX胶束组使荷瘤大鼠的中位生存时间分别为15.6、21.4、27.7、23.7和138.4天，其中以PLGA-lysoGM1/DOX胶束组的大鼠生存时间最长，证实了PLGA-lysoGM1胶束可有效将抗肿瘤药物递送至颅内发挥药效，显著延长荷瘤大鼠生存时间。
神经行为结果如图9所示，由图可知：生理盐水组、DOX溶液组、GM1溶液组、PLGA/DOX纳米粒组和PLGA-lysoGM1/DOX胶束组在注射后的前13天，荷瘤大鼠的神经评分保持至少10分，且各组差异不大。15天后，各组神经评分出现明显差异：生理盐水处理的荷瘤大鼠在死亡前显示出显著的神经损伤，其神经评分最低，仅为3分。相比而言，DOX溶液组和PLGA/DOX纳米粒组的大鼠神经评分高于生理盐水组，死亡前的神经评分为5分。GM1溶液组，由于GM1神经节苷脂具有促受损神经功能恢复的作用，其神经评分要稍高于上述实验组。相比之下，PLGA-lysoGM1/DOX胶束组的神经评分为最高，特别是在15至35天期间，大鼠的神经评分可维持在12分左右；虽然在35天后，神经评分有所下降，但对比其他组，神经评分仍然显著性提高，为7分左右。
上述实验结果表明PLGA-lysoGM1/DOX载药胶束不仅能实现透血脑屏障药物递送，有效抑制肿瘤的生长，延长荷瘤大鼠生存时间，还可在不引入其他神经损伤修复药物和材料的情况下，实现抗肿瘤和神经修复的联合给药目的，显著提高胶质瘤大鼠生存状态。进一步证实了PLGA-lysoGM1胶束具有治疗胶质瘤和其他中枢神经***疾病的巨大潜力。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种透血脑屏障载药胶束及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种透血脑屏障载药胶束，其特征在于，所述透血脑屏障载药胶束包括由GM1水解产物共价修饰的PLGA形成的胶束和包载于所述胶束中的药物；所述药物为中枢神经***疾病治疗药物。
2.如权利要求1所述的透血脑屏障载药胶束，其特征在于，所述中枢神经***疾病包括胶质瘤、垂体瘤、脑膜瘤、脑卒中、帕金森或阿尔茨海默中的任意一种；
优选地，所述中枢神经***疾病治疗药物包括阿霉素、雷帕霉素、紫杉醇、多西他赛、羟基喜树碱、异长春花碱、金刚烷胺或卡巴拉汀中的任意一种或至少两种的组合。
3.如权利要求1或2所述的透血脑屏障载药胶束，其特征在于，所述GM1水解产物共价修饰的PLGA是由单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物与聚乳酸-羟基乙酸共聚物通过酰胺键连接得到的；所述单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002842321170000011
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的数均分子量为6-12kDa；
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸中乳酸结构单元与羟基乙酸结构单元的摩尔比为(50-80):(20-50)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的透血脑屏障载药胶束的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将GM1水解产物共价修饰的PLGA溶液滴加至正在搅拌的水溶液中，形成空白胶束；
(2)将药物溶液滴加至正在搅拌的空白胶束溶液中，静置，透析，得到所述透血脑屏障载药胶束。
5.如权利要求4所述的透血脑屏障载药胶束的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述GM1水解产物共价修饰的PLGA溶液的溶剂包括二甲基甲酰胺、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、氯仿或乙酸乙酯中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(1)所述溶液的浓度为4-40mg/mL，优选10-14mg/mL；
优选地，步骤(1)所述滴加的速率为10-100μL/min，优选40-60μL/min；
优选地，步骤(1)所述水溶液的体积为2-40mL，优选2-10mL。
6.如权利要求4或5所述的透血脑屏障载药胶束的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述药物溶液的溶剂包括二甲基甲酰胺、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、氯仿或乙酸乙酯中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(2)所述药物溶液的浓度为1-30mg/mL，优选2-8mg/mL；
优选地，步骤(2)所述滴加的速率为10-100μL/min，优选40-60μL/min；
优选地，步骤(2)所述静置的温度为2-8℃，时间为18-30h；
优选地，步骤(2)所述透析使用的透析袋截留分子量为8000Da，透析时间为65-96h；
优选地，步骤(2)所述透析后再用孔径0.45μm膜过滤样品。
7.如权利要求4所述的透血脑屏障载药胶束的制备方法，其特征在于，所述GM1水解产物共价修饰的PLGA的制备方法包括如下步骤：
(1’)将式(Ⅰ)所示的单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物、PLGA、三丁胺和1-羟基苯并***混合后在15-37℃下进行反应1-3h；
(2’)将步骤(1’)得到的反应液滴入预冷蒸馏水，形成胶体状沉淀即所述GM1水解产物共价修饰的PLGA。
8.如权利要求7所述的透血脑屏障载药胶束的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅰ)所示的单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物的制备方法包括如下步骤：
(S1)将GM1与含有30-40mM醋酸钠、0.3-0.5％牛磺脱氧胆酸水合物、50-150mM氯化钙的pH＝5.5-6.0的缓冲溶液混合，搅拌溶解；
(S2)将水解酶SCDase与步骤(S1)得到的溶液混合，于30-40℃下振荡反应10-15h，离心，取上清液冷冻干燥，得到所述式(Ⅰ)所示的单唾液酸四己糖神经节苷脂的水解产物。
9.如权利要求1-3中任一项所述的透血脑屏障载药胶束在制备预防或治疗中枢神经***疾病的药物中的应用。
10.如权利要求1-3中任一项所述的透血脑屏障载药胶束在制备预防或治疗颅内肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述颅内肿瘤为胶质瘤。
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