CN114617876B - 一种抗肿瘤联合用药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多西紫杉醇与利非西呱联合用的药物，它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的利非西呱和多西紫杉醇。本发明证实多西紫杉醇与利非西呱具有协同增效抗肿瘤作用，尤其对三阴乳腺癌的发展、转移具有很好的抑制作用，为三阴乳腺癌的临床治疗提供了新的选择。

Description

一种抗肿瘤联合用药物
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗肿瘤联合用药物。
背景技术
三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer，TNBC)是一种以局部表现为主的全身性疾病，临床多采用手术治疗结合辅化疗的综合治疗模式，尽管TNBC对辅助化疗有一定反应率，但总体预后仍然很差，且转移仍是绝大多数TNBC治疗失败和死亡的主要原因。研究表明，HIF-1α在TNBC中高表达，通过多种途径促进肿瘤的发展与生存，与TNBC的不良预后和转移密切相关。因此，可通过靶向HIF-1α的治疗来降低TNBC的侵袭性，提高TNBC 的治疗效果。
HIF-1α过度表达导致肿瘤发生过程中的血管生成、转移、抗凋亡和许多其他促肿瘤反应。HIF-1α是抗瘤药物开发中一个很有前途的靶点，可以提高患者对化疗和放疗的反应，提高肿瘤患者的生存率。并且，高达1％的基因对缺氧敏感，靶向HIF-1α的抑制剂可能是一种良好的临床候选抗癌药物。尽管目前临床上还没有HIF-1α抑制剂，但在过去的十年中，人们已经在寻找有效的HIF-1α抑制剂方面做出了大量的努力。利非西呱(Lificiguat，YC-1) 虽然发现时是作为血小板聚集和血管收缩抑制剂，但随后发现YC-1在 HIF-1α合成和稳定上具有抑制作用，能够通过抑制HIF-1α而抑制肿瘤的生长和侵袭转移，使YC-1成为有潜力的抗肿瘤药物之一。但是，TNBC的进展速度快，仅依靠单一的HIF-1α抑制剂进行治疗尚不足够，有必要进一步结合化疗等辅助治疗手段。DTX属于紫杉类抗瘤药物，是TNBC的一线化疗药物之一，能够促进微管蛋白组装成微管并抑制其解聚，从而将细胞阻滞在 G2/M期，诱导肿瘤细胞的有丝***灾难。
然而，YC-1与DTX联合使用对TNBC治疗的效果还未见现有技术报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DTX与YC-1联合使用，协同抗瘤的新药物，为TNBC治疗提供临床新选择。
本发明提供了一种抗肿瘤联合用药物，它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的利非西呱和多西紫杉醇。
进一步地，上述利非西呱和多西紫杉醇的摩尔比为(5～4800):1。
更进一步地，上述利非西呱和多西紫杉醇的摩尔比为5.3:1、4800:1、 4000:1、3200:1、2600:1、1500:1或1000:1。
进一步地，它是以所述利非西呱和多西紫杉醇为活性成分，加上药学上可接受的载体和/或辅料制备而成的，用于同时或者分别给药的利非西呱制剂和多西紫杉醇制剂。
更进一步地，上述利非西呱制剂和多西紫杉醇制剂为液体制剂，所述利非西呱制剂和多西紫杉醇制剂的浓度比为：(15～100)μM：(3.13～100)nM，优选为100μM:100nM、75μM:50nM、65μM:25nM、40μM:12.50nM、25 μM:6.25nM或15μM:3.13nM。
更进一步地，上述制剂是以利非西呱和多西紫杉醇为活性成分，加上药学上可接受的载体和辅料制备而成的液体制剂；
所述制剂含有：利非西呱与药学上可接受的载体制备而成的利非西呱载药体系，以及多西紫杉醇与药学上可接受的载体制备成的多西紫杉醇载药体系；
所述利非西呱载药体系含有如下结构：
所述多西紫杉醇载药体系含有如下结构：
其中，n、y、x的比例为(85～130)：(2.5～9)：(0.5～0.9)。
更进一步地，上述利非西呱载药体系由Mal-GFLG-OH和利非西呱反应制得Mal-GFLG-YC-1后，再与PEG2000-SH反应制得；
所述Mal-GFLG-OH与利非西呱的摩尔比为(1.1～1.3):1，优选为1:1.1；所述Mal-GFLG-YC-1与PEG2000-SH的摩尔比为(1.1～1.3):1，优选为1:1.1。
更进一步地，上述多西紫杉醇载药体系由Mal-GFLG-OH与多西紫杉醇反应合成Mal-GFLG-DTX后，再与Mal-Cy5.5和HT-SH-1反应而成；所述 Mal-GFLG-OH与多西紫杉醇的摩尔比为(1.1～1.3):1，优选为1:1.3；所述 Mal-GFLG-DTX、Mal-Cy5.5和HT-SH-1的摩尔比为1:(0.08～0.1):(1.1～1.5)，优选为1:0.085:1.5。
所述Mal-GFLG-OH的结构为：所述PEG2000-SH 的结构为:所述Mal-Cy5.5的结构为：
所述HT-SH-1-1由HT-PySS-1在还原剂的作用下还原反应制得，所述 HT-PySS-1是TA-2CTA、MA-PySS及MA-PEG500反应制备而成，所述 TA-2CTA、MA-PySS及MA-PEG500的摩尔比为 (0.02～0.03):(0.2～0.3):(3.2～3.3)，优选为0.0286:0.25:3.281。
所述TA-2CTA的结构为：
所述MA-PySS的结构为：
所述MA-PEG500的结构为：
优选地，上述方法制备的利非西呱载药体系经硅胶柱层析纯化，并经 0.22μm滤膜过滤；和/或上述方法制备的多西紫杉醇载药体系经3.5kDa透析袋透析。
更进一步地，上述利非西呱载药体系与多西紫杉醇载药体系的摩尔比为 (1000～182250):1，优选为：1000:1、2250:1、5850:1、14850:1、36450:1、85050:1 或182250:1。
更进一步地，上述制剂是液体制剂，所述利非西呱载药体系与多西紫杉醇载药体系的浓度比为(25～100)μM:(0.14～100)nM，优选为100μM:100nM、75μM:33.33nM、65μM:11.11nM、55μM:3.70nM、45μM:1.23nM、35 μM:0.41nM或25μM:0.14nM。
本发明还提供了上述联合用药物在防治乳腺癌的药物中的用，优选地，所述药物为防治三阴乳腺癌的药物。
更进一步地，上述防治乳腺癌的药物是抑制乳腺癌细胞生长和/或抑制乳腺癌转移的药物。
本发明的有益效果：本发明首次将多西紫杉醇与利非西呱联合使用，证明了二者联合用药具有协同增效抗肿瘤作用，尤其对三阴乳腺癌的发展、转移具有很好的抑制作用，为三阴乳腺癌的临床治疗提供了新的选择。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为DTX与YC-1联用CI值分布(A)常氧条件；(B)缺氧条件。
图2为HT-DTX与PEG-YC-1联用CI值分布。
图3为(A)药物处理后，细胞内JC-1单体或多聚体的荧光,(B)对红绿荧光进行统计,(C)绿光(JC-1单体)与红光(JC-1多聚体)比值的定量分析(标尺：20μm)。
图4为经不同药物处理(对照组不处理，DTX 5nM，YC-1 50μM,DTX 5nM+YC-1 50μM)后，MDA-MB-231细胞的凋亡情况。
图5为药物处理后，细胞内JC-1单体或多聚体的荧光。线粒体膜电位正常时，JC-1以多聚体形式存在发红色荧光。线粒体膜电位降低，JC-1以单体的形式存在发绿光(标尺：20μm)。
图6为HT-DTX与PEG-YC-1联用后细胞凋亡情况。
图7为治疗过程中荷瘤小鼠体重的变化。
图8为治疗结束后，每组荷瘤小鼠的重要脏器的H&E染色病理分析。
图9为荷瘤小鼠肺组织H&E染色病理分析(标尺：200μm)。
图10为各种药物制剂的体内抗瘤效果。(A)肿瘤照片，(B)肿瘤重量及(C)TGI*P<0.05；**P<0.01。
具体实施方式
除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本发明部分原料参照文献方法合成，TA-2OH(Tay C Y,Setyawati M I, Leong DT.Nanoparticle Density:A Critical Biophysical Regulator of EndothelialPermeability[J].ACS Nano,2017,11(3):2764-2772.)，MA-PySS(Setyawati M I, Tay CY,Chia S L,et al.Titanium dioxide nanomaterials cause endothelial cellleakiness by disrupting the homophilic interaction of VE-cadherin[J].NatCommun, 2013,4:1673.)及PEG2000-Sac(Setyawati M I,Tay C Y,Bay B H,et al.GoldNanoparticles Induced Endothelial Leakiness Depends on Particle Size andEndothelial Cell Origin[J].ACS Nano,2017,11(5):5020-5030.)。MA-PEG500预先经过柱层析纯化以去除阻聚剂。
细胞培养：
人源TNBC细胞系MDA-MB-231细胞株在完全培养基(含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基)中培养。常氧培养箱：置于内含5％CO2和20％O2湿润的37℃恒温细胞培养箱中；缺氧培养箱：置于内含5％CO2和1％O2的三气培养箱内培养。
实施例1、利非西呱(YC-1)与多西紫杉醇(DTX)联用协同指数 (CombinationIndex，CI)测定
消化MDA-MB-231细胞至单细胞悬液，调整浓度为3×104/mL，向96孔板每孔中加入100μL单细胞悬液，分别置于常氧培养箱和缺氧培养箱内，继续培养使细胞贴壁。待96孔板内细胞长至50％左右时，吸除旧的培养基，加入含有各种比例药物(YC-1:100μM,75μM,65μM,40μM,25μM,15 μM；DTX:100nM,50nM,25nM,12.50nM,6.25nM,3.13nM；YC-1+DTX: 100μM+100nM,75μM+50nM,65μM+25nM,40μM+12.50nM,25μM +6.25nM,15μM+3.13nM)的培养基，继续孵育24h。吸除旧的培养基，加入100μL含有10％CCK-8的无血清培养基，放入孵箱中孵育1h。用酶标仪测取OD 450值，采用Chou-Talalay法计算CI值。
结果如图1所示，图1A为常氧状态下，各浓度YC-1和DTX联合用药的协同指数分布，可以看出，常氧条件下YC-1与DTX联合用药的CI值均小于1，说明YC-1与DTX具有协同效应。
图1B为缺氧状态下，各浓度YC-1和DTX联合用药的协同指数分布，可以看出，YC-1与DTX联合用药的CI值均小于1，说明YC-1与DTX具有协同效应。
实施例2、利非西呱载药体系与多西紫杉醇载药体系的制备及其协同指数测定
1、利非西呱载药体系PEG-YC-1的制备
PEG2000-SAc(约2g)粗品溶于5mL DCM中，加入至200mL叔甲醚中析出，抽滤。如此反复纯化3次，真空干燥。处理后的PEG2000-SAc(约 1g)及DTT(0.30g)置于反应瓶中，置换氮气，加入20mL 2.0M的氨-甲醇溶液，室温搅拌12h。反应液倒入约150mL叔甲醚中，析出灰白色固体，离心倾倒出清液。加入少量DCM溶解，叔甲醚洗涤3次，真空干燥得0.85g 灰白色固体(PEG2000-SH)。
Mal-GFLG-YC-1的合成：反应瓶在抽真空状态下用热风枪烘烤，置换氮气，冷至室温后加入Mal-GFLG-OH(1.00g，1.1eq)及YC-1(0.51g，1.0eq)，置换氮气，加入12mL干燥的DCM溶解，冰浴冷却，加入DIC(0.6mL，2.3eq)，加入溶于1mL干燥的DCM的DMAP(11.3mg，0.055eq)，冰浴下搅拌1h，升至室温搅拌3h，点板显示反应已完全，旋干过柱，DCM：甲醇＝30：1，得纯产物1.05g，收率75.5％。
PEG2000-SH(0.31mg，1.0eq)及Mal-GFLG-YC-1(0.13g，1.1eq) 置于反应瓶中，加入含有5μL DIEA的5mL DCM溶解，室温搅拌过夜。过柱，DCM：甲醇＝20:1→15:1→12:1→10:1，旋干后用5mL纯水溶解，0.22μm 滤膜过滤，冻干，得0.24g灰白色固体，即利非西呱载药体系PEG-YC-1。
各原料结构及反应式如下：
2、多西紫杉醇载药体系HT-DTX的制备
(1)链转移剂TA-2CTA的合成：TA-2OH(0.20g，1.00eq)，CTA-COOH (0.61g，2.10eq)及DMAP(14mg，0.11eq)置于反应瓶中，冰浴冷却下加入10mL DCM溶解，加入DIC(0.60mL，3.70eq)，冰浴下搅拌2.5h，旋干过柱，PE：EA＝3：1，得红色粘油534mg，收率71.8％。
(2)Mal-GFLG-DTX的合成：反应瓶在抽真空状态下用热风枪烘烤，置换氮气，冷至室温后加入Mal-GFLG-OH(0.57g，1.0eq)及DTX(1.09g， 1.3eq)，置换氮气，加入15mL干燥的DCM溶解，冰浴冷却，加入DIC(0.5 mL，3.0eq)，加入溶于1mL干燥的DCM的DMAP(6.4mg，0.05eq)，冰浴下搅拌2h，升至4℃搅拌16h，旋干过柱，DCM：甲醇＝20：1，得纯产物0.59g，收率42.5％。
(3)HT-DTX的合成：TA-2CTA(20.6mg，0.0286mmol)，MA-PySS (63.5mg，0.250mmol)及MA-PEG500(1629.5mg，3.281mmol)置于反应瓶中，加入1mL二氧六环溶解，加入7.5mLVA044的甲醇/水溶液(32.8mg VA044溶于10mL水，加入30mL甲醇)，加入的VA044为0.0190mmol，密封。Ar鼓泡40min，水封，放入预热的45℃油浴中搅拌24h。油浴中取出，开封，置于液氮中冷冻，回至室温，3.5kDa透析袋纯水透析，冻干得 1.51g粉红色油(HT-PySS-1)。
HT-PySS-1(0.69mg)溶于8mL水中，加入DTT(1.00g)，室温搅拌过夜。3.5kDa透析袋纯水透析，冻干，得0.66g浅橙色油(HT-SH-1)。
0.11g聚合物HT-SH-1(SH基团含量为0.0159mmol，1.0eq)溶于1mL DMSO中，室温搅拌下加入溶于0.2mL DMSO的Mal-Cy5.5(1.00mg，0.00135 mmol，0.085eq)，室温搅拌过夜。加入溶于0.2mL DMSO的Mal-GFLG-DTX (31.7mg，0.0238mmol，1.5eq)，室温搅拌过夜。使用3.5kDa透析袋在水中透析，冻干，得0.12g蓝色油，即为多西紫杉醇载药体系HT-DTX。
反应式如下：
经表征，得到的HT-DTX中，各嵌段的重复单元数比例n：y：x为 (85～130)：(2.5～9)：(0.5～0.9)。
3、PEG-YC-1与HT-DTX联用协同指数(Combination Index，CI)测定
消化MDA-MB-231细胞至单细胞悬液，调整浓度为3×104/mL，向96孔板每孔中加入100μL单细胞悬液，置于常氧培养箱内继续培养使细胞贴壁。待96孔板内细胞长至50％左右时，吸除旧的培养基，加入含有不同比例药物的培养基(PEG-YC-1:100μM,75μM,65μM,55μM,45μM,35μM,25μM； HT-DTX:100nM,33.33nM,11.11nM,3.70nM,1.23nM,0.41nM,0.14nM；PEG-YC-1+HT-DTX:100μM+100nM,75μM+33.33nM,65μM+11.11 nM,55μM+3.70nM,45μM+1.23nM,35μM+0.41nM,25μM+0.14 nM)，继续孵育24h。吸除旧的培养基，加入100μL含有10％CCK-8的无血清培养基，放入孵箱中孵育1h。用酶标仪测取OD 450值，采用Chou-Talalay 法计算CI值。
结果如图2所示，可以看出各组浓度组合的PEG-YC-1与HT-DTX联用后的CI值均小于1，说明YC-1与DTX与药物载体制备成制剂后，二者仍具有协同抗肿瘤作用。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、YC-1与DTX联合抗瘤研究
1、实验方法
(1)线粒体膜电位检测
将MDA-MB-231细胞种植于20mm共聚焦培养皿内，细胞数量为1×104/ 皿，将培养皿分为2组，置于常氧培养箱培养，使细胞充分贴壁。使用不同浓度的药物(对照组：新鲜培养基；YC-1 50μM；DTX 5nM；YC-1 50μM+ DTX 5nM)处理细胞24h。按照JC-1检测试剂盒中实验方法进行染色。完成染色后，使用激光共聚焦显微镜下观察：检测JC-1单体绿色荧光时采用观察GFP时的设置(激发波长483nm，发射波长536nm)；检测JC-1聚合物红色荧光时采用观察Cy3时的设置(激发波长561nm，发射波长670nm)。
(2)细胞凋亡检测
按照1×105/孔的数量分别将MDA-MB-231细胞接种到6孔板中，培养箱内培养至细胞生长融合至铺满皿底50％；将培养皿分为2组，分别置于常氧培养箱和缺氧培养箱内培养，使细胞充分贴壁。分别用相应浓度药物(对照组：新鲜培养基；YC-1 50μM；DTX 5nM；YC-150μM+DTX 5nM)处理细胞48h。收集孔内细胞(同时收集悬浮死细胞)，按照Annexin V/PI凋亡试剂盒说明进行染色，室温下避光孵育30min。1200rpm离心5min收集细胞，用PBS清洗细胞2次。使用适量PBS重悬细胞，迅速通过流式细胞仪进行检测。使用“Flowjo”软件分析结果。
2、实验结果
ROS的生成会造成线粒体膜电位的降低，膜电位的降低改变了膜的通透性导致细胞色素C等凋亡分子流出，是细胞发生凋亡的早期事件，于是利用JC-1线粒体膜电位荧光探针检测YC-1(50μM)、DTX(5nM)分别单独使用和联用时线粒体膜电位的变化。结果如图3所示：5nM DTX不会明显降低线粒体膜电位(P＞0.05)，而YC-1在50μM时可以降低线粒体膜电位(P ＜0.01)，这与YC-1促进肿瘤细胞生成ROS的结果相符合；与单药相比，两药联合后线粒体膜电位显著降低(P＜0.01)。该结果证实DTX与YC-1联用能够协同促进肿瘤细胞的凋亡。
线粒体膜电位降低是凋亡过程中最早发生的事件之一，为了进一步验证 DTX与YC-1联用能够协同促进肿瘤细胞的凋亡，进一步检测了不同药物处理后细胞的凋亡状况，结果如图4，可以看出DTX与YC-1联用组细胞的凋亡率明显升高。
综上所述，YC-1与DTX在细胞水平上具有协同抗瘤作用，二者联用后协同促进了肿瘤细胞的凋亡。
实验例2、PEG-YC-1与HT-DTX联合制剂在细胞水平的协同机制验证
1、实验方法
(1)细胞增殖毒性
消化细胞至单细胞悬液，调整浓度为3×104/mL。向96孔板最外一周的孔内加入100μL PBS，其余孔内均加入100μL细胞悬液，置于37摄氏度常氧培养箱中孵育过夜。待96孔板内细胞长至50％左右时，吸除旧的培养基，加入含有不同浓度各种药物继续孵育24h。吸除旧的培养基，加入100μL 含有10％CCK-8试剂的无血清培养基，放入孵箱中孵育1h。用酶标仪测取 OD450值。细胞存活率(cell viability)均采用以下公式进行计算：
Cell viability(％)＝(ODt-OD0)/(ODc-OD0)×100％
式中，ODt：实验组吸光度；OD0：空白组吸光度；ODc：对照组吸光度。
(2)线粒体膜电位检测
将MDA-MB-231细胞种植于直径20mm的共聚焦培养皿内，细胞数量为1×104/皿，置于培养箱培养使细胞充分贴壁。使用不同浓度的药物(Control：完全培养基，DTX 5nM；YC-150μM；DTX 5nM+YC-1 50μM；HT-DTX 5 nM；PEG-YC-1 50μM；HT-DTX 5nM+PEG-YC-1 50μM)处理细胞。按照 JC-1检测试剂盒中实验方法进行染色。完成染色后，使用激光共聚焦显微镜下观察：检测JC-1单体绿色荧光时采用观察GFP时的设置(激发波长483 nm，发射波长536nm)；检测JC-1聚合物红色荧光时采用观察Cy3时的设置(激发波长561nm，发射波长670nm)。
(3)细胞凋亡检测
按照1×105/孔的数量分别将MDA-MB-231细胞接种到6孔板中，培养箱内培养至细胞生长融合至铺满皿底50％，分别用相应浓度药物(Control：完全培养，DTX 5nM；YC-1 50μM；DTX 5nM+YC-1 50μM；HT-DTX 5nM； PEG-YC-1 50μM；HT-DTX 5nM+PEG-YC-1 50μM)处理细胞48h。收集孔内细胞(同时收集悬浮死细胞)，按照Annexin V/PI凋亡试剂盒说明进行染色，室温下避光孵育30min。1200rpm离心5min收集细胞，用PBS清洗细胞2次。使用适量PBS重悬细胞，迅速通过流式细胞仪进行检测。使用“Flowjo”软件分析结果。
2、实验结果
通过JC-1法检测了线粒体膜电位的变化，以评估早期凋亡的发生情况。结果如图5，HT-DTX与PEG-YC-1联合后线粒体膜电位明显降低，证明两药联合后早期凋亡事件增多。流式细胞术检测细胞凋亡的结果(图6)与之相符合，进一步证实了HT-DTX与PEG-YC-1协同促进肿瘤细胞的凋亡。
实验例3、PEG-YC-1与HT-DTX联合制剂体内抗瘤研究
原位TNBC模型建立：收集MDA-MB-231细胞，调整浓度至5×107/mL；选取6-8周，雌性Balb/c裸鼠，用***麻醉；用胰岛素针吸取100μL细胞混悬液，选取小鼠左侧第4对***为注射点，用碘伏消毒后，将细胞混悬液缓慢注入。
当荷瘤小鼠体积达到约50mm3时，将荷瘤小鼠平均分为7组(saline组、游离DTX5mg/Kg组、游离YC-1 10mg/Kg组、游离DTX 5mg/Kg+游离 YC-1 10mg/Kg组；HT-DTX 5mg/Kg(DTX当量)组；PEG-YC-1 10mg/Kg (YC-1当量)组；HT-DTX 5mg/Kg(DTX当量)+PEG-YC-110mg/Kg(YC-1 当量)组，换算后为利非西呱和多西紫杉醇的摩尔比为5.3:1)，n＝5。每4天尾静脉注射一次相应的药物，共计给药4次。每3天一次测量并记录小鼠的体重、肿瘤大小，治疗第一天即测量的第一天。当小鼠体重下降超过20％，或肿瘤最长直径大于12mm，或肿瘤出现溃疡或坏死时，视为小鼠死亡。治疗结束后，使用小动物Micro CT对荷瘤小鼠肺部进行扫描。采用颈椎脱臼法将小鼠处死并进行解剖，收集其主要脏器和肿瘤组织，用4％多聚甲醛充分固定，并进行H&E染色，同时对剥离后的肿瘤进行拍照记录并称重，按照以下公式计算TGI：
TGI(％)＝(Wc-Wt)/Wc×100
式中，Wc：对照组的平均瘤重，Wt：实验组的平均瘤重。
(1)生物安全性分析
在治疗过程中通过检测小鼠的体重变化来评估化疗药物的毒性。如图7 所示，在治疗过程中，并未观察到荷瘤小鼠体重明显下降，仅在游离DTX 与DTX+YC-1联用组观察到了轻度的体重降低，考虑是DTX的毒副作用。但在后期，小鼠体重有逐渐恢复的趋势，说明荷瘤小鼠能够耐受这种副作用，这符合我们将DTX用药剂量制定为5mg/Kg的预期。为了进一步了解高分子给药***的生物安全性，我们对荷瘤小鼠的重要器官进行了H&E染色分析。结果如图8所示，各治疗组荷瘤小鼠的重要脏器心、肝、脾和肾均未观察到病理损伤，证实了给药***具有生物安全性。
(2)抑制肿瘤转移
虽然，在H&E染色分析中没有观察到药物对重要脏器产生毒性损伤，但是在一些治疗组(生理盐水组和单药治疗组)的肺部观察到了转移瘤病灶(图9)。游离药物联合治疗组(YC-1+DTX)与高分子给药***联用组 (PEG-YC-1+HT-DTX)的肺组织中均未发现转移瘤病灶，说明YC-1与DTX 联用后抑制了肿瘤的转移，进一步与药物载体制备成给药制剂同样可以抑制肿瘤转移。
更进一步地，除H&E染色病理分析外，生理盐水对照组的肺部Micro CT 扫描结果观察到了不同程度的斑片状或是条索状的异常密度影，而 PEG-YC-1+HT-DTX联合给药组在肺部Micro CT扫描结果也为观察到异常；综合分析上述结果，说明DTX与YC-1联用，具有高生物安全性，能够有效抑制肿瘤的转移。
(3)体内抗瘤效果
在对各治疗药物进行安全性分析时，我们已经证实了细胞毒性化疗药物联合HIF-1α抑制剂能够抑制肿瘤的转移。接下来，我们考察了联合治疗对原位肿瘤的治疗效果。从治疗结束后原位瘤的体积(图10)和重量来看，无论是两种游离药物(YC-1+DTX)的联用，还是两种高分子药物(PEG- YC-1+HT-DTX)的联用，其肿瘤体积和重量均比单药治疗组小，说明联合化疗的效果优于单药化疗，证实YC-1与DTX或HT-DTX与PEG-YC-1 均具有体内协同抗瘤作用。
综上所述，本发明提供了一种多西紫杉醇与利非西呱联合用的药物，证实了多西紫杉醇与利非西呱具有协同增效抗肿瘤作用，尤其对三阴乳腺癌的发展、转移具有很好的抑制作用，为三阴乳腺癌的临床治疗提供了新的选择。

Claims (10)

1.一种联合用药物在制备防治三阴乳腺癌的药物中的用途，其特征在于，所述联合用药物为相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的利非西呱和多西紫杉醇。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述利非西呱和多西紫杉醇的摩尔比为(5～4800):1。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述利非西呱和多西紫杉醇的摩尔比为5.3:1、4800:1、4000:1、3200:1、2600:1、1500:1或1000:1。
4.如权利要求1～3任一项所述的用途，其特征在于，它是以所述利非西呱和多西紫杉醇为活性成分，加上药学上可接受的载体和/或辅料制备而成的，用于同时或者分别给药的利非西呱制剂和多西紫杉醇制剂。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述利非西呱制剂和多西紫杉醇制剂为液体制剂，所述利非西呱制剂和多西紫杉醇制剂的浓度比为：(15～100)μM：(3.13～100)nM。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于：所述利非西呱制剂和多西紫杉醇制剂的浓度比为：100μM:100nM、75μM:50nM、65μM:25nM、40μM:12.50nM、25μM:6.25nM或15μM:3.13nM。
7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述制剂是以利非西呱和多西紫杉醇为活性成分，加上药学上可接受的载体和辅料制备而成的液体制剂；
所述制剂含有：利非西呱与药学上可接受的载体制备而成的利非西呱载药体系，以及多西紫杉醇与药学上可接受的载体制备成的多西紫杉醇载药体系；
所述利非西呱载药体系含有如下结构：
Figure FDA0004081631060000011
所述多西紫杉醇载药体系含有如下结构：
Figure FDA0004081631060000021
其中，n、y、x的比例为(85～130)：(2.5～9)：(0.5～0.9)。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述利非西呱载药体系与多西紫杉醇载药体系的摩尔比为(1000～182250):1。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述制剂是液体制剂，所述利非西呱载药体系与多西紫杉醇载药体系的浓度比为(25～100)μM：(0.14～100)nM。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述防治三阴乳腺癌的药物是抑制三阴乳腺癌细胞生长和/或抑制三阴乳腺癌转移的药物。
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