CN114616245B - 一种抗cd38的抗体及其用途 - Google Patents

一种抗cd38的抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114616245B
CN114616245B CN202080066375.1A CN202080066375A CN114616245B CN 114616245 B CN114616245 B CN 114616245B CN 202080066375 A CN202080066375 A CN 202080066375A CN 114616245 B CN114616245 B CN 114616245B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
antigen
cell
binding fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202080066375.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114616245A (zh
Inventor
赵新燕
邓婧
李鑫鑫
卢士强
赵晓峰
任晋生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Simcere Bio Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Shandong Simcere Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Simcere Bio Pharmaceutical Co ltd filed Critical Shandong Simcere Bio Pharmaceutical Co ltd
Publication of CN114616245A publication Critical patent/CN114616245A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114616245B publication Critical patent/CN114616245B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了特异性结合人CD38的抗体或抗原结合片段,所述抗体或抗原结合片段能介导肿瘤细胞凋亡,可用于肿瘤疾病治疗的用途。

Description

一种抗CD38的抗体及其用途
本申请要求于2019年12月13日提交中国专利局、申请号为201911286272.1、发明名称为“一种抗CD38的抗体及其用途”的中国专利申请的优先权,其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及抗人CD38抗体或其抗原结合片段,编码其的核酸,包含所述抗体或抗原结合片段的药物组合物,以及其用于治疗CD38表达异常相关的疾病,如肿瘤的用途。
背景技术
CD38生物学活性
CD38是一种II型跨膜糖蛋白,CD38和其配体CD31结合可影响细胞迁移,和透明质酸相互作用的受体介导的黏附发挥作用。淋巴细胞活化后CD38表达强度增加,其表达主要集中在造血细胞中;广泛存在于淋巴和骨髓细胞,但大多数成熟静息的淋巴细胞中几乎无表达。
CD38具有多种生物学作用,属于核糖环化酶,可以利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+为底物,生成ADP核糖和环ADP核糖。这对细胞外代谢、细胞内Ca2+、细胞粘附和信号传导等具有重要调控作用。CD38的天然配体为CD31/PECAM,CD38和CD31结合后诱导酪氨酸磷酸化和下游信号传导调节淋巴细胞增殖和细胞因子释放。
在正常人体内,骨髓和淋巴细胞以及一些非造血组织的细胞中CD38表达水平相对较低,相比之下,正常血浆细胞和多发性骨髓瘤(MM)细胞有高水平的CD38表达,这使得CD38成为治疗性抗体靶向骨髓瘤细胞表面分子的一个很好的靶点。此外,CD38在多种癌症,如***癌,非小细胞肺癌,多发性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴癌、卵巢癌、乳腺癌、等肿瘤中高表达。CD38的生物学功能与表达CD38的淋巴细胞钙稳态的调节有关。同时,CD38也具有胞外酶活性,参与核苷酸代谢产物的生成,调节细胞内钙的储存。
CD38单克隆抗体治疗多发性骨髓瘤(MM)
抗CD38单克隆抗体是针对多发性骨髓瘤细胞表面高表达的CD38蛋白分子的靶向抗体药物。第一个抗CD38单克隆抗体Daratumumab可与肿瘤细胞表达的CD38结合,具有抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖的细胞毒性作用(CDC)、并可通过交联(cross-linking)诱导肿瘤细胞程序性死亡(programmedcell death)。基于其良好的耐受性和已被证实的确切疗效,Dratumumab在2015年被FDA批准用于复发/难治性MM患者的治疗,在中国则于2019年7月被批上市。第二个CD38单抗,Sanofi的Isatuximab,在临床3期和泊马度胺联合***在复发/难治性MM病人中取得突破性进展,目前正在FDA和EMA申请上市。鉴于其额外具有抑制NDA水解酶活性的功能可帮助拮抗实体瘤肿瘤微环境中抑制细胞和抑制因子对T细胞得抑制作用,因此目前也在美国开展肝癌,头颈癌,卵巢癌,胶质母细胞瘤等实体瘤的临床试验。Morphosys公司许可给中国天境公司的CD38单抗,在临床静脉输注时与Daratumumab和Isatuximab相比,从4-6小时,降到了2小时左右,可能与其减弱的CDC活性相关。目前在中国进行MM的临床3期试验。我们旨在研发一类与Daratumumab和Isatuximab相比,具有同等或更高CD38蛋白结合亲和力和ADCC、ADCP等活性功能,同时只具有很弱甚至没有CDC活性,但又能抑制NDA水解酶活性的功能的的CD38抗体。
CD38和PD-L1单抗等免疫检查点抑制药物的耐药性的关系
临床数据分析标明,CD38和PD-L1抗体等免疫检查点抑制药物的耐药性密切相关,CD38高表达的病人对PD-L1抗体类药物的响应率有很强的相关性。相关机理如下:1)adenosinergic pathway是PD-L1抗体等药物耐药的重要机理之一。PD-L1抗体给药后会引起在肿瘤微环境中,肿瘤细胞和Treg高表达CD38,CD38通过催化NAD+,促进腺苷的形成,进而抑制T,NK,巨噬细胞。可通过CD38抗体的酶活抑制作用,抑制腺苷形成,可抵抗PD-L1抗体的耐药性。2)对PD-L1类单抗耐药的病人,肿瘤细胞,Treg,MDSC等免疫抑制细胞上的CD38表达显著上调,CD38是PD-L1抗体等免疫检查点抑制药物耐药的重要标志,可通过CD38单抗的杀伤作用,减少肿瘤微环境中的这些免疫抑制细胞,从而促进免疫细胞的肿瘤杀伤作用。当然与此同时,也需要考虑如何设计药物以避免CD38抗体对激活的T细胞的杀伤作用。3)此外,抑制CD38蛋白的NAD+水解酶作用可以促进Th0细胞分化为anti-tumor T cell,抑制Th0转化为Treg细胞,增加抗肿瘤作用。
因此,开发具有肿瘤杀伤及具有NAD水解酶活性抑制作用,可特异性的杀伤高表达CD38的血液瘤细胞和实体瘤中如Treg,MDSC等抑制细胞的CD38单抗,或者在此基础上开发含CD38单抗的抗原结合片段的抗CD38*X双特异抗体或双靶点药物,用于提高治疗MM的药效,或者用于治疗实体瘤等其它难治的恶性肿瘤,尤其是实体瘤,具有重大的社会和经济意义。
发明内容
本发明提供特异性结合人CD38的抗体或抗原结合片段,编码这些抗体的核酸,包含所述抗体及抗原结合片段和药物组合物,以及他们用于杀伤肿瘤细胞的功能,用于***的用途。本发明所述抗体或抗原结合片段不仅可以结合人CD38,还可以结合食蟹猴CD38。
在一些实施方案中,特异性结合人CD38的分离的抗体或抗原结合片段,包含重链CDRs和轻链CDRs:
(1)所述重链CDRs包含:CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH;所述CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸***、缺失和/或替换的序列组合:
和;
(2)所述轻链CDRs包含:CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL;所述CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸***、缺失和/或替换的序列组合:
各个CDR1-VH、CDR2-VH、CDR3-VH、CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL为根据KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法编码。
在一些实施方案中,特异性结合人CD38的分离的抗体或抗原结合片段,其包含选自以下的重链CDRs组合:VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15、VH16、VH17、VH18、VH19、VH20、VH21、VH22、VH23、VH24、VH25、VH26、VH27、VH28、VH29、VH30、VH31、VH32、VH33、VH34、VH35或VH36,以及与所述重链CDRs组合之序列相比具有1、2、3或更多个氨基酸***、缺失和/或替换的CDRs组合。
在一些实施方案中,特异性结合人CD38的分离的抗体或抗原结合片段,其包含选自以下的轻链CDRs组合:VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17、VL18、VL19、VL20、VL21、VL22、VL23、VL24、VL25、VL26、VL27、VL28、VL29、VL30、VL31、VL32、VL33、VL34、VL35或VL36,以及与所述轻链CDRs组合之序列相比具有1、2、3或更多个氨基酸***、缺失和/或替换的CDRs组合。
在一些实施方案中,特异性结合人CD38的分离的抗体或抗原结合片段,其包含选自以下的重链CDRs和轻链CDRs组合:VH1+VL1、VH2+VL2、VH3+VL3、VH4+VL4、VH5+VL5、VH6+VL6、VH7+VL7、VH8+VL8、VH9+VL9、VH10+VL10、VH11+VL11、VH12+VL12、VH13+VL13、VH14+VL14、VH15+VL15、VH16+VL16、VH17+VL17、VH18+VL18、VH19+VL19、VH20+VL20、VH21+VL21、VH22+VL22、VH23+VL23、VH24+VL24、VH25+VL25、VH26+VL26、VH27+VL27、VH28+VL28、VH29+VL29、VH30+VL30、VH31+VL31、VH32+VL32、VH33+VL33、VH34+VL34、VH35+VL35或VH36+VL36,以及与所述重链CDRs和轻链CDRs组合之序列相比具有1、2、3或更多个氨基酸***、缺失和/或替换的CDRs组合。
在一些具体的实施方案中,特异性结合人CD38的分离的抗体或抗原结合片段,其中:(1)所述重链CDRs包含:
CDR1-VH,其包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35任一项所示VH的CDR1;
CDR2-VH,其包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35任一项所示VH的CDR2;和,
CDR3-VH,其包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35任一项所示VH的CDR3;和/或,
(2)所述轻链CDRs包含:
CDR1-VL,其包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36任一项所示VL的CDR1;
CDR2-VL,其包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36任一项所示VL的CDR2;和,
CDR3-VL,其包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36任一项所示VL的CDR3。
在一些具体的实施方案中,特异性结合人CD38的分离的抗体或抗原结合片段,其中:
(1)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列;
(2)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列;
(3)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列;
(4)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列;
(5)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列;
(6)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示序列;
(7)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示序列;
(8)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示序列;
(9)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示序列;
(10)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示序列;
(11)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示序列;
(12)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示序列;
(13)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示序列;
(14)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示序列;
(15)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示序列;
(16)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示序列;
(17)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示序列;
(18)重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示序列;
或,
(19)重链可变区和轻链可变区分别具有与上述(1)至(18)所示序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性的序列。
在一个优选实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段为:
(1)嵌合抗体或其片段;
(2)全人抗体或其片段;或,
(3)人源化抗体或其片段。
在一个优选实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段为,其与人CD38结合的解离常数(KD)不大于5nM,与食蟹猴CD38结合的解离常数(KD)不大于25nM。
在一个优选实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段包含人或鼠抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD任何其中之一恒定区的序列;优选包含人或鼠抗体IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区的序列。
在一个优选实施方案中,本发明所述抗原结合片段选自F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体、纳米抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。
在一个优选实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段可与选自编号10、11、12、13、26、31、38、42、44、48、51、52、69、102、215、245、286、或292的抗体或抗原结合片段竞争性地结合CD38或其抗原表位,并且具备以下特性:
1)特异性结合人CD38重组蛋白及表达人CD38的细胞;
2)介导抗体依赖的细胞毒性杀伤(ADCC)活性;
3)介导抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用(ADCP);
4)介导交联诱导的细胞死亡;
5)不具备或只具备微弱的抗体介导的补体依赖的细胞毒性(CDC)活性;
6)抑制NAD水解酶活性;或/和
7)抑制肿瘤生长。
进一步的,在一些实施例中,所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂;优选地,所述治疗剂选自放射性同位素、细胞毒性剂或免疫调节剂,所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂;更优选地,所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素(doxorubicin)或紫杉烷类(taxanes);所述毒素化合物优选DM1、DM4、SN-38、MMAE、MMAF、Duocarmycin、Calicheamicin、DX8951。
进一步的,在一些实施例中,所述抗体或抗原结合片段还连接有另一功能性分子,所述功能性分子可选自以下一种或多种:信号肽、蛋白标签、或细胞因子;优选地,所述细胞因子可选自IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNF-alpha。
在一些实施方案中,本发明提供一种分离的核酸分子,所述核酸分子编码本发明上述所述的抗体、抗原结合片段、或其任意组合。
在一些实施方案中,本发明提供一种表达载体,其包含本发明上述所述分离的核酸分子。
在一些实施方案中,本发明提供一种宿主细胞,其包含本发明上述所述分离的核酸分子或表达载体。
在一个优选实施方案中,所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞;更优选,所述宿主细胞来源于哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、大肠杆菌和/或枯草杆菌;更优选,所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
在一些实施方案中,本发明提供一种抗体或抗原结合片段的制备方法,在适当的条件下培养本发明上述所述的宿主细胞,并分离抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中,本发明提供一种药物组合物,组合物包含本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述分离的核酸分子、本发明上述所述表达载体、本发明上述所述细胞,或本发明上述所述方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段),以及药学上可接受的载体。
在一个优选实施方案中,所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
在一些实施方案中,本发明提供一种预防和/或治疗CD38表达异常相关的疾病的方法,包含向有此需要的患者施用本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述药物组合物;所述疾病优选肿瘤。
在一些实施方案中,本发明提供上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段)、或本发明上述所述药物组合物在制备预防和/或治疗CD38表达异常相关的疾病的药物中的用途,所述疾病优选肿瘤。
在一些实施方案中,本发明提供一种试剂盒,其包含本发明上述所述的抗体或抗原结合片段、本发明上述所述的分离的核酸分子、本发明上述所述的表达载体、本发明上述所述的细胞、或本发明上述所述的方法制备的产品(例如抗体和抗原结合片段),以及使用说明。
在另一方面,本发明提供了一种多特异性抗体,所述多特异性抗体包含第一方面所述的抗体或抗原结合片段;优选地,所述多特异性抗体进一步包含特异性结合CD38以外的抗原或结合与第一方面所述抗体或抗原结合片段不同的CD38表位的抗体或抗原结合片段。
在一些实施例中,优选地,所述CD38以外的抗原可选自:CD3,优选CD3ε;CD16,优选CD16A;CD32B;PD-1;PD-2;PD-L1;VEGF;NKG2D;CD19;CD20;CD40;CD47;4-1BB;CD137;EGFR;EGFRvIII;TNF-alpha;CD33;MSLN;HER2;HER3;HAS;CD5;CD27;EphA2;EpCAM;MUC1;MUC16;CEA;Claudin18.2;叶酸受体;Claudin6;WT1;NY-ESO-1;MAGE3;ASGPR1或CDH16。
在一些实施例中,优选地,所述多特异性抗体可为双特异性、三特异性或四特异性,所述多特异性抗体可为二价、四价或六价。
在另一方面,本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR),所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域,所述细胞外抗原结合结构域包含任选自本发明所述抗体或抗原结合片段。
在另一方面,本发明提供一种免疫效应细胞,所述免疫效应细胞表达上述所述的嵌合抗原受体,或包含编码上述所述嵌合抗原受体的核酸片段;优选地,所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞,所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞;优选地,所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
术语和定义:
除非另外说明,本文所用术语具有所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。对于本文中明确定义的术语,则该术语的含义以所述定义为准。
术语“CD38”,是一种糖蛋白,具有环ADP核糖水解酶作用,存在于许多免疫细胞(白细胞)的表面,包括T、B淋巴细胞和自然杀伤细胞。CD38也在细胞粘附、信号转导和钙信号传导中起作用。
术语“抗体”(Ab)是指与目标抗原特异性结合或具有免疫反应性的免疫球蛋白分子,包括抗体的多克隆、单克隆、基因工程化和其他修饰形式(包括但不限于嵌合抗体,人源化抗体,全人源抗体,异源偶联抗体(例如双特异性、三特异性和四特异性抗体,双抗体,三抗体和四抗体),抗体缀合物)以及抗体的抗原结合片段(包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)。此外,除非另有说明,否则术语“单克隆抗体”(mAb)意指包括能够特异性结合靶蛋白的完整抗体分子以及不完整的抗体片段(例如Fab和F(ab’)2片段,它们缺少完整抗体的Fc片段(从动物循环中更快地清除),因此缺乏Fc介导的效应功能(effectorfunction)(参见Wahl等人,J.Nucl.Med.24:316,1983;其内容援引加入本文)。
术语“抗原结合片段”是指保留特异性结合靶抗原的能力的一个或更多个抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于:(i)Fab片段,一种由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段;(ii)F(ab)2片段,一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段;(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;(V)包含VH和VL结构域的dAb;(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature341:544-546,1989);(vii)由VH或VL结构域组成的dAb;(viii)分离的互补决定区(CDR);以及(ix)两个或更多个分离的CDR的组合,所述CDR可以任选地由合成接头连接。此外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是通过独立的基因编码的,但是这两个结构域可以使用重组方法通过接头接合,该接头能够使其制成其中VL和VH区配对以形成单价分子的单蛋白质链(称为单链Fv(scFv);参见例如,Bird等人,Science 242:423-426,1988以及Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得,并且这些片段被筛选用于与完整抗体相同的方式使用。可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解、或在一些实施方式中通过本领域已知的化学肽合成程序来产生抗原结合片段。
术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的抗原具有单克隆结合特异性的抗体,其通常是人或人源化的抗体。在本发明中,结合特异性之一可以针对CD38的抗原表位而被检测,另一个可以针对CD38的另一个抗原表位或任何其他抗原,例如针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒来源蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源蛋白或细菌表面蛋白等而被检测。
术语“嵌合”抗体是指以下抗体,其具有源自一种来源生物(如大鼠或小鼠)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如,Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7;Oi等人,1986,Bio Techniques 4:214-221;Gillies等人,1985 J Immunol Methods 125:191-202;以上通过援引加入并入本文。
术语“人源化抗体”是指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造,重新表达的抗体,其大部分氨基酸序列为人源序列取代,基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性,又降低了其异源性,有利应用于人体。人源化抗体就是指抗体的恒定区部分(即CH和CL区)或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
术语“互补决定区”(CDR)指在轻链和重链可变结构域中均发现的高变区。可变结构域中更高保守性的部分称为框架区(FR)。如本领域所理解的,表示抗体的高变区的氨基酸位置可以根据上下文和本领域已知的各种定义而变化。可变结构域内的一些位置可以被视为杂合高变位置,因为这些位置可以被认为是在一组标准(如IMGT或KABAT)下的高变区之内,而被认为在不同组的标准(如KABAT或IMGT)下的高变区之外。这些位置中的一个或更多个也可以在延伸的高变区中找到。本发明包括在这些杂合高变的位置中包含修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用片层构型的四个框架区,其通过三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)连接,这三个CDR形成连接片层结构的环,并且在一些情况下形成片层结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区按顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4紧密保持在一起,并且与来自其他抗体链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Protein sofImmunological Interest,National Institute ofHealth,Bethesda,Md 1987;其通过援引加入并入本文)。例如在本文中,CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH分别是指重链可变区(VH)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR,这三个CDR构成了重链(或其可变区)的CDR组合(VHCDR组合);CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL分别是指轻链可变区(VL)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR,这三个CDR构成了轻链(或其可变区)的CDR组合(VLCDR组合)。
术语“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链(包括Fv、scFv或Fab的重链)的可变区。术语“VL”是指免疫球蛋白轻链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链)的可变区。
术语“抗体缀合物”是指抗体分子直接或者通过连接接头与另一个分子化学键合而形成的偶联体/缀合物。例如抗体-药物缀合物(ADC),其中药物分子就是所述的另一个分子。
术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆(包括任何真核、原核、或噬菌体克隆)的抗体,而不限于该抗体的产生方法。
术语“百分比(%)序列一致性”是指在为达到最大百分比序列一致性而比对序列和引入空位(如果需要)(例如,为了最佳比对,可以在候选和参比序列中的一个或两个中引入空位,并且出于比较的目的,可以忽略非同源序列)之后,候选序列的氨基酸(或核苷酸)残基与参比序列的氨基酸(或核苷酸)残基相同的百分比。出于确定百分比序列一致性的目的,可以用本领域技术人员熟知的多种方式来实现比对,例如使用公众可得的计算机软件,如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数,包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。例如,用于与候选序列进行比较而比对的参比序列可以显示候选序列在候选序列的全长或候选序列的连续氨基酸(或核苷酸)残基的选定部分上表现出从50%至100%的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列的长度可以是例如参比序列的长度的至少30%(例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%)。当候选序列中的位置被与在参比序列中的相应位置相同的氨基酸(或核苷酸)残基占据时,则这些分子在那个位置是相同的。
术语“特异性结合”是指一种结合反应,其决定抗原在蛋白质和其他生物分子的一个异质性群体中的存在状况,所述蛋白质和其他生物分子例如被抗体或其抗原结合片段特异性识别。与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以小于100nM的KD与抗原结合。例如,与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段将以高达100nM(例如,1pM至100nM之间)的KD与抗原结合。不显示与特定抗原或其表位特异性结合的抗体或其抗原结合片段将显示对该特定抗原或其表位的大于100nM(例如,大于500nM、1μM、100μM、500μM或1mM)的KD。可以使用多种免疫测定方式来选择与特定蛋白或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。例如,常规地使用固相ELISA免疫测定法来选择与蛋白质或碳水化合物进行特异性免疫反应的抗体。参见,Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork(1988)以及Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press,NewYork(1999),其描述了可以用于确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件。
术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指经改造以在免疫效应细胞上表达并且特异性结合抗原的人工细胞表面受体,其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域,例如抗体的可变重链或轻链,(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域,和(3)胞内信号传导结构域。CAR能够利用细胞外抗原结合结构域以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫效应细胞重定向至所选择的靶标,例如癌细胞。
术语”ADCC”(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC),即抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用,是指抗体的Fab段特异性识别肿瘤细胞的抗原表位,其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞等)表面的FcR结合,介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。抗体介导的ADCC强弱和许多因素有关,如抗体与抗原的亲和力、抗体与Fc段受体的亲和力、免疫效应细胞的特性等。一般情况下,对抗原或Fc受体亲和力高的抗体介导的ADCC作用越强。对抗体Fc段的糖基化及氨基酸序列改造可以提高ADCC活性。在抗体的糖基化修饰中,岩藻糖被认为是影响ADCC活性最重要的糖,去岩藻糖化可以显著提高抗体与FcγRIIIa的亲和力及ADCC活性。
术语“抗体通过交联诱导程序性细胞死亡”(antibody induces programmed celldeath via cross-linking)是指抗体的Fc段与Fc受体(FcR)或在第二交联抗体作用下后,诱导细胞程序性细胞死亡过程。ADCC和ADCP是通过单克隆抗体结合激活免疫效应细胞(如自然杀伤细胞、巨噬细胞和多形核细胞)上的FcγRs,诱导成聚集的IgG恒定结构域(Fc结构域)。单克隆抗体可通过抗体的Fc段与Fc受体相互作用进而增强抗体的激动活性或诱导程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。以死亡受体家族成员为靶点的激动治疗单克隆抗体通过外源性凋亡途径诱导PCD。以这些死亡受体为靶点的激动性单克隆抗体诱导的PCD通过交联增强,比如通过第二交联抗体或更生理学上与FcγRs结合而增强。与死亡受体家族无关的抗体介导的抗原交联也可诱导PCD,但不能通过经典的凋亡途径。这种途径的特点是细胞的同型聚集,包括细胞骨架重组、溶酶体活化和活性氧的产生。这种非诱导PCD通路可以通过Fc交联的二抗或FcγR表达细胞来增强。
术语“载体”包括核酸载体,例如DNA载体(如质粒),RNA载体,病毒或其他适合的复制子(例如病毒载体)。已经开发了多种载体用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。本发明的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的附加序列元件。可以用于表达本发明的抗体和抗体片段的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(如启动子和增强子区域)的质粒。用于表达抗体和抗体片段的其他有用的载体含有多核苷酸序列,其增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点,以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的表达载体还可以含有以下多核苷酸,该多核苷酸编码用于选择含有这种载体的细胞的标记。适合的标记的实例包括编码抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)抗性的基因。
术语“受试者”、“对象”和“患者”是指接受对如本文所述的特定疾病或病症(如癌症或传染性疾病)的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症(例如细胞增殖性病症,如癌症或传染性疾病)的治疗的哺乳动物,如人、灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科家族成员(如家牛、野牛、水牛、麇鹿和牦牛等)、牛、绵羊、马和野牛等。
术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment),其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变,如细胞增殖性病症(如癌症或传染性疾病)的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解),无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时,其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状,例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症,或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时,治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时,治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量,而无论是组合、连续或同时给予。
术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。如本文所用,术语“肿瘤”或“瘤”是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
附图说明
下面通过对本发明的详细描述以及附图来清楚地说明本发明前面叙述的方面以及其他方面。本文中附图是为了举例说明本发明的一些优选的实施方案,然而,可以理解,本发明并不限于所公开的特定实施方案。
图1A、CD38-His免疫小鼠血清中与人CD38-His结合滴度检测;
图1B、CD38-His免疫小鼠血清与人EGFR-His结合滴度检测;
图2A、未免疫小鼠脾脏B细胞CD38-His染色结果;
图2B、CD38-His免疫的小鼠脾脏B细胞CREG-His染色结果;
图2C、CD38-His免疫的小鼠脾脏B细胞CD38-His染色结果;
图3A、FACS检测抗CD38候选抗体和Daudi细胞直接结合EC50值;
图3B、FACS检测候选抗体和CHO-CD38细胞直接结合EC50值;
图4A-4B、抗CD38抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用(ADCP)测定;
图5A、抗CD38抗体通过交联诱导的Romas细胞发生了磷脂酰丝氨酸易位;
图5B、抗CD38抗体通过交联诱导的细胞死亡;
图6A、抗CD38抗体通过交联诱导的Annexin V阳性细胞的剂量依赖关系,比例高于PI阳性细胞比例;
图6B、抗CD38抗体通过交联诱导的细胞死亡的剂量依赖关系;
图7A-7B、抗CD38抗体介导的NK细胞对Daudi细胞的ADCC活性测试;
图8A-8C、抗CD38抗体介导的PBMC对Daudi细胞的ADCC活性测试;
图9、抗CD38抗体抑制CD38蛋白的NAD水解酶活性的检测;
图10A-10B、抗CD38抗体介导的补体依赖的细胞毒性反应。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述,本文中附图是为了举例说明本发明的一些优选的实施方案,然而,可以理解,本发明并不限于所公开的特定实施方案或看作对本发明范围的限制。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1小鼠免疫产生特异性结合CD38的单克隆抗体
对6-8周龄的雌性SJL小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)或者Balb/c小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司),使用人CD38-His(Novoprotein,Cat:CU65)与弗氏完全佐剂(complete freund′s adjuvant,Sigma,Cat:F5881)进行第一次免疫;使用上述人CD38-His与弗氏不完全佐剂(incomplete freund′s adjuvant,IFA,Sigma,Cat:F5506)加未甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpGODN1826,合成自上海生工生物)进行后三次免疫;免疫时注射50μg/只/次通过乳化操作形成的均一稳定的乳剂。特别地,第一次和第二次免疫注射后足垫和背部,第三次和第四次免疫注射尾部皮下及背部,以获得高滴度高亲和力高特异性的抗血清及特异性的免疫细胞。在末次免疫(第四次免疫)后的第5-7天,安乐死小鼠并无菌取出脾脏,无菌分离提取小鼠脾脏淋巴细胞,分装至冻存管中,冻存于液氮中。分别在二次免疫,三次免疫后10天及安乐死小鼠当天进行小鼠的采血操作,分离血清,使用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定血清中抗CD38特异性抗体的滴度。
实验结果如图1A、1B,显示经过四次免疫后,所免疫小鼠的血清与人CD38-His结合的滴度都能很很高。且与His无关蛋白(人EGFR-His)结合滴度都很低,说明了使用此方法进行小鼠的免疫,可以使小鼠产生高滴度高特异性的抗CD38抗体。
实施例2 CD38特异性单个B细胞的流式细胞荧光分选(FACS)
CD38蛋白免疫的小鼠脾脏细胞,经抗原CD38-His蛋白(CD38-His,Novoprotein,Cat:CU65)及间接标记抗体anti-His-APC(R&D Systems,Cat.IC050A)和针对小鼠B细胞特有标志的抗体(anti-mouse B220-Pacfic Blue,BD Biosciences,Cat.558108;anti-mouseIgD-PE,BD Biosciences,Cat.558597;anti-mouse IgM-PE cy7,BD Biosciences,Cat.552867)染色,并在分选前加入区分死细胞和活细胞的染料7-AAD(BD Biosciences,Cat.51-68981E),用AriaIII(BD公司)流式细胞分选仪分选CD38特异性的单个B细胞(7AAD-B220+IgD-IgM-CD38+)至含有细胞裂解液、RNA酶抑制剂的PCR孔中,每个孔收集一个细胞。结果显示未免疫对照小鼠脾脏用CD38-His蛋白染色(图2A)或不相关蛋白CREG-His染色的CD38蛋白免疫的小鼠脾脏(图2B)未检测到CD38+B细胞,而CD38-His免疫的小鼠脾脏(图2C)检测到明显的一群CD38+B细胞,每106个脾脏细胞中约有65个CD38+B细胞。
实施例3单克隆抗体的扩增和高通量表达
采用专利“一种用于巢式扩增的组合引物及其应用”专利申请号:201811618134.4中实施例1的方法,将单细胞的mRNA反转录成cDNA。然后以cDNA为模板进行巢式PCR,分别进行抗体重链和轻链扩增。扩增得到抗体重链可变区和轻链可变区,分别通过同源重组方法克隆到重链表达载体和轻链表达载体。重链表达载体和轻链表达载体的恒定区都来自于人IgG1。完整重链表达序列是信号肽-VH-CH1-铰链区-CH2-CH3,完整轻链表达序列是信号肽-Vκ-Cκ。以上所述单B细胞抗体克隆和表达皆在96孔板内以高通量方式达到抗体的快速鉴定和发现。经过一系列理化和功能筛选324对克隆表达的抗体重链和轻链后共获得18个阳性候选抗体分子,其序列的CDRs分别用IMGT和KABAT软件分析,对应的序列信息如下表1所示,其中表1示出候选抗体分子的VH和VL序列,表2示出候选抗体分子的IMGT和KABAT分析结果)。
将候选抗CD38抗体测序,重链可变区和轻链可变区具体的序列信息如下:
表1.抗CD38抗体重链可变区和轻链可变区的具体序列信息
/>
分别使用IMGT和KABAT软件分析各抗体的CDRs,具体的序列信息如下:
表2.IMGT和KABAT软件分析各抗体的CDRs具体序列信息
/>
/>
/>
实施例4 Octet检测抗体结合亲和力和特异性
采用Octet HTX检测***,抗体用PBST稀释至1μg/ml,抗原CD38-His(Novoprotein,Cat:CU65)用PBST稀释至100nM作为起始浓度,2倍梯度稀释,共7个梯度,依次加入96孔Octet板(Greiner,Cat.655209),300μl/孔;设置循环程序,一共8个protein A探针,每一个循环先loading抗体到探针至1nm高度,约3分钟,再用探针结合梯度稀释后的CD38-His抗原,约10分钟至饱和平台,最后用Glycine pH1.5再生。分析试验数据,拟合抗体抗原的平衡解离常数KD,确定结合速率常数ka和解离速率常数kd。
抗体候选物对于人和食蟹猴CD38蛋白的亲和力总结于表3。结合速率Kon,解离速率Kdis,解离常数KD。通过表3可以看出候选CD38抗体与商业途径购买的药物对照抗体Daratumumab(Janssen,Cat GIS0503)相比,与人的结合亲合力有很大提高,但与食蟹猴的结合亲和力要比Daratumumab弱,与根据Morphosys专利发表序列制备的CD38单抗阳性对照Mor202-kaps(Biointron,Cat.B4163)相比,与人及食蟹猴的结合亲合力大致相当或有所提高。
表3.Octet检测CD38抗体结合亲和力和特异性
/>
实施例5通过流式细胞仪(FACS)测定候选抗体的EC50
候选抗CD38抗体对细胞表面上的CD38靶标的剂量依赖性结合能力通过流式细胞术(FACS)证实。
本实验选用2株高表达CD38的细胞株:Daudi(购自中国科学院细胞库,Cat:TCHu140)及CHO细胞表面高表达CD38蛋白的CHO-38细胞(定购自勇山生物科技有限公司)。在U型圆底96孔板中,1×105Daudi或CHO-38细胞和系列稀释的抗CD38抗体,起始浓度为10μg/ml,10倍梯度,每个抗体6个梯度,4℃共孵育半小时后,加入5μg/ml二抗anti hIgG Fc(Invitrogen,Cat:31125),4℃共孵育半小时后上机FACS检测。
结果证实,候选抗体有效地结合在表达CD38的细胞表面上,如图3所示,参比抗体Daratumumab(阳性对照)在Daudi细胞表面(图3A)EC50为57.94ng/ml,在CHO-38细胞表面上(图3B)的EC50为60.43ng/ml,而候选抗体与这两种细胞表面CD38结合的EC50与参比抗体差异不大;参比抗体为Mor202-kaps(阳性对照)时,两种细胞上候选抗体的EC50都小于参比抗体,说明候选抗体与这两株细胞的结合力强于Mor202-kaps,详见表4。
表4.EC50结果图
抗体编号 Daudi-EC50(ng/ml) CHO-38-EC50(ng/ml)
11 58.36 111.9
13 57.97 123.1
42 128 89.55
44 57.47 116.5
48 86.47 99.59
69 131 67.41
102 58.23 86.21
215 82.71 106.8
286 149.8 109.8
292 94.59 61.08
Daratumumab 57.94 60.43
Mor202-Kaps 322.1 178.2
实施例6抗CD38抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用(ADCP)测定
利用Daudi细胞(购自中国科学院细胞库,目录号:TCHu140)作为靶细胞和人的巨噬细胞(PBMC分离单核细胞诱导而来)作为效应细胞来测量ADCP。
效应细胞的制备:冻存的正常人的外周血单核细胞PBMC(Stemexpress,Cat:PB0004C),复苏PBMC细胞后在补充有100IU/ml rhIL-2(Peprotech,Cat:-200-02)的RPMI1640(Gibco,Cat:22400-089)中孵育过夜。其后,收集细胞后进行活细胞计数。然后从PBMC中分离单核细胞,具体参照单核细胞分离试剂盒说明书(EasySep Cat:19058),将单核细胞用补充有100μg/ml GM-CSF(Peprotech,Cat:300-03-20Ug)的含10%FBS(Gibco,Cat:10099-141)的RPMI1640中诱导分化,在5%CO2,37℃培养中培养培养一周后,重悬后进行计数,用作效应细胞。
靶细胞的制备:将靶细胞Daudi(购自中国科学院细胞库,目录号:TCHu140)收集后用CelltraceTMviolet(Invitrogen,Cat:C34556)进行标记,标记的细胞用补充有10%FBS的RPMI1640重悬,用作靶细胞。
在U型圆底96孔板中,5×104Daudi细胞和稀释的抗CD38抗体,终浓度为1μg/ml,0.1μg/ml,4℃预孵育半小时,然后加入的2×105效应细胞(效应细胞∶靶细胞=4∶1),4℃共孵育3小时。孵育完成后,进行染色操作。
染色过程:Human TruStain FcX(Biolegend,Cat:422302)封闭半小时后,加入染色抗体APC Mouse anti human CD19(BD,Cat:555415),AF488mouseanti human CD11b(BD,Cat:557701),4℃孵育半小时。用含有2%FBS(Gibco,Cat:10099-141)的DPBS(Hyclone,Cat:SH30256.01)洗两遍后重悬,上机前加入PI(Invitrogen,Cat:P3566)用流式细胞仪进行分析。
根据下面计算公式计算由ADCP活性引起的细胞裂解率:
细胞吞噬率=被吞噬的细胞所占比(CD19+CD11b-)/靶细胞所占百分比(Celltrace+)*100%
参见图4A及图4B,可看出候选抗CD38抗体均能提高ADCP作用,候选抗体69的ADCP作用在1μg/ml和0.1μg/ml这两个剂量下都比参比抗体Daratumumab(阳性对照)更强。
实施例7抗CD38抗体通过交联诱导的程序性细胞死亡分析
在Romas细胞(上海酶研生物科技有限公司,货号CC-Y1430)上测定CD38抗体交联诱导的细胞程序性细胞死亡。在U型圆底96孔板中,4×104Romas细胞和系列稀释的抗CD38抗体,终浓度为10μg/ml,1μg/ml,0.1μg/ml和0.01μg/ml,预孵育半小时,然后加入5μg/mlanti hIgG Fc(Invitrogen,Cat:31125),在5%CO2,37℃培养中培养20小时。分别使用程序性细胞死亡检测试剂盒(eBioscience,Cat:BMS500FI/300)中的Annexin V和PI对细胞进行染色后用流式细胞仪进行分析。Annexin V阳性百分比和PI阳性百分比用Flowjo软件进行计算分析。
结果显示所有候选CD38抗体(0.1μg/ml)在Fc交联二抗anti hIgGFc作用下,都可诱导了Romas细胞发生了磷脂酰丝氨酸易位(图5A),因此Romas细胞的Annexin V阳性比例都明显提高。PI细胞阳性比例也有明显提高,即细胞发生死亡(图5B)。Annexin V阳性细胞的比例高于PI阳性细胞比例,进一步观察不同浓度CD38抗体对细胞的影响(图6A-6B),发现在0.01-10μg/ml浓度下,在Fc交联试剂存在时,本发明候选抗CD38抗体均可有效诱导细胞发生凋亡。
实施例8抗CD38抗体的ADCC活性测试
效应细胞的制备:冻存的正常人的外周血单核细胞PBMC(Stemexpress,Cat:PB0004C),复苏PBMC细胞后在补充有100IU/ml rhIL-2(Peprotech,Cat:-200-02)的RPMI1640(Gibco,Cat:22400-089)中孵育过夜。其后,收集细胞后进行活细胞计数。然后从PBMC中分离纯化NK细胞,具体参照NK细胞分离试剂盒说明书分离NK细胞(Stemcell Cat:17955),将NK细胞用补充有10%FBS(Gibco,Cat:10099-141)的RPMI1640重悬后进行计数,用作效应细胞。PBMC可以直接用于ADCC实验的效应细胞。
靶细胞的制备:将靶细胞Daudi(购自中国科学院细胞库,目录号:TCHu140)收集后用CelltraceTMviolet(Invitrogen,Cat:C34556)进行标记,标记的细胞用补充有10%FBS的RPMI1640重悬,用作靶细胞。
用补充有10%FBS的RPMI1640稀释抗CD38抗体,稀释好的抗体以50μl/孔分到U型底96孔板中,然后将标记的靶细胞加入孔中。板子在37℃,5%CO2培养箱中预孵育半小时。随后,将效应细胞加入孔中(效靶比NK∶Daudi 2∶1-4∶1;PBMC∶Daudi 20∶1-40∶1),37℃,5%CO2培养箱中孵育3-4个小时。将板取出,每孔加入死细胞标记染料PI(1μl/孔)后进行流式分析,测量CelltraceTMviolet阳性的靶细胞中死细胞即PI阳性的比例。根据下面计算公式计算由ADCC活性引起的细胞裂解率:
细胞裂解率(%)=(样品孔PI%-仅有靶细胞孔PI%)/(1-仅有靶细胞孔PI%)。
结果显示于图7A-7B和图8A-8C中,所有抗CD38抗体均显示出以抗体浓度依赖性方式对Daudi细胞的裂解杀伤活性。用NK作为效应细胞时CD38抗体ADCC活性的EC50在0.008-0.029ng/ml之间(图7A-7B),用PBMC作为效应细胞时CD38抗体ADCC活性的EC50在0.084-0.200ng/ml之间(图8A-8C)。阳性对照Daratumumab(Dara)的ADCC活性比Mor202-kaps强,阴性对照抗体anti-Hel(先声生物自行制备)(和Daudi细胞没有结合)和预期一致,没有ADCC活性。
实施例9 CD38抗体抑制CD38蛋白水解酶活性的检测
本实施例采用CD38水解酶活性抑制剂筛选试剂盒(BPS Bicoscience,Cat.79287)进行检测,按照说明书进行操作。在96孔板中加入水解缓冲液,1μg/ml待检测抗体,0.5μg/ml CD38蛋白后,将体系放入37℃培养箱中孵育30分钟,随后加入ε-NAD底物,酶标仪进行荧光检测,激发波长300nm,检测波长为410nm,每隔3分钟读取板上各样品孔的荧光值,共读取60分钟。根据时间-荧光值曲线,选取进入平台期的前一时间点,计算抑制率:
抑制率(%)=(Sample荧光值-Blank荧光值)/(Positive Control荧光值-Blank荧光值)×100%。
结果如图9所示,对照药品Daratumumab(Dara)的反应曲线与阴性对照抗体组IgG1κ、未加药组Drug0的反应曲线重合,都不具有抑制CD38水解酶活性;而具有抑制CD38水解酶活性的对照药品Isatuximab(Isa)的反应曲线与抗CD38抗体102和215的反应曲线相近,CD38水解酶活性的反应速率均有明显下降,说明被测试的抗CD38抗体可以有效抑制CD38的水解酶活性。
实施例10 CD38抗体CDC活性检测
在96孔板中加入以下细胞和抗体:Daudi细胞1×105cell/孔,25μl/孔,CD38抗体:25μl/孔,4μg/ml起始浓度,1∶10稀释,37℃孵育30分钟。加入人血清(先声药业体检用正常人血清),使终浓度为5%。37℃孵育2.5小时。用RPMI 1640按照1∶20稀释PI染料(invitrogen,Lot:1887160),加入20μl/well,使得最终PI用量为1μl/well,室温孵育5分钟后,上流式细胞仪检测,记录死细胞比例。CDC activity(%)=PI阳性细胞比例。结果见图10A-10B,已知具有很强的CDC活性的Daratumumab如预期显示了剂量依赖的CDC活性,而被测试的CD38候选抗体除了抗体10,31,38,102,215在最高的三个浓度有微弱的CDC活性外,其余均无明显CDC活性。表明这些抗体有望避免因CDC活性导致的静脉输液相关的反应(infusion related reaction,IRR)。

Claims (33)

1.特异性结合人CD38的分离的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),所述重链可变区、轻链可变区包含选自下述的CDRs组合:
(1)IMGT编号下,CDR1-VH如SEQ ID NO.37所示,CDR2-VH如SEQ ID NO.51所示,CDR3-VH如SEQ ID NO.52所示,CDR1-VL如SEQ ID NO.100所示,CDR2-VL如SEQ ID NO.101所示,CDR3-VL如SEQ ID NO.102所示;或KABAT编号下,CDR1-VH如SEQ ID NO.73所示,CDR2-VH如SEQ ID NO.83所示,CDR3-VH如SEQ ID NO.69所示,CDR1-VL如SEQ ID NO.119所示,CDR2-VL如SEQ ID NO.120所示,CDR3-VL如SEQ ID NO.102所示;
(2)IMGT编号下,CDR1-VH如SEQ ID NO.57所示,CDR2-VH如SEQ ID NO.58所示,CDR3-VH如SEQ ID NO.59所示,CDR1-VL如SEQ ID NO.112所示,CDR2-VL如SEQ ID NO.113所示,CDR3-VL如SEQ ID NO.114所示;或KABAT编号下,CDR1-VH如SEQ ID NO.89所示,CDR2-VH如SEQ ID NO.90所示,CDR3-VH如SEQ ID NO.91所示,CDR1-VL如SEQ ID NO.126所示,CDR2-VL如SEQ ID NO.127所示,CDR3-VL如SEQ ID NO.114所示;
(3)IMGT编号下,CDR1-VH如SEQ ID NO.60所示,CDR2-VH如SEQ ID NO.58所示,CDR3-VH如SEQ ID NO.61所示,CDR1-VL如SEQ ID NO.112所示,CDR2-VL如SEQ ID NO.113所示,CDR3-VL如SEQ ID NO.115所示;或KABAT编号下,CDR1-VH如SEQ ID NO.92所示,CDR2-VH如SEQ ID NO.93所示,CDR3-VH如SEQ ID NO.94所示,CDR1-VL如SEQ ID NO.126所示,CDR2-VL如SEQ ID NO.127所示,CDR3-VL如SEQ ID NO.115所示。
2.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,其重链可变区和轻链可变区包含选自下述的CDRs组合:
(1)SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26所示序列中的CDRs;
(2)SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28所示序列中的CDRs;
(3)SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30所示序列中的CDRs。
3.权利要求2所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,重链可变区和轻链可变区选自:
(1)重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26所示;
(2)重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28所示;
(3)重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30所示。
4.权利要求1-3任意一项所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段为:(1)嵌合抗体或其片段;(2)全人抗体或其片段;或,(3)人源化抗体或其片段。
5.权利要求4所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,其与人CD38结合的解离常数(KD)不大于5nM,与食蟹猴CD38结合的解离常数(KD)不大于25nM。
6.权利要求5所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体包含人或鼠抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中任意一种的恒定区的序列。
7.权利要求6所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,包含人或鼠抗体IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区的序列。
8.权利要求5所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗原结合片段选自F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体中的一种或多种。
9.一种分离的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段。
10.包含权利要求9所述分离的核酸分子的表达载体。
11.包含权利要求9所述的分离的核酸分子、或权利要求10所述的表达载体的分离的宿主细胞。
12.如权利要求11所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
13.如权利要求12所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞来源于哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、大肠杆菌和/或枯草杆菌。
14.如权利要求13所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
15.一种抗体或抗原结合片段的制备方法,其特征在于,在适当的条件下培养权利要求11-14任一项所述的宿主细胞,并分离抗体或抗原结合片段。
16.一种药物组合物,其特征在于,所述组合物包含权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求9的分离的核酸分子、权利要求10的表达载体、权利要求11-14任一项所述的细胞,或权利要求15的方法制备的产品,以及药学上可接受的载体。
17.如权利要求16所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
18.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求9的分离的核酸分子、权利要求10的表达载体、权利要求11-14任一项所述的细胞,或权利要求15的方法制备的产品,以及使用说明。
19.权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求9的分离的核酸分子、权利要求10的表达载体、权利要求11-14任一项所述的细胞、权利要求15的方法制备的产品、或权利要求16-17任意一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗CD38表达异常相关的疾病的药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途,其特征在于,其中所述疾病为肿瘤。
21.一种嵌合抗原受体(CAR),其特征在于,所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域,所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段。
22.一种免疫效应细胞,其特征在于,所述免疫效应细胞表达权利要求21所述的嵌合抗原受体,或包含编码权利要求21所述嵌合抗原受体的核酸片段。
23.如权利要求22所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(doublenegative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞。
24.如权利要求23所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述T细胞选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞。
25.如权利要求24所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
26.一种多特异性抗体,其特征在于,所述多特异性抗体包含权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段。
27.如权利要求26所述的多特异性抗体,其特征在于,所述多特异性抗体进一步包含特异性结合CD38以外的抗原或结合与权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段不同的CD38表位的抗体或抗原结合片段。
28.如权利要求26或27所述的多特异性抗体,其特征在于,所述多特异性抗体为双特异性、三特异性或四特异性,所述多特异性抗体为二价、四价或六价。
29.权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂。
30.如权利要求29所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,治疗剂选自放射性同位素、细胞毒性剂或免疫调节剂,所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂。
31.如权利要求30所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素(doxorubicin)或紫杉烷类(taxanes)。
32.权利要求1-8任一项所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段还连接有另一功能性分子,所述功能性分子选自以下一种或多种:信号肽、蛋白标签、或细胞因子。
33.如权利要求32所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述细胞因子选自IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNF-alpha。
CN202080066375.1A 2019-12-13 2020-12-11 一种抗cd38的抗体及其用途 Active CN114616245B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911286272 2019-12-13
CN2019112862721 2019-12-13
PCT/CN2020/135547 WO2021115404A1 (zh) 2019-12-13 2020-12-11 一种抗cd38的抗体及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114616245A CN114616245A (zh) 2022-06-10
CN114616245B true CN114616245B (zh) 2024-02-23

Family

ID=76329601

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080066375.1A Active CN114616245B (zh) 2019-12-13 2020-12-11 一种抗cd38的抗体及其用途

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114616245B (zh)
WO (1) WO2021115404A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116120455B (zh) * 2021-08-23 2023-11-07 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗ca15-3蛋白的重组抗体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106456731A (zh) * 2014-02-28 2017-02-22 詹森生物科技公司 用于治疗急性成淋巴细胞性白血病的抗cd38抗体
WO2018224682A1 (en) * 2017-06-08 2018-12-13 Tusk Therapeutics Ltd Cd38 modulating antibody

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1976950B (zh) * 2004-02-06 2012-08-29 莫佛塞斯公司 抗cd38人抗体及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106456731A (zh) * 2014-02-28 2017-02-22 詹森生物科技公司 用于治疗急性成淋巴细胞性白血病的抗cd38抗体
WO2018224682A1 (en) * 2017-06-08 2018-12-13 Tusk Therapeutics Ltd Cd38 modulating antibody

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YU,T.等.Novel anti-CD38 humanized mAb SG003 possessed enhanced cytotoxicity in lymphoma than Daratumumab via antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.BMC Biotechnology.2019,第19卷第1-10页. *
高欣等.抗CD38单克隆抗体治疗多发性骨髓瘤研究进展.现代肿瘤医学.2019,第27卷(第09期),1617-1620. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021115404A1 (zh) 2021-06-17
CN114616245A (zh) 2022-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109563165B (zh) 抗ctla-4抗体
KR102384845B1 (ko) 항-pd-l1 항체 및 그의 용도
EP3904386A1 (en) Antibody and use thereof
JP2021008487A (ja) 抗nkg2a抗体を使用した治療計画
EP3907240A1 (en) Anti-tnfr2 antibody and use thereof
JP2020514363A (ja) 腫瘍特異的細胞枯渇のためのFc最適化抗CD25
JP2019517773A (ja) 抗lag−3抗体
KR20170102167A (ko) 항-pd-l1 항체
KR20160024391A (ko) 종양 성장 및 전이를 억제하기 위한 면역 조절 요법과 병용되는 세마포린-4d 억제성 분자의 용도
TWI742054B (zh) Gitr抗體,方法及用途
JP7438939B2 (ja) Cd137を標的とする抗体とその利用方法
EP2542258A1 (en) Monoclonal antibodies directed to cd52
WO2022161425A1 (zh) 抗tnfr2人源化抗体及其用途
JP2021177770A (ja) CD66cに特異的に結合する抗体およびその用途
JP2022529350A (ja) アンタゴニスト抗cd7抗体
US20120027763A1 (en) Antibody for Targeted induction of Apoptosis, CDC and ADCC mediated killing of Cancer cells, TBL-CLN1
JP2023179450A (ja) 抗-ヒトプログラム細胞死リガンド-1(pd-l1)の抗体及びその用途
EP4292611A1 (en) Anti-cd112r antibody and use thereof
CN114616245B (zh) 一种抗cd38的抗体及其用途
KR20220030937A (ko) 항체 및 사용 방법
RU2809746C2 (ru) Гуманизированное моноклональное антитело против vegf
WO2021013061A1 (zh) 一种人源化抗vegfr2抗体及其应用
WO2023098785A1 (zh) 抗4-1bb抗体及其用途
US20240052031A1 (en) Cea6 binding molecules and uses thereof
TW202227488A (zh) 抗人程序性死亡配體-1(pd-l1)的抗體及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220922

Address after: 264006 No.1 Heilongjiang Road, Yantai Economic and Technological Development Zone, Yantai City, Shandong Province

Applicant after: SHANDONG SIMCERE BIO-PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Applicant after: JIANGSU SIMCERE PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Address before: 210042 699 Xuanwu Road, Xuanwu District, Nanjing, Jiangsu -18

Applicant before: JIANGSU SIMCERE PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Applicant before: SIMCERE BIOLOGICAL MEDICINE TECHNOLOGY Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230628

Address after: 264006 No.1 Heilongjiang Road, Yantai Economic and Technological Development Zone, Yantai City, Shandong Province

Applicant after: SHANDONG SIMCERE BIO-PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Address before: 264006 No.1 Heilongjiang Road, Yantai Economic and Technological Development Zone, Yantai City, Shandong Province

Applicant before: SHANDONG SIMCERE BIO-PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Applicant before: JIANGSU SIMCERE PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant