CN114613423A - 用于弥漫大b细胞淋巴瘤化疗疗效预测的生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的生物标志物,包括ARHGEF12、THAP3、SMYD3、OR2G2、ALKBH3、RNASEH2C、ZNF280D、SLC5A11、CTDP1、GPR15、GOLGB1、FBXL4和LMBR1的组合。通过本发明提供的生物标志物可以有效预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗的治疗效果,灵敏度和特异性分别达到0.82、0.75,AUC值为0.78。根据该生物标志物进行疗效预测,具有安全无创、样本易于获得、准确性高、操作方便等优点,为弥漫大B细胞淋巴瘤化疗治疗效果评价提供准确的判断。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种用于弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效预测的生物标志物。
背景技术
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是侵袭性淋巴组织肿瘤的主要类型,约占非霍奇金淋巴瘤的30%。虽然DLBCL患者多为老年人,但本病在各年龄段均有发现。自10年前利妥昔单抗(R)联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松(CHOP)化疗方案(R-CHOP)以来,DLBCL患者的总生存率明显提高。
然而,30%-50%的患者对这种标准治疗不敏感,现有的方法不能准确或有效地在治疗前预测R-CHOP的治疗效果。目前,正电子发射断层扫描(PET)-CT是评价不同治疗方案对DLBCL疗效的金标准。然而,它通常在治疗后使用,因此不能***治疗效果。国际预后指数(IPI)是当前采用的对DLBCL尤其是高危患者的主要预后风险的评估方法,可用于R-CHOP化疗。然而,通过IPI预测R-CHOP对DLBCL患者的治疗效果的准确性较低。因此,发现一种准确的方法来***DLBCL的R-CHOP方案的治疗效果是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效预测的生物标志物,本发明提供的生物标志物可以有效预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效,灵敏度和特异性分别达到0.82、0.75,AUC值为0.78。根据该生物标志物进行疗效预测,具有安全无创、样本易于获得、准确性高、操作方便等优点,为弥漫大B细胞淋巴瘤化疗治疗效果评价提供准确的判断。
为此,本发明采用以下技术方案。
本发明的第一方面提供一种生物标志物,所述生物标志物包括ARHGEF12、THAP3、SMYD3、OR2G2、ALKBH3、RNASEH2C、ZNF280D、SLC5A11、CTDP1、GPR15、GOLGB1、FBXL4和LMBR1的组合。
第二方面,本发明提供所述生物标志物在制备用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的产品中的用途,所述用途包括用于构建预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的模型。
进一步,所述化疗的方案为:利妥昔单抗(R)联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松(CHOP)的化疗方案。本领域通常将该化疗方案简称为R-CHOP。
第三方面,本发明提供一种预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的模型,所述模型的输入变量为本发明所述的生物标志物的含量。
进一步,所述生物标志物的含量的测定方法为5hmC高通量检测;在具体的实施方式中,所述测定方法为5hmC-Seal。
第四方面,本发明提供一种预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的模型的构建方法,包括如下步骤:
(1)分别检测来自多例经化疗的弥漫大B细胞淋巴瘤患者的样本,获得DNA的5hmC测序数据;
(2)将步骤(1)得到的测序数据依次进行第一过滤、筛选、第二过滤,获得用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的生物标志物;
所述第一过滤包括:去除仅在小于等于10个样本中出现的锋信息;
所述筛选包括:用DEseq2软件比对来自不同样本的测序数据,保留reads数大于50的5hmC峰区域,按照FoldChage>=0.5,pvalue<0.01,找出5hmC上下调的差异生物标志物;
所述第二过滤包括:对于经所述筛选得到的差异生物标志物,使用Scikit-Learn中的递归特征消除算法(RFECV)进行过滤,获得用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的生物标志物:ARHGEF12、THAP3、SMYD3、OR2G2、ALKBH3、RNASEH2C、ZNF280D、SLC5A11、CTDP1、GPR15、GOLGB1、FBXL4和LMBR1;
(3)将步骤(2)获得的生物标志物的数据输入机器学习模型,训练模型,存储训练后的模型,获得预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的模型。
进一步,所述样本为血浆;在具体的实施方式中,所述样本为外周血。
进一步,所述经化疗的弥漫大B细胞淋巴瘤患者包括经治疗效果评价为完全缓解(CR)的患者、部分缓解(PR)的患者、疾病稳定(SD)的患者和疾病进展(PD)的患者。
进一步,在所述第二过滤中,使用的参数为:estimator=LogisticRegressionCV(class_weight='balanced',cv=2,max_iter=1000),scoring='accuracy')
进一步,步骤(3)中,所述机器学习模型包括:通过训练logistic回归CV模型(LR)。
进一步,所述化疗的方案为:利妥昔单抗(R)联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松(CHOP)的化疗方案。
logistic回归又称logistic回归分析,是一种广义的线性回归分析模型,本发明利用logistic回归分析进行数据挖掘,探讨与弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效相关的因素,并根据该因素预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效。通过logistic回归分析,可以得到自变量的权重,从而可以了解到底哪些因素是与弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效密切相关的因素。同时根据该权值可以根据该因素预测一个人的弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效。对于本发明提供的模型,经采用受试者工作特征(ROC)分析评价模型的性能,利用sklearn计算曲线下面积(AUC),模型的灵敏度和特异性分别达到0.82、0.75,ROC值为0.78。
第五方面,本发明提供一种用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的产品,所述产品基于所述预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的模型对弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效进行预测。
DNA的5-甲基胞嘧啶(5mCs)是一种重要的表观遗传学特征,在基因表达和肿瘤发生发展中发挥着重要作用。本发明通过高通量测序技术,发现预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的5-羟甲基胞嘧啶生物标志物,对弥漫大B细胞淋巴瘤患者R-CHOP治疗效果提前做出有效预测。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明提供一种用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的生物标志物,可对弥漫大B细胞淋巴瘤患者化疗疗效提前做出有效预测。
(2)本发明还提供了一种用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的模型,模型的灵敏度和特异性分别达到0.82、0.75,AUC值为0.78,具有特异性强、灵敏度高的优点。通过应用本发明所述的生物标志物和/或模型,可对患者的弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效实现安全无创、准确性高的预测。
(3)根据本发明提供的生物标志物和模型,进行化疗疗效预测的样品为外周血,易于获得;预测方法依托于高通量测序,检测效率高;预测模型可靠,预测结果的准确性高。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述,各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的,而并不认为是对本发明的限制。在附图中:
图1:训练组中13个特征5hmC markers中单个marker的预测准确性;
图2:验证组中13个特征5hmC markers中单个marker的预测准确性。其中,ARHGEF12(AUC=0.76)和ZNF280D(AUC=0.76)表现出最高的预测准确性。
图3:5hmC差异性markers的特征选择。递归特征选择算法选择13个特征作为获得最佳交叉验证分数的最小特征数。x轴是所选特征的数量,y轴是模型性能的交叉验证得分。
图4:在训练和验证队列中使用13个5hmC特征Markers构建的预测模型的受试者工作特性(ROC)曲线。绘制成真实阳性率(灵敏度)和假阳性率(1-特异性)的函数。在训练组中,这13个5hmC特征Markers构建的预测模型可以有效预测对R-CHOP治疗有反应者和无反应者(AUC=1.00),在验证组中,基于13个5hmC特征Markers的预测模型同样可以有效预测对R-CHOP治疗有效者和无效者(AUC=0.78)。
图5:验证组中预测模型性能的混淆矩阵(治疗有效者:22人,治疗无效者:8人)。结果显示:22例治疗有效者中,基于13个5hmC特征Markers的预测模型预测了18人治疗有效,灵敏度达到0.82;在8例治疗无效者中,基于13个5hmC特征Markers的预测模型预测了6人治疗无效,特异性为0.75。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式,然而应当理解,可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反,提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开,并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明提供一种预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的模型,模型中13个5hmC特征生物标志物的相关参数见表1所示:
表1
Markers | GeneID | Coefficients | SE | z.value | p.value |
Intercept | -5.5704 | 0.867 | 2.652 | <0.01 | |
chr1_6721489_6721898 | THAP3 | 0.7712 | 0.145 | 1.865 | <0.05 |
chr1_246290825_246291238 | SMYD3 | 0.39 | 0.149 | 1.955 | <0.05 |
chr1_247755954_247756505 | OR2G2 | 3.1779 | 0.108 | 1.344 | <0.05 |
chr11_43905400_43905804 | ALKBH3 | 3.3423 | 0.128 | 1.306 | <0.05 |
chr11_65511519_65512429 | RNASEH2C | 1.5211 | 0.072 | 2.061 | <0.05 |
chr11_120211662_120212234 | ARHGEF12 | -3.8797 | 0.115 | -3.225 | <0.001 |
chr15_56982146_56982638 | ZNF280D | -1.2266 | 0.177 | -3.250 | <0.001 |
chr16_24916341_24916920 | SLC5A11 | 0.6683 | 0.076 | 0.149 | <0.05 |
chr18_77500908_77501376 | CTDP1 | -2.573 | 0.103 | -3.182 | <0.001 |
chr3_98270705_98271079 | GPR15 | 0.1052 | 0.167 | 2.348 | <0.05 |
chr3_121430838_121431239 | GOLGB1 | 0.8526 | 0.178 | 2.982 | <0.01 |
chr6_99461404_99461922 | FBXL4 | 1.7188 | 0.101 | 2.165 | <0.05 |
chr7_156700537_156701031 | LMBR1 | 1.0942 | 0.078 | 0.579 | <0.05 |
在本发明的实施例中,采用5hmC-Seal高通量测序法对样本进行测序,对以下实施例所采用的5hmC-Seal高通量测序法解释如下:
5hmC-Seal是一种基于5hmC的高通量测序方法。这种方法以改进后的化学糖基化标记为基础,结合二代高通量测序技术,得到5hmC在基因组DNA上的分布信息。
由于化学标记法的高度灵敏特性,输入的DNA可以低至1-10ng,所述的DNA可以是打碎后的基因组DNA,也可以是cfDNA等小片段,按照二代测序的要求,在DNA片段两端进行补平,之后在3’端连接上一个A tail,借由AT特异性连接在每个DNA片段两端连上测序Y形接头,其中包含了区分样品的index信息和扩增引物等序列。之后,进入5hmC的标记步骤,先加入UDP-6-N3-Glc,在特定条件下,使DNA上的5hmC都反应变为N3-5ghmC,再加入DBCO-PEG4-Biotin,使N3-5ghmC都连上生物素,最后通过生物素-磁珠高效的特异性结合,筛选得到所有的包含5hmC位点的DNA片段,经过PCR扩增、纯化之后完成基于5hmC的DNA文库构建;通过Fragment Analyzer质控分析每个样品的DNA条带大小和分布,通过qPCR对文库进行精确定量后,用Illumina公司的Nextseq 500测序仪进行高通量测序,得到文库中所有DNA片段的碱基序列。
实施例1
86名经R-CHOP化疗的弥漫大B细胞淋巴瘤患者,包括经治疗效果评价为完全缓解(CR)的患者、部分缓解(PR)的患者、疾病稳定(SD)的患者和疾病进展(PD)的患者。取上述86名患者的外周血样品(3-4mL),从血浆中提取cfDNA进行5hmC-Seal高通量测序,每个样品的测序通量为1.5Gb,测序条带大小为38bp。具体步骤如下:
(1)样本收集:
在患者入院确诊时(未进行R-CHOP标准化疗前),共收集86例弥漫大B细胞淋巴瘤患者血液各8mL,并于24小时之内进行血浆分离操作,收集患者血浆样品。首先进行第一次离心,1350g、4℃低温离心12min,小心取出淡黄色上清,转移至2mLDNase free无菌EP管中,避免污染白细胞层。其次,进行第二次离心,1350g、4℃低温离心5min;小心取出上清,转移至2mL DNase free无菌EP管中,再次除去残留红细胞。第三步,离心,13500g、4℃低温离心5min;小心取出上清,转移至2mL DNase free无菌离心管中,可以获得约4mL左右的血浆,将获得的血浆贴好标签后冻存于-80度冰箱待用。
(2)抽提血浆DNA:
利用Quick-cfDNA Serum&Plasma Kit(ZYMO)试剂盒,从来自86位弥漫大B细胞淋巴瘤患者的血浆样品中分别抽提8-10ng血浆cfDNA。
(3)将cfDNA进行末端补齐并与测序接头连接:
根据KAPA HyperPlus Library Preparation Kit(96)说明书制备含有20uLcfDNA、2.8uL End Repair&A-Tailing Buffer和1.2uL End Repair&A-Tailing Enzymemix的反应混合液(总体积为24uL),在20温浴30分钟,然后在65温浴30分钟。接下来,在1.5mL低吸附EP管中配置以下连接反应混合物:2uL Nuclease free water,12uL LigationBuffer以及4uL DNA Ligase。向18uL连接反应混合物中加入2uL的测序接头,混合,加入至24uL反应样本中,于20摄氏度加热4小时。使用DNA Clean&Concentrator 5(ZYMO)纯化试剂盒对反应产物进行纯化,用20uL洗脱缓冲液进行洗脱获得最终的DNA连接样品。
(4)5hmC标记:
制备总体积为4uL的标记反应混合液:1uL 50uM UDP-N3-Glu、1uLβGT酶(NEB)和2uL HEPES缓冲液(pH 8.0,终浓度为50mM),将4uL标记混合液加入至20uL DNA连接样本中。将混合液在37摄氏度水浴2小时。取出混合液,用DNA Clean&Concentrator 5(ZYMO)纯化试剂盒对反应产物进行纯化,获得纯化的30uL DNA。然后在上述纯化的30uL DNA中加入1uLDBCO-PEG4-Biotin(Click Chemistry Tools),于37摄氏度水浴1小时,接着用DNA Clean&Concentrator 5(ZYMO)纯化试剂盒对反应产物进行纯化,获得30uL纯化的标记产物。
(5)5hmC富集:
首先,按以下步骤准备结合磁珠:取出2.5uL Dynabeads(Invitrogen)并加入100uL洗涤缓冲液(5mM Tris(pH 7.5)、lM NaCl和0.02%Tween20),吹打混匀,放置于1.5mL磁力架上,重复用100uL洗涤缓冲液洗涤结合磁珠3次,最后加入32uL结合缓冲液(10mMTris(pH 7.5)、2M NaCl和0.04%Tween20),并混合均匀。然后,在磁珠混合液中加入上述步骤获得的纯化的标记产物,并在旋转混合器中混合30min使其充分结合。最后,用100uL洗涤液(5mM Tris(pH 7.5)、lM NaCl和0.02%Tween20)洗涤磁珠5次,离心去掉上清液,加入23.8uL RNase-Free water。
(6)PCR扩增:
向上述步骤的最终体系中加入25uL 2X PCR master mix和1.25uL PCR引物(总体积为50u L),按照下述PCR反应循环的温度和条件进行扩增:
将扩增产物用AmpureXP beads纯化,得到最终5hmC文库,并用Qubit 3.0进行文库浓度测定。
(6)对5hmC文库质控后进行高通量测序:
将获得的5hmC文库进行Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳***质控,确定文库中DNA片段大小以及是否含有杂质;通过qPCR进行浓度测定。将通过质检的测序文库以相同浓度混合,用11lumina NextSeq500进行测序,使用的测序试剂盒是High Output Kitv2(75cycles),每个样品的测序通量为1.5Gb,测序条带大小为75bp。
(7)原始测序数据比对:
每个原始测序FASTQ数据先用Trimmomatic软件进行低质量数据修剪,再用Bowtie2软件比对到人基因组hg19上,使用MACS软件进行包含5hmC的reads数峰识别,参数为:effective genome size=2.72e+09;tag size=38;band width=100;model fold=10;P value cutoff=1.00e-05。
按照2:1的比例将86例样本随机拆分为训练组(training cohort)和验证组(validation cohort)。对比训练组(56例)不同患者血浆cfDNA的峰信息,进行过滤,条件为每个峰至少在10个样品中出现;用DEseq2软件比来自不同样本的DNA测序数据,找到的reads数大于50的5hmC峰区域,按|log2FoldChange|>=0.5,pvalue<0.01,分别找出5hmC上下调的差异生物标志物。然后,使用Scikit-Learn中的递归特征消除算法(RFECV)对所述差异生物标志物进行进一步过滤,筛选特征生物标志物(使用参数:estimator=LogisticRegressionCV(class_weight='balanced',cv=2,max_iter=1000),scoring='accuracy')。进一步的,利用筛选到的特征biomarkers进行模型构建,训练logistic回归CV模型(LR),并采用受试者工作特征(ROC)分析评价模型的性能,利用sklearn计算曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性,其中训练组中13个特征5hmC markers中单个marker的预测准确性可见图1,验证组中13个特征5hmC markers中单个marker的预测准确性可见图2。最后,经过100次的训练,发现13个特征5hmC markers构建的预测模型可以达到最佳的交叉验证分数,结果见图3。将构建好的LR预测模型用于预测验证组中患者的治疗结果,可见图4。将构建好的LR预测模型用于实施例2预测验证组中患者的治疗结果。
实施例2
取实施例1中的验证组(30例,其中CR 14例、PR 8例、SD 3例、PD 5例)的患者的外周血按照实施例1中的实验方法进行样本收集/cfDNA提取/构建文库/文库测序,对测序数据进行处理分析,筛选出5hmC富集位点。然后根据筛选出的5hmC富集位点通过实施例1获得的预测模型进行疗效预测。预测结果如图5所示,结果显示,22例PRCR患者中有18例预测为PRCR,灵敏度为0.82;8例PDSD患者中有6例预测为PDSD,特异性为0.75。
由此可得出结论,本发明提供的基于上述13个5hmC特征生物标志物构建的预测模型可以有效***弥漫大B细胞淋巴瘤患者R-CHOP化疗的治疗效果。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的生物标志物,其特征在于,所述生物标志物包括ARHGEF12、THAP3、SMYD3、OR2G2、ALKBH3、RNASEH2C、ZNF280D、SLC5A11、CTDP1、GPR15、GOLGB1、FBXL4和LMBR1的组合。
2.如权利要求1所述的生物标志物在制备用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的产品中的用途,其特征在于,所述用途包括用于构建预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的模型。
3.如权利要求2所述的生物标志物的用途,其特征在于,所述化疗的方案为:利妥昔单抗联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松的化疗方案。
4.一种基于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的模型的产品,其特征在于,所述模型的输入变量为权利要求1所述的生物标志物的含量。
5.如权利要求4所述的产品,其特征在于,所述生物标志物的含量的测定方法为5hmC高通量检测;优选为5hmC-Seal。
6.如权利要求4所述的产品,其特征在于,所述模型的构建方法包括如下步骤:
(1)分别检测来自多例经化疗的弥漫大B细胞淋巴瘤患者的样本,获得DNA的5hmC测序数据;
(2)将步骤(1)得到的测序数据依次进行第一过滤、筛选、第二过滤,获得用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的生物标志物;
所述第一过滤包括:去除仅在小于等于10个样本中出现的峰信息;
所述筛选包括:用DEseq2软件比对来自不同样本的测序数据,保留reads数大于50的5hmC峰区域,按照|log2FoldChange|>=0.5,pvalue<0.01,获得5hmC上下调的差异生物标志物;
所述第二过滤包括:对于经所述筛选得到的差异生物标志物,使用Scikit-Learn中的递归特征消除算法进行过滤,获得用于预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的生物标志物:ARHGEF12、THAP3、SMYD3、OR2G2、ALKBH3、RNASEH2C、ZNF280D、SLC5A11、CTDP1、GPR15、GOLGB1、FBXL4和LMBR1;
(3)将步骤(2)获得的生物标志物的数据输入机器学习模型,训练模型,存储训练后的模型,获得预测弥漫大B细胞淋巴瘤化疗疗效的模型。
7.如权利要求6所述的产品,其特征在于,所述样本为血浆;优选为外周血。
8.如权利要求6所述的产品,其特征在于,所述经化疗的弥漫大B细胞淋巴瘤患者包括经治疗效果评价为完全缓解的患者、部分缓解的患者、疾病稳定的患者和疾病进展的患者。
9.如权利要求6所述的产品,其特征在于,所述第二过滤中,使用的参数为:estimator=LogisticRegressionCV(class_weight='balanced',cv=2,max_iter=1000),scoring='accuracy') 。
10.如权利要求6所述的产品,其特征在于,所述步骤(3)中,所述机器学习模型包括:通过训练logistic回归CV模型。
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