CN114592009A - 一种促进心肌再生的重组腺相关病毒gas6的制备方法及运用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种促进心肌再生的重组腺相关病毒GAS6的制备方法及运用。本发明以腺相关病毒(AAV)为载体携带重组Gas6基因，与已获得临床应用的腺病毒载体相比，AAV在注射后引起的免疫反应是微弱并且短暂的。采用的是搭载心肌细胞特异性启动子cTNT的腺相关病毒载体，当AAV成功转染心肌组织时，只有心肌细胞才能启动载体表达外源性Gas6基因，从而实现细胞特异性治疗。

Description

一种促进心肌再生的重组腺相关病毒GAS6的制备方法及运用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种促进心肌再生的重组腺相关病毒GAS6的制备方法及运用。
背景技术
实现组织器官损伤后完全再生修复一直是生命科学领域内极为复杂和至关重要的科学问题。
目前，人们已经研发出若干种实现心肌再生的策略，包括细胞疗法、生物材料、组织工程、重编程、内源性修复调节等，其治疗效果及安全性参差不齐。其中，立足于发育生物学的内源性心脏再生策略由于自身的独特优势，成为探索促进心肌梗死后修复的重要研究方向。哺乳动物内源性心脏再生能力随着生物发育进程而逐渐丧失，譬如：小鼠心脏仅在出生7天内具有短暂再生能力，心梗后迅速启动再生反应，促进心肌增殖和抑制成纤维***，最终实现组织和功能完全修复。不仅如此，人类新生儿在心脏损伤后也具有类似的修复能力。然而，成年哺乳动物心肌仅保持极低的自我更新能力(人类心肌细胞每年自我更新率约1％(***)至0.45％(老年期))，这种微弱的增殖能力虽然不足以弥补一次心肌梗死造成的数以万计的细胞丢失，但为激活成年心肌再生的研究带来曙光。目前已发现若干种基因，如ERBB2、Yap/Hippo、CHK1等，在心肌出生后发育过程中表达减弱/消失，伴随着新生心肌内源性再生能力的丧失；但在成年阶段心肌特异性恢复其表达，可再次启动损伤后的心肌的内源性再生修复能力。
Gas6是一种维生素K依赖性外分泌蛋白，分子量约75KDa，其生物学效应主要依赖于与细胞表面TAM受体结合并激活其下游信号通路。TAM受体属于受体络氨酸激酶家族，目前发现可与Gas6结合的TAM受体包括Tyro3、Axl和MerTK，其中Axl与Gas6亲和力最高。Gas6参与调节细胞存活、增殖、炎症等多种生物功能，在睾酮促毛囊再生的过程中，通过上调真皮***释放的Gas6可促进毛囊干细胞增殖。
通过检索国内外文献，尚没有发现GAS6可通过促进心肌细胞增殖和抑制心脏过度的纤维化以改善心肌梗死或心肌缺血再灌注损伤后心功能恢复的文献报道。
发明内容
针对上述技术背景提到的不足，本发明的目的在于提供一种促进心肌再生的重组腺相关病毒GAS6的制备方法及运用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种促进心肌再生的重组腺相关病毒GAS6的制备方法及运用，所述制备与运用流程如下：
S1、载体酶切：配制50μl酶切体系，按顺序依次加入体系中的各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h或过夜；
S2、目的基因片段获取：设计并合成Gas6基因引物，并利用PCR扩增目的基因片段；
S3、重组Gas6质粒构建；
S4、阳性克隆测序结果及结果分析；
S5、对重组腺相关病毒GAS6进行滴度测定并在促进心肌再生修复进行应用。
进一步的，所述步骤S1中所用载体的信息为：GV571；元件顺序：cTNTp-MCS-3Flag-T2A-EGFP；克隆位点：NheI/NcoI。
进一步的，所述步骤S2中设计并合成Gas6基因引物：构建含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因的引物。
进一步的，所述S3重组Gas6质粒构建具体方法如下：
S31、产物交换入线性化表达载体
S32、PCR鉴定引物：合成如下引物：Gas6(74802-1)-p3：AAGATGCTGTAATGAAGATC；Gas6(74802-1)-p4：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
S33、PCR鉴定结果：阳性转化子PCR产物大小：1085bp。
进一步的，所述步骤S5中滴度测定方法如下：
A1：准备AAV-293细胞；
A2：AAV-293细胞的转染；
A3：收毒；
A4：AAV病毒浓缩、纯化和超滤脱盐；
A5：病毒滴度的测定。
进一步的，所述步骤S5中重组腺相关病毒GAS6在促进心肌再生修复的应用步骤如下：
B1：成年小鼠心肌急性缺血再灌注损伤模型的制备及给药；
B2：重组腺相关病毒GAS6制剂在急性心肌缺血再灌注损伤后再生修复中的应用评估。
本发明的有益效果：
(1)本发明以腺相关病毒(AAV)为载体携带重组Gas6基因，与已获得临床应用的腺病毒载体相比，AAV在注射后引起的免疫反应是微弱并且短暂的。大剂量全身性特别是静脉使用虽然也会导致抗体的产生，但很少有感染上的细胞之后被细胞免疫***所清除，这被认为与AAV对抗体呈递细胞感染(APC)较弱相关。当AAV用于局部感染肌肉、脑、眼等组织时，重复感染效率基本上不会受到太大的影响。
(2)本发明采用的是搭载心肌细胞特异性启动子cTNT的腺相关病毒载体，当AAV成功转染心肌组织时，只有心肌细胞才能启动载体表达外源性Gas6基因，从而实现细胞特异性治疗。
(3)试验显示，当心肌细胞预先过表达Gas6蛋白时，心脏遭受急性心肌缺血损伤后心肌细胞可迅速启动自我增殖反应，并通过旁分泌Gas6调控心脏成纤维细胞的适度激活，最终促进了心肌再生，抑制心室重构，减少了纤维化面积，显著提高了心功能。
(4)本发明仅需注射操作，方便易行，可以避免体外循环、异体心脏移植等治疗的高风险。另外，本发明操作简单、实施条件可行，提供了一种新的心肌组织工程产品，为急性心肌梗死和急性心肌缺血再灌注损伤的生物学治疗提供了新的策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；
图1是GV571工具载体图谱；
图2是PCR扩增Gas6目的基因片段；
图3是重组Gas6病毒载体的PCR产物电泳；
图4是病毒制剂尾静脉注射2周后心脏组织内Gas6表达情况；
图5是病毒制剂尾静脉注射2周后心脏组织心肌细胞内特异性Gas6表达情况；
图6是术后3天心脏组织Ki67及PH3免疫荧光染色；
图7是术前3天及术后3、7、28天心脏EF值；
图8是术后28天心脏纤维化面积。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1过表达小鼠Gas6基因的心肌细胞特异性腺相关病毒载体构建
1.目的基因及工具载体信息：
基因名称：Gas6(NM_019521)；物种：Mouse
载体名称：GV571；元件顺序：cTNTp-MCS-3Flag-T2A-EGFP；克隆位点：NheI/NcoI；载体图谱见图1.(GV571载体，NheI/NcoI酶切，购自上海吉凯基因化学技术有限公司)
2.载体酶切：配制50μl酶切体系，包括：ddH2O 42μl,10x CutSmart Buffer 5μl,病毒载体DNA(1μg/μl)2μl,AgeI(10U/μl)1μl。按顺序依次加入体系中的各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h或过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。
3.目的基因片段获取：
(1)设计并合成Gas6基因引物：构建含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因的引物。引物序列如下：Gas6(74802-1)-p1：AAGGCTAGAGTACTGCTAGCCGCCACCATGCCGCCACCGCCCGGGCC；Gas6(74802-1)-p2：TGGTGGCGACCGGTGCTAGGGGGGTGGCATGCTCCACAGGCG
(2)PCR扩增目的基因片段：参考PrimeSTAR HS DNA polymerase使用说明书，配制50μL反应体系：ddH2O 32.5μL,5×PS Buffer 10μL,dNTP Mix(2.5mM each)4μL,上游扩增引物(10μM)1μL,下游扩增引物(10μM)1μL,模板(10ng/μL)1μL,PrimeSTAR HS DNApolymerase0.5μL。轻轻吹打混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行反应。反应条件为：98℃,5min(1Cycle)；98℃10s,55℃10s,72℃90s(30Cycles)；72℃8min(1Cycle)；4℃∞(1Cycle)。获得PCR产物大小：2068bp；电泳图见图2。
4.重组Gas6质粒构建
(1)产物交换入线性化表达载体
(2)PCR鉴定引物：合成如下引物：Gas6(74802-1)-p3：AAGATGCTGTAATGAAGATC；Gas6(74802-1)-p4：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
(3)PCR鉴定结果：阳性转化子PCR产物大小：1085bp。PCR产物电泳图见图3。
5.阳性克隆测序结果及结果分析：
比对结果提示测通准确：
TGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTGCTAGCCGCCACCATGCCGCCACCGCCCGGGCCCGCCGCCGCCCTGGGCACTGCGCTTCTGCTGCTCCTGCTGGCTTCCGAGTCTTCTCACACTGTGCTGTTGCGGGCGCGTGAGGCGGCGCAGTTTCTGCGGCCCAGGCAGCGCCGCGCCTACCAAGTCTTCGAGGAGGCCAAGCAGGGCCACCTGGAACGGGAGTGCGTGGAGGAGGTGTGCAGCAAAGAGGAGGCCAGAGAGGTGTTCGAGAACGACCCCGAGACGGAGTATTTCTATCCACGATATCAAGAGTGCATGAGAAAATATGGCAGGCCTGAAGAAAAAAACCCAGATTTCGCCAAATGTGTTCAGAACTTGCCTGACCAGTGCACCCCAAACCCTTGTGATAAGAAGGGTACTCATATCTGCCAAGACCTCATGGGCAACTTCTTCTGCGTGTGCACAGATGGCTGGGGAGGCCGGCTCTGTGACAAAGATGTCAATGAGTGTGTCCAGAAGAATGGGGGCTGCAGCCAGGTCTGCCACAACAAACCAGGAAGCTTCCAATGTGCCTGCCATAGTGGCTTCTCGCTTGCATCAGACGGCCAGACCTGCCAAGATATCGATGAATGCACAGACTCAGACACCTGTGGGGACGCGCGATGCAAGAACTTGCCAGGCTCCTACTCTTGCCTCTGCGATGAGGGATATACATACAGCTCCAAGGAGAAGACCTGCCAAGATGTGGACGAGTGCCAGCAGGATCGCTGTGAGCAGACCTGTGTCAACTCCCCAGGCAGCTATACCTGCCACTGTGATGGGCGAGGGGGCCTAAAACTATCCCCAGACATGGATACTTGTGAGGACATCTTACCATGTGTGCCCTTCAGCATGGCCAAGAGCGTGAAGTCCTTGTACCTGGGCCGCATGTTCAGCGGGACCCCCGTGATTAGACTACGCTTCAAGAGGCTTCAGCCTACCAGGCTGCTGGCTGAATTTGACTTCCGCACTTTTGACCCTGAAGGAGTCCTCTTCTTCGCTGGAGGCCGTTCAGACAGCACCTGGATTGTCCTGGGCCTAAGAGCTGGGCGGCTTGAGCTGCAGCTTCGGTACAATGGCGTTGGGCGCATCACCAGCAGCGGGCCAACCATCAACCACGGCATGTGGCAAACTATCTCCGTGGAAGAGCTGGAACGTAACCTTGTCATCAAGGTCAACAAAGATGCTGTAATGAAGATCGCGGTAGCTGGGGAGCTGTTTCAGCTGGAGAGGGGCCTCTATCACCTGAATCTCACCGTGGGCGGCATTCCCTTCAAGGAGAGTGAGCTCGTCCAGCCGATTAACCCTCGCCTGGATGGGTGCATGAGGAGTTGGAACTGGCTGAACGGGGAAGACAGCGCCATCCAGGAGACAGTCAAGGCAAACACAAAAATGCAGTGCTTCTCTGTGACAGAAAGGGGCTCCTTCTTCCCGGGGAATGGATTTGCTACCTACAGGCTCAACTACACCCGAACATCGCTGGATGTCGGCACGGAAACCACCTGGGAAGTTAAAGTTGTGGCTCGGATCCGCCCTGCCACGGACACGGGGGTGCTGCTGGCGCTGGTGGGGGACGACGATGTCGTCCCCATCTCTGTGGCCCTAGTCGACTACCACTCTACAAAGAAGCTCAAGAAGCAGTTGGTGGTCCTGGCAGTTGAGGATGTTGCCCTGGCACTGATGGAAATCAAGGTGTGCGACAGCCAGGAACACACGGTCACTGTCTCCCTGCGGGAGGGTGAGGCCACCCTAGAAGTGGATGGCACAAAGGGCCAGAGTGAAGTGAGCACTGCCCAGCTGCAGGAGCGACTGGACACACTTAAGACACATCTGCAAGGCTCTGTGCACACCTATGTTGGAGGCCTGCCAGAAGTATCGGTGATTTCTGCACCCGTCACTGCGTTCTACCGCGGATGCATGACTCTGGAGGTAAACGGGAAAATCCTGGACCTGGATACGGCCTCGTACAAGCACAGTGACATCACCTCCCACTCCTGCCCGCCTGTGGAGCATGCCACCCCCCTAGCACCGGTCGCCACCATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAAAAGCTCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCCGCACCGGGATCCACCATCGATAT
实施例2重组腺相关病毒GAS6的出毒包装与病毒颗粒滴度测定
（1）准备AAV-293细胞：AAV-293细胞由商业化购买途径获得。在10cm细胞培养皿内加入10 ml DMEM生长培养基，加入3.0E+6个AAV-293细胞，48小时后待细胞贴壁用于转染。
(2)AAV-293细胞的转染：待细胞汇合度在70～80％时，采用磷酸钙转染方法，将上述过表达Gas6的病毒载体和2个包装质粒(pHelper质粒，携带腺病毒来源的基因；pAAV-RC质粒，携带AAV复制和衣壳基因)一同转染AAV-293细胞(每个质粒约加10ug)。转染结束后，将皿中的培养基替换为10ml新鲜的培养基，常规继续培养66-72小时。
(3)收毒：将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中，200g 3分钟离心分离细胞和上清。将上清另外存放，细胞用1ml PBS重悬。细胞悬浮液在液氮和37℃水浴中反复转移，冻融四次。10,000x g离心去除细胞碎片，将离心上清转移到一个新离心管中。
(4)AAV病毒浓缩、纯化和超滤脱盐：在上清中加入40％PEG8000直到终浓度为8％，冰上放置2小时后2,500×g离心30分钟，去掉上清液，沉淀用PBS重悬后与细胞裂解上清合并；3,000×g离心30分钟，将上清转移到另一个干净的管中。加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA。用0.45μm过滤头过滤，取滤出液即为病毒浓缩液。向病毒浓缩液中添加固体CsCl直到密度为1.41g/ml；在175,000g下离心24小时，以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品进行滴度测定，收集富集有AAV颗粒的组分。在Amicon-15超滤装置中加入4ml去离子水，将密度梯度离心得到的病毒液加入到超滤装置中，1,500×g离心大约5到10分钟，每5分钟检查一次剩余体积数，直到最终体积为200–250μL。加1X PBS稀释浓缩后的病毒使体积为4ml；重复上述过程3次；离心超滤管，使最终体积大约为0.5ml。
(5)病毒滴度的测定：采用定量PCR方法检测AAV载体的基因组拷贝数来测定AAV的病毒颗粒数，测定滴度在1.94E+13v.g./ml。
实施例3重组腺相关病毒GAS6(AAV9:cTNT-GAS6)制剂在促进心肌再生修复的应用
1.成年小鼠心肌急性缺血再灌注(I/R)损伤模型的制备及给药
采用30只8周龄(P56)雄性小鼠，随机分组为：AAV9-GAS6组(n＝15)，接受尾静脉注射2.4E+10vg的AAV9:cTNT-GAS6制剂(实施例2制备)；AAV9-CON组(n＝15)，接受尾静脉注射2.4E+10vg的AAV9:cTNT-CON空载质粒对照。注射2周后，所有小鼠接受I/R损伤造模，具体操作如下：予以1.2070 Avertin腹腔注射(/kg)麻醉，气管插管后予以小动物呼吸机进行人工通气。采用眼科剪沿左侧第四肋肋间隙剪开皮肤，眼科镊钝性分离肋间肌肉后进入胸腔，暴露左心耳，采用6-0自左心耳最下缘进针，自肺动脉圆锥与左心耳交界处出针，予非永久性结扎左前降支(LAD)中上段，观察心室前壁心肌变苍白则提示结扎正确。从结扎成功开始计时30分钟，而后解开结扎线，采用6-0缝合线逐层缝合肋间肌与皮肤切口。术闭后将小鼠置于恒温台上待其苏醒。
2.AAV9:cTNT-GAS6制剂在急性心肌缺损再灌注损伤后再生修复中的应用评估
病毒制剂尾静脉注射2周后，每组分别随机选取3只小鼠进行心脏组织取材，免疫印迹法(图4)和免疫荧光法(图5)检测Gas6在心肌组织内过表达成功，提示AAV9:cTNT-GAS6制剂的干预成功。随即，剩余小鼠进行心脏超声检测，评估术前心脏泵血功能。而后，所有小鼠接受I/R损伤造模，术后当天全部存活，并用于下述实验：
第一部分：在术后第3天，每组随机选取3～4只小鼠，取材新鲜的损伤边缘区组织制作石蜡切片，分别进行Ki67及PH3染色发现，AAV9-GAS6组小鼠的损伤边缘区的心肌细胞的细胞周期活性、有丝***显著增多，提示AAV9:cTNT-GAS6制剂可以促进成年小鼠I/R损伤后心肌细胞的增殖(见图6)。
第二部分：每组随机选取8只小鼠用于监测术后各时间点的心脏功能恢复情况。在术后第3天、第7天及第28天，行心脏超声检测I/R损伤后两组心脏功能受损的恢复情况。术后28天，AAV9-Gas6组存活6只，AAV9-CON组存活6只。应用心超评估心梗小鼠心功能发现，相比于AAV9-CON组，AAV9-Gas6组小鼠的心脏射血分数(EF值)在术后3天开始显著提高，并维持缓慢升高趋势直至最长观察时间点，表明Gas6病毒制剂可以明显且持续促进小鼠I/R后心功能的恢复(见图7)。随后，在术后28天处死该部分实验的所有小鼠，取新鲜心脏组织行masson染色，发现AAV9-Gas6组小鼠较AAV9-CON组的心肌纤维化程度显著减少(见图8)。
以上结果说明，AAV9:cTNT-GAS6制剂可促进心肌再生修复，减少纤维化面积，抑制心脏重构，改善心脏功能。本实施方式表明AAV9:cTNT-GAS6制剂可作为急性心肌缺血再灌注损伤后的再生修复治疗新策略。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (6)

1.一种促进心肌再生的重组腺相关病毒GAS6的制备方法，其特征在于，所述制备与运用流程如下：
S1、载体酶切：配制50μl酶切体系，按顺序依次加入体系中的各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h或过夜；
S2、目的基因片段获取：设计并合成Gas6基因引物，并利用PCR扩增目的基因片段；
S3、重组Gas6质粒构建；
S4、阳性克隆测序结果及结果分析；
S5、对重组腺相关病毒GAS6进行滴度测定并在促进心肌再生修复进行应用。
2.根据权利要求1所述的一种促进心肌再生的重组腺相关病毒GAS6的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中所用载体的信息为：GV571；元件顺序：cTNTp-MCS-3Flag-T2A-EGFP；克隆位点：NheI/NcoI。
3.根据权利要求1所述的一种促进心肌再生的重组腺相关病毒GAS6的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中设计并合成Gas6基因引物：构建含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因的引物。
4.根据权利要求1所述的一种促进心肌再生的重组腺相关病毒GAS6的制备方法，其特征在于，所述S3重组Gas6质粒构建具体方法如下：
S31、产物交换入线性化表达载体
S32、PCR鉴定引物：合成如下引物：Gas6(74802-1)-p3：AAGATGCTGTAATGAAGATC；Gas6(74802-1)-p4：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
S33、PCR鉴定结果：阳性转化子PCR产物大小：1085bp。
5.根据权利要求1所述的一种促进心肌再生的重组腺相关病毒GAS6的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中滴度测定方法如下：
A1：准备AAV-293细胞；
A2：AAV-293细胞的转染；
A3：收毒；
A4：AAV病毒浓缩、纯化和超滤脱盐；
A5：病毒滴度的测定。
6.根据权利要求1所述的一种促进心肌再生的重组腺相关病毒GAS6的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中重组腺相关病毒GAS6在促进心肌再生修复的应用步骤如下：
B1：成年小鼠心肌急性缺血再灌注损伤模型的制备及给药；
B2：重组腺相关病毒GAS6制剂在急性心肌缺血再灌注损伤后再生修复中的应用评估。
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