CN114591898A - 用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，包括以下步骤：获取骨髓间充质干细胞：将人骨髓组织剪碎，用0.2％的Accutase或者0.2％的IV型胶原酶消化，制备干细胞悬浮液，并将所述干细胞悬浮液离心，用获得的细胞沉淀进行培养，20℃、饱和湿度、5％的CO2条件下，培养5～7天，得到原代骨髓间充质干细胞；将骨髓间充质干细胞重悬于生理盐水，在2～8℃的低温下、饱和湿度5％CO2条件下进行增殖性培养获得诱导上清液；收集诱导上清液，浓缩、冻干后，即制得骨髓间充质干细胞培养诱导组合物。本发明使得干细胞因子产量显著提高，即诱导效率显著提升，能广泛应用在骨髓移植造血等自体器官免排异移植领域的技术需求。

Description

用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，属于充质干细胞培养技术领域。
背景技术
间充质干细胞作为种子细胞，可通过自身分化进行以骨为代表的特定组织替代修复，但在自然条件下，分化效率有限。骨髓间充质干细胞作为一种多功能干细胞，在体内或者体外特定的诱导条件下，可分化为骨、软骨、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等多种组织细胞，广泛应用在器官医疗等领域。现有技术缺乏针对骨髓间充质干细胞培养的诱导组合物以及诱导组合物的制备方法，导致骨髓间充质干细胞传代培养的诱导效率低、干细胞因子产量低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤SS1：获取骨髓间充质干细胞：将人骨髓组织剪碎，用0.2％的Accutase或者0.2％的IV型胶原酶消化，制备干细胞悬浮液，并将所述干细胞悬浮液离心，用获得的细胞沉淀进行培养，20℃、饱和湿度、5％的CO2条件下，培养5～7天，得到原代骨髓间充质干细胞；所述原代骨髓间充质干细胞采用低传代方法传代培养骨髓间充质干细胞，在传代细胞融合度为50％～60％时收集骨髓间充质干细胞；
步骤SS2：将步骤SS1制备的骨髓间充质干细胞重悬于生理盐水，在2～8℃的低温下、饱和湿度5％CO2条件下进行增殖性培养获得诱导上清液；
步骤SS3：收集所述步骤SS2的诱导上清液，浓缩、冻干后，即制得骨髓间充质干细胞培养诱导组合物。
作为一种较佳的实施例，所述步骤SS2中，所述原代骨髓间充质干细胞为传代倍数为1～10代的低传代骨髓间充质干细胞。
作为一种较佳的实施例，所述步骤SS2中，增殖性培养时使用的培养基为富含胰岛素生长因子的HG-DMEM培养基。
作为一种较佳的实施例，所述步骤SS2具体包括：在2～8℃的低温下培养骨髓间充质干细胞，当骨髓间充质干细胞生长到50～60％融合度时，收集诱导上清液，并与富含胰岛素生长因子的HG-DMEM培养基混合，继续用于骨髓间充质干细胞的扩大培养，如此反复至细胞传代至12～15代。
作为一种较佳的实施例，所述步骤SS2中培养的时间为7～14天。
作为一种较佳的实施例，所述步骤SS1中骨髓间充质干细胞的培养采用含有胎牛血清的间充质干细胞培养基培养传代骨髓间充质干细胞；所述低传代骨髓间充质干细胞是指传代倍数为0～10代的骨髓间充质干细胞。
作为一种较佳的实施例，所述间充质干细胞培养基中的胎牛血清含量的体积百分比为2％～10％。
作为一种较佳的实施例，所述步骤SS3具体包括：①收集诱导上清液，在无菌环境下将骨髓间充质干细胞诱导上清液置于3.5KDa超滤离心管中，离心；②在无菌环境下打开离心管，用无菌枪头吸出离心管中的诱导上清液至3.5KDa透析袋中，在4℃条件下，将透析袋埋入PEG20000中脱水4小时；③将透析袋抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得骨髓间充质干细胞培养诱导组合物。
本发明还提出用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法制得的骨髓间充质干细胞培养诱导组合物。
本发明所达到的有益效果：本发明针对现有技术缺乏针对骨髓间充质干细胞培养的诱导组合物以及诱导组合物的制备方法，导致骨髓间充质干细胞传代培养的诱导效率低、干细胞因子产量低，远远不能满足骨髓移植造血等医疗领域的技术需求，通过研发用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法及制备的诱导组合物，使得干细胞因子产量（即蛋白质含量）显著提高，即诱导效率显著提升，同时不破坏骨髓间充质干细胞中的各种具有生物活性的细胞因子的细胞活性，能广泛应用在骨髓移植造血等自体器官免排异移植领域的技术需求。
具体实施方式
下面结合对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1 本发明提出用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤SS1：获取骨髓间充质干细胞：将人骨髓组织剪碎，用0.2％的Accutase或者0.2％的IV型胶原酶消化，制备干细胞悬浮液，并将所述干细胞悬浮液离心，用获得的细胞沉淀进行采用含有胎牛血清的间充质干细胞培养基培养，20℃、饱和湿度、5％的CO2条件下，培养5～7天，得到原代骨髓间充质干细胞；所述原代骨髓间充质干细胞采用低传代方法传代培养骨髓间充质干细胞，在传代细胞融合度为50％～60％时收集骨髓间充质干细胞；
步骤SS2：将步骤SS1制备的骨髓间充质干细胞重悬于生理盐水，在2～8℃的低温下、饱和湿度5％CO2条件下进行增殖性培养获得诱导上清液，增值性培养的时间为7～14天；
步骤SS3：：①收集诱导上清液，在无菌环境下将骨髓间充质干细胞诱导上清液置于3.5KDa超滤离心管中，离心；②在无菌环境下打开离心管，用无菌枪头吸出离心管中的诱导上清液至3.5KDa透析袋中，在4℃条件下，将透析袋埋入PEG20000中脱水4小时；③将透析袋抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得骨髓间充质干细胞培养诱导组合物。
然后用制得的骨髓间充质干细胞培养诱导组合物，采用含有胎牛血清的间充质干细胞培养基培养，20℃、饱和湿度、5％的CO2条件下，培养5～7天，得到原代骨髓间充质干细胞；再在2～8℃的低温下、饱和湿度5％CO2条件下进行增殖性培养获得传代细胞融合度为70％～90％时的骨髓间充质干细胞，检测干细胞因子产量（即蛋白质含量）显著提高，即诱导效率显著提升。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤SS1：获取骨髓间充质干细胞：将人骨髓组织剪碎，用0.2％的Accutase或者0.2％的IV型胶原酶消化，制备干细胞悬浮液，并将所述干细胞悬浮液离心，用获得的细胞沉淀进行培养，20℃、饱和湿度、5％的CO2条件下，培养5～7天，得到原代骨髓间充质干细胞；所述原代骨髓间充质干细胞采用低传代方法传代培养骨髓间充质干细胞，在传代细胞融合度为50％～60％时收集骨髓间充质干细胞；
步骤SS2：将步骤SS1制备的骨髓间充质干细胞重悬于生理盐水，在2～8℃的低温下、饱和湿度5％CO2条件下进行增殖性培养获得诱导上清液；
步骤SS3：收集所述步骤SS2的诱导上清液，浓缩、冻干后，即制得骨髓间充质干细胞培养诱导组合物。
2.根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤SS2中，所述原代骨髓间充质干细胞为传代倍数为1～10代的低传代骨髓间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤SS2中，增殖性培养时使用的培养基为富含胰岛素生长因子的HG-DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤SS2具体包括：在2～8℃的低温下培养骨髓间充质干细胞，当骨髓间充质干细胞生长到50～60％融合度时，收集诱导上清液，并与富含胰岛素生长因子的HG-DMEM培养基混合，继续用于骨髓间充质干细胞的扩大培养，如此反复至细胞传代至12～15代。
5.根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤SS2中培养的时间为7～14天。
6.根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤SS1中骨髓间充质干细胞的培养采用含有胎牛血清的间充质干细胞培养基培养传代骨髓间充质干细胞；所述低传代骨髓间充质干细胞是指传代倍数为0～10代的骨髓间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞培养基中的胎牛血清含量的体积百分比为2％～10％。
8.根据权利要求1所述的用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤SS3具体包括：①收集诱导上清液，在无菌环境下将骨髓间充质干细胞诱导上清液置于3.5KDa超滤离心管中，离心；②在无菌环境下打开离心管，用无菌枪头吸出离心管中的诱导上清液至3.5KDa透析袋中，在4℃条件下，将透析袋埋入PEG20000中脱水4小时；③将透析袋抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得骨髓间充质干细胞培养诱导组合物。
9.根据权利要求1～8任一项所述的用于骨髓间充质干细胞培养诱导组合物的制备方法制得的骨髓间充质干细胞培养诱导组合物。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006109757A (ja) * 2004-10-14 2006-04-27 Olympus Corp 骨髄由来間葉系幹細胞の培養方法
CN102978156A (zh) * 2012-11-13 2013-03-20 湖州市中心医院 一种骨髓间充质干细胞的体外扩增纯化培养方法及培养基
CN103667182A (zh) * 2012-12-17 2014-03-26 湖州市中心医院 一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法及诱导培养基
CN106244652A (zh) * 2016-08-17 2016-12-21 广州宏柯源生物科技有限公司 一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉的制备方法及制得的冻干粉

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006109757A (ja) * 2004-10-14 2006-04-27 Olympus Corp 骨髄由来間葉系幹細胞の培養方法
CN102978156A (zh) * 2012-11-13 2013-03-20 湖州市中心医院 一种骨髓间充质干细胞的体外扩增纯化培养方法及培养基
CN103667182A (zh) * 2012-12-17 2014-03-26 湖州市中心医院 一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法及诱导培养基
CN106244652A (zh) * 2016-08-17 2016-12-21 广州宏柯源生物科技有限公司 一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉的制备方法及制得的冻干粉

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