CN114574543A - 一种耐高温的乳酸菌选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐高温的乳酸菌选育方法，包括以下步骤：S1、培养基制备；MRS培养基：蛋白胨取10.0g、牛肉膏取10.0g、酵母膏取5.0g、柠檬酸氢二铵取2.0g、葡萄糖取驱动摩擦轮20.0g、吐温80取1.0mL、乙酸钠取5.0g，本发明作为一种耐高温的乳酸菌选育方法，先制备培养基，再通过乳酸菌初筛，乳酸菌鉴定，耐高温选育，生长曲线测定，产酸能力研究等步骤，最后得到耐高温的乳酸菌菌株，此过程通过对比实验，研究对温度耐受极限不同乳酸菌的产酸能力，且在本发明在进行耐高温选育时所使用的的选育箱通过可以转动的门，在培养皿拿出或送回时保证育选箱与外界空间隔绝，可以保证在取出目标培养皿的时候不会污染其他的培养皿，提高了实验的准确性和说服力。

Description

一种耐高温的乳酸菌选育方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种耐高温的乳酸菌选育方法。
背景技术
通过优良菌种的选育、发酵过程控制的研究和在线分离新工艺的提出对实现乳酸的工业化大规模生产有着显著的推进作用，对相关微生物发酵生产也有着一定的借鉴作用，在耐高温乳酸菌的选育研究上，将理化诱变同恒化器结合起来，大大地提高了正向突变植株的筛选效率，减少了在菌种筛选时的工作量，对于其他筛选环境有耐受性的菌株也有着一定的借鉴作用。乳酸菌生长适宜的温度为37℃左右，在对乳酸菌进行耐高温选育的时候需要提高乳酸菌生长环境的温度，大部分乳酸菌会在此过程死去，因此需要及时观测乳酸菌生长情况，在其生长状态发生变化时，需要及时将其从高温环境取出进行进一步的确认和研究，但是乳酸菌是厌氧菌，频繁的取出不耐高温的乳酸菌会对其他的乳酸生长环境产生影响。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种耐高温的乳酸菌选育方法。
一种耐高温的乳酸菌选育方法，其特征在于包括以下步骤：
S1、培养基制备；MRS培养基：蛋白胨取10.0g、牛肉膏取10.0g、酵母膏取5.0g、柠檬酸氢二铵取2.0g、葡萄糖取驱动摩擦轮20.0g、吐温80取1.0mL、乙酸钠取5.0g、磷酸氢二钾取2.0g、硫酸镁取0.58g、硫酸锰取0.传动齿轮25g、琼脂取滑轨18.0g、蒸馏水取1000mL，用高压灭菌锅在转动门1第一转动轴21℃灭菌支架15min，调节pH至6.2-6.6，种子培养基：液体MRS培养基；
S2、乳酸菌初筛；将1mL养殖水体作为菌源移入盛有9mL的灭菌生理盐水的试管中并摇匀，然后将其样品稀释，吸取稀释液0.1mL加到含0.5％碳酸钙的MRS培养基上，电源模块37℃厌氧培养同步带24h-48h，形成菌落后观察其形态，挑选周围有溶钙圈的菌落，在MRS平板上反复划线至得到单菌落；
S3、乳酸菌鉴定；菌落的形态鉴定通过菌落观察、革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色进行鉴定，乳酸菌生理生化鉴定通过吲哚实验、过氧化氢酶实验、还原硝酸盐实验和明胶液化实验进行鉴定；
S4、耐高温选育；将乳酸菌接种到种子培养基上，放入灭菌无氧的选育箱中，调整选育箱的初始温度为电源模块37℃，每隔6h调整一次温度，调整温度依次为伺服电机40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，期间每隔2h观察其菌落形态，挑出菌落生长状态明显落后于其他菌落的培养基移放至和当前选育箱温度相同的恒温培养箱内；
S5、生长曲线测定；挑取不同温度的恒温培养箱中的乳酸菌菌株接种到从动齿轮30mL的液体MRS培养基上，每隔2h测其OD值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，得到能适宜不同温度的乳酸菌的生长曲线；
S6、产酸能力研究；根据乳酸菌的生长曲线，选取相对应温度下的乳酸菌，根据生长曲线培育最适宜的生长时间，接种入新鲜的牛奶中，每隔2h测定牛奶的PH值，以时间为横坐标，PH值为纵坐标，得到乳酸菌产酸能力曲线；
S7、得到耐高温的乳酸菌；根据能适宜不同温度的乳酸菌的产酸能力，对比其能适宜的最高温度，得到耐高温且产酸能力在正常范围的乳酸菌，将其挑选出作为后期研究对象。
作为本发明的优选，在步骤S1中，乳酸菌生长代谢出乳酸后使pH值下降导致颜色由绿变为黄绿。
作为本发明的优选，在步骤S2中，样品稀释至10-5、10-6、10-7后，再分别滴加到MRS培养基上。
作为本发明的优选，在步骤S4和S5中，所述恒温培养箱包括多个温度不同的室，从所述选育箱取出的培养皿其温度保持不变。
作为本发明的优选，在步骤S4中，所述选育箱包括箱体，所述箱体内设有多个支撑板，相邻的两个所述支撑板之间设有多个托盘，每个托盘通过两个滑槽与所述箱体或者所述支撑板滑动连接，每个托盘上安放有一个培养皿。
作为本发明的优选，所述选育箱还包括多个固定板，每个所述固定板都与所述箱体或者所述支撑板固定连接，每个所述固定板上转动设有第二转动轴，每个所述第二转动轴上固定设有转动门和转动齿轮，每个所述转动齿轮一侧啮合有扇形齿轮，每个所述扇形齿轮固定设置在第三转动轴上，每个所述第三转动轴与所述箱体或者所述支撑板转动连接，每个所述第三转动轴上还固定设有传动摩擦轮和从动齿轮。
作为本发明的优选，每个所述从动齿轮一侧啮合有驱动齿轮，每个所述驱动齿轮固定设置在第四转动轴上，每个所述第四转动轴与所述箱体或者所述支撑板转动连接，每个所述第四转动轴上还固定设有驱动带轮，每个所述驱动带轮通过同步带传动有传动带轮，每个所述传动带轮固定设置在第五转动轴上，每个所述第五转动轴与所述箱体或者所述支撑板转动连接，每个所述第五转动轴上还固定设有传动齿轮。
作为本发明的优选，每个所述托盘的一侧设有一排齿，每个所述传动齿轮与所述托盘上的齿啮合。
作为本发明的优选，所述选育箱还包括多个滑轨，相邻的两个所述滑轨之间通过引导槽连接，最上侧的一个所述滑轨内滑动设有电源模块，所述电源模块的一侧固定连接有伺服电机，所述伺服电机一端控制有第六转动轴，所述第六转动轴上固定设有转动轮，所述电源模块远离所述伺服电机的一侧固定连接有驱动电机，所述驱动电机一端控制有第一转动轴，所述第一转动轴上固定设有驱动摩擦轮，所述驱动摩擦轮与其中一个所述传动摩擦轮摩擦传动。
作为本发明的优选，所述引导槽交错分布在所述滑轨的两侧，最上侧的一个所述引导槽位于所述滑轨靠近所述电源模块的一侧。
本发明的有益效果为：本发明作为一种耐高温的乳酸菌选育方法，先制备培养基，再通过乳酸菌初筛，乳酸菌鉴定，耐高温选育，生长曲线测定，产酸能力研究等步骤，最后得到耐高温的乳酸菌菌株，此过程通过对比实验，研究对温度耐受极限不同乳酸菌的产酸能力，且在本发明在进行耐高温选育时所使用的的选育箱通过可以转动的门，在培养皿拿出或送回时保证育选箱与外界空间隔绝，可以保证在取出目标培养皿的时候不会污染其他的培养皿，提高了实验的准确性和说服力。
附图说明
下面结合附图和具体实施方法对本发明做进一步详细的说明。
图1是本发明的操作步骤图；
图2是本发明的结构示意图；
图3是本发明图2的A-A方向示意图；
图4是本发明图3的B-B方向示意图；
图5是本发明图3的C处放大示意图；
图6是本发明图4的D处放大示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行详细描述。
在本发明的一个实施例中，参考图1至图6，提供一种耐高温的乳酸菌选育方法，包括以下步骤：
S1、培养基制备；MRS培养基：蛋白胨取10.0g、牛肉膏取10.0g、酵母膏取5.0g、柠檬酸氢二铵取2.0g、葡萄糖取驱动摩擦轮20.0g、吐温80取1.0mL、乙酸钠取5.0g、磷酸氢二钾取2.0g、硫酸镁取0.58g、硫酸锰取0.传动齿轮25g、琼脂取滑轨18.0g、蒸馏水取1000mL，用高压灭菌锅在转动门1第一转动轴21℃灭菌支架15min，调节pH至6.2-6.6，种子培养基：液体MRS培养基；
S2、乳酸菌初筛；将1mL养殖水体作为菌源移入盛有9mL的灭菌生理盐水的试管中并摇匀，然后将其样品稀释，吸取稀释液0.1mL加到含0.5％碳酸钙的MRS培养基上，电源模块37℃厌氧培养同步带24h-48h，形成菌落后观察其形态，挑选周围有溶钙圈的菌落，在MRS平板上反复划线至得到单菌落；
S3、乳酸菌鉴定；菌落的形态鉴定通过菌落观察、革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色进行鉴定，乳酸菌生理生化鉴定通过吲哚实验、过氧化氢酶实验、还原硝酸盐实验和明胶液化实验进行鉴定；
S4、耐高温选育；将乳酸菌接种到种子培养基上，放入灭菌无氧的选育箱中，调整选育箱的初始温度为电源模块37℃，每隔6h调整一次温度，调整温度依次为伺服电机40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，期间每隔2h观察其菌落形态，挑出菌落生长状态明显落后于其他菌落的培养皿移放至恒温培养箱内；
S5、生长曲线测定；挑取不同温度的恒温培养箱中的乳酸菌菌株接种到从动齿轮30mL的液体MRS培养基上，每隔2h测其OD值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，得到能适宜不同温度的乳酸菌的生长曲线；
S6、产酸能力研究；根据乳酸菌的生长曲线，选取相对应温度下的乳酸菌，根据生长曲线培育最适宜的生长时间，接种入新鲜的牛奶中，每隔2h测定牛奶的PH值，以时间为横坐标，PH值为纵坐标，得到乳酸菌产酸能力曲线；
S7、得到耐高温的乳酸菌；根据能适宜不同温度的乳酸菌的产酸能力，对比其能适宜的最高温度，得到耐高温且产酸能力在正常范围的乳酸菌，将其挑选出作为后期研究对象；
需要说明的是，当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH值下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH值降低再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌，通过形态鉴定和生理生化鉴定可以得到纯净的乳酸菌，先测定能耐受不同温度的乳酸菌的生长曲线在对其产酸能力进行研究，避免了由于生长时间有差异导致产酸能力测定不准确的情况。
有益地，在步骤S1中，乳酸菌生长代谢出乳酸后使pH值下降导致颜色由绿变为黄绿，通过观察其颜色可以对乳酸菌进行粗略筛选。
有益地，在步骤S2中，样品稀释至10-5、10-6、10-7后，再分别滴加到MRS培养基上，由于菌种中乳酸菌的数目不确定，无法确定稀释至哪一浓度来保证乳酸菌产生的菌落满足实验要求，所以选取不同浓度的稀释液进行对比。
有益地，在步骤S4和S5中，所述恒温培养箱包括多个温度不同的室，从所述选育箱取出的培养皿其温度保持不变，恒温培养箱的温度为乳酸菌能耐受的最大温度，保证此温度不变是保证实验准确性的重要因素。
有益地，在步骤S4中，所述选育箱包括箱体11，所述箱体11内设有多个支撑板17，相邻的两个所述支撑板17之间设有多个托盘14，每个托盘14通过两个滑槽13与所述箱体11或者所述支撑板17滑动连接，每个托盘14上安放有一个培养皿16，使用机械传动的方式来控制培养皿的取放，不直接接触培养皿可以有效避免对乳酸菌产生污染。
有益地，所述选育箱还包括多个固定板41，每个所述固定板41都与所述箱体11或者所述支撑板17固定连接，每个所述固定板41上转动设有第二转动轴31，每个所述第二转动轴31上固定设有转动门12和转动齿轮32，每个所述转动齿轮32一侧啮合有扇形齿轮33，每个所述扇形齿轮33固定设置在第三转动轴28上，每个所述第三转动轴28与所述箱体11或者所述支撑板17转动连接，每个所述第三转动轴28上还固定设有传动摩擦轮29和从动齿轮30采用所述扇形齿轮33对所述转动门12进行控制，在所述扇形轮33和所述转动齿轮32不啮合时，所述转动门12能在重力的作用下快速关闭。
有益地，每个所述从动齿轮30一侧啮合有驱动齿轮35，每个所述驱动齿轮35固定设置在第四转动轴36上，每个所述第四转动轴36与所述箱体11或者所述支撑板17转动连接，每个所述第四转动轴36上还固定设有驱动带轮34，每个所述驱动带轮34通过同步带24传动有传动带轮26，每个所述传动带轮26固定设置在第五转动轴27上，每个所述第五转动轴27与所述箱体11或者所述支撑板17转动连接，每个所述第五转动轴27上还固定设有传动齿轮25，通过所述同步带26传动保证所述培养皿16在取放时所述转动门12能第一时间开合，确保了其他的所述培养皿16不受污染。
有益地，每个所述托盘14的一侧设有一排齿，每个所述传动齿轮25与所述托盘14上的齿啮合通过所述托盘14上的齿对所述培养皿16进行平稳的传送，保证了培养皿中菌株的生存空间不会受到剧烈变化。
有益地，所述选育箱还包括多个滑轨18，相邻的两个所述滑轨18之间通过引导槽23连接，最上侧的一个所述滑轨18内滑动设有电源模块37，所述电源模块37的一侧固定连接有伺服电机40，所述伺服电机40一端控制有第六转动轴39，所述第六转动轴39上固定设有转动轮38，所述电源模块37远离所述伺服电机40的一侧固定连接有驱动电机22，所述驱动电机22一端控制有第一转动轴21，所述第一转动轴21上固定设有驱动摩擦轮20，所述驱动摩擦轮20与其中一个所述传动摩擦轮29摩擦传动，采用单一的动力源，大大降低了成本，用所述传动摩擦轮29进行传动，能保证转换传动零件是不受到剧烈磨损。
有益地，所述引导槽23交错分布在所述滑轨18的两侧，最上侧的一个所述引导槽23位于所述滑轨18靠近所述电源模块37的一侧，所述引导槽23不分布在所述滑轨18的同一侧，可以避免所述伺服电机40从最上侧的所述滑轨18直接滑动至最下侧所述滑轨18，所述伺服电机40只会一层一层的沿所述滑轨滑动。
选育箱的工作原理为：
通过控制电源模块37，控制伺服电机40和驱动电机22进行工作，启动伺服电机40，伺服电机40控制第六转动轴39转动，第六转动轴39带动转动轮38转动，转动轮38沿滑轨18和引导槽23滚动，至驱动电机22滑动至需要取走的培养皿16处，关闭伺服电机40，启动驱动电机22；
驱动电机22控制第一转动轴21转动，第一转动轴21带动驱动摩擦轮20转动，驱动摩擦轮20通过摩擦传动传动摩擦轮29，传动摩擦轮29带动第三转动轴28转动，第三转动轴28带动扇形齿轮33和从动齿轮30转动，通过啮合带动转动齿轮32转动，转动齿轮32带动第二转动轴31转动，第二转动轴31带动转动门12转动，同时，从动齿轮30通过啮合带动驱动齿轮35转动，驱动齿轮35带动第四转动轴36转动，第四转动轴36带动驱动带轮34转动，驱动带轮34通过同步带24带动传动带轮26转动，传动带轮26带动第五转动轴27转动，第五转动轴27带动传动齿轮25转动，传动齿轮25通过啮合带动托盘14沿滑槽13滑动，至培养皿16滑动到转动门12的另一侧，关闭驱动电机22；
此时扇形齿轮33不再与转动齿轮32啮合，转动齿轮32失去约束在转动门12重力的作用下，转动门12带动第二转动轴31转动至转动门12恢复垂直状态，人为打开箱体11取走目标培养皿16；
反向启动驱动电机22，驱动电机22控制第一转动轴21转动，第一转动轴21带动驱动摩擦轮20转动，驱动摩擦轮20通过摩擦传动传动摩擦轮29，传动摩擦轮29带动第三转动轴28转动，第三转动轴28带动扇形齿轮33和从动齿轮30转动，通过啮合带动转动齿轮32转动，转动齿轮32带动第二转动轴31转动，第二转动轴31带动转动门12转动，同时，从动齿轮30通过啮合带动驱动齿轮35转动，驱动齿轮35带动第四转动轴36转动，第四转动轴36带动驱动带轮34转动，驱动带轮34通过同步带24带动传动带轮26转动，传动带轮26带动第五转动轴27转动，第五转动轴27带动传动齿轮25转动，传动齿轮25通过啮合带动托盘14沿滑槽13滑动至初始位置，关闭驱动电机22，此时扇形齿轮33不再与转动齿轮32啮合，转动齿轮32失去约束在转动门12重力的作用下，转动门12带动第二转动轴31转动至转动门12恢复垂直状态；
本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种耐高温的乳酸菌选育方法，其特征在于包括以下步骤：
S1、培养基制备；MRS培养基：蛋白胨取10.0g、牛肉膏取10.0g、酵母膏取5.0g、柠檬酸氢二铵取2.0g、葡萄糖取驱动摩擦轮20.0g、吐温80取1.0mL、乙酸钠取5.0g、磷酸氢二钾取2.0g、硫酸镁取0.58g、硫酸锰取0.传动齿轮25g、琼脂取滑轨18.0g、蒸馏水取1000mL，用高压灭菌锅在转动门1第一转动轴21℃灭菌支架15min，调节pH至6.2-6.6，种子培养基：液体MRS培养基；
S2、乳酸菌初筛；将1mL养殖水体作为菌源移入盛有9mL的灭菌生理盐水的试管中并摇匀，然后将其样品稀释，吸取稀释液0.1mL加到含0.5％碳酸钙的MRS培养基上，电源模块37℃厌氧培养同步带24h-48h，形成菌落后观察其形态，挑选周围有溶钙圈的菌落，在MRS平板上反复划线至得到单菌落；
S3、乳酸菌鉴定；菌落的形态鉴定通过菌落观察、革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色进行鉴定，乳酸菌生理生化鉴定通过吲哚实验、过氧化氢酶实验、还原硝酸盐实验和明胶液化实验进行鉴定；
S4、耐高温选育；将乳酸菌接种到种子培养基上，放入灭菌无氧的选育箱中，调整选育箱的初始温度为电源模块37℃，每隔6h调整一次温度，调整温度依次为伺服电机40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，期间每隔2h观察其菌落形态，挑出菌落生长状态明显落后于其他菌落的培养基移放至和当前选育箱温度相同的恒温培养箱内；
S5、生长曲线测定；挑取不同温度的恒温培养箱中的乳酸菌菌株接种到从动齿轮30mL的液体MRS培养基上，每隔2h测其OD值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，得到能适宜不同温度的乳酸菌的生长曲线；
S6、产酸能力研究；根据乳酸菌的生长曲线，选取相对应温度下的乳酸菌，根据生长曲线培育最适宜的生长时间，接种入新鲜的牛奶中，每隔2h测定牛奶的PH值，以时间为横坐标，PH值为纵坐标，得到乳酸菌产酸能力曲线；
S7、得到耐高温的乳酸菌；根据能适宜不同温度的乳酸菌的产酸能力，对比其能适宜的最高温度，得到耐高温且产酸能力在正常范围的乳酸菌，将其挑选出作为后期研究对象。
2.根据权利要求1所述的一种耐高温的乳酸菌选育方法，其特征在于：在步骤S1中，乳酸菌生长代谢出乳酸后使pH值下降导致颜色由绿变为黄绿。
3.根据权利要求1所述的一种耐高温的乳酸菌选育方法，其特征在于：在步骤S2中，样品稀释至10-5、10-6、10-7后，再分别滴加到MRS培养基上。
4.根据权利要求1所述的一种耐高温的乳酸菌选育方法，其特征在于：在步骤S4和S5中，所述恒温培养箱包括多个温度不同的室，从所述选育箱取出的培养皿其温度保持不变。
5.根据权利要求1所述的一种耐高温的乳酸菌选育方法，其特征在于：在步骤S4中，所述选育箱包括箱体，所述箱体内设有多个支撑板，相邻的两个所述支撑板之间设有多个托盘，每个托盘通过两个滑槽与所述箱体或者所述支撑板滑动连接，每个托盘上安放有一个培养皿。
6.根据权利要求5所述的一种耐高温的乳酸菌选育方法，其特征在于：所述选育箱还包括多个固定板，每个所述固定板都与所述箱体或者所述支撑板固定连接，每个所述固定板上转动设有第二转动轴，每个所述第二转动轴上固定设有转动门和转动齿轮，每个所述转动齿轮一侧啮合有扇形齿轮，每个所述扇形齿轮固定设置在第三转动轴上，每个所述第三转动轴与所述箱体或者所述支撑板转动连接，每个所述第三转动轴上还固定设有传动摩擦轮和从动齿轮。
7.根据权利要求6所述的一种耐高温的乳酸菌选育方法，其特征在于：每个所述从动齿轮一侧啮合有驱动齿轮，每个所述驱动齿轮固定设置在第四转动轴上，每个所述第四转动轴与所述箱体或者所述支撑板转动连接，每个所述第四转动轴上还固定设有驱动带轮，每个所述驱动带轮通过同步带传动有传动带轮，每个所述传动带轮固定设置在第五转动轴上，每个所述第五转动轴与所述箱体或者所述支撑板转动连接，每个所述第五转动轴上还固定设有传动齿轮。
8.根据权利要求7所述的一种耐高温的乳酸菌选育方法，其特征在于：每个所述托盘的一侧设有一排齿，每个所述传动齿轮与所述托盘上的齿啮合。
9.根据权利要求5所述的一种耐高温的乳酸菌选育方法，其特征在于：所述选育箱还包括多个滑轨，相邻的两个所述滑轨之间通过引导槽连接，最上侧的一个所述滑轨内滑动设有电源模块，所述电源模块的一侧固定连接有伺服电机，所述伺服电机一端控制有第六转动轴，所述第六转动轴上固定设有转动轮，所述电源模块远离所述伺服电机的一侧固定连接有驱动电机，所述驱动电机一端控制有第一转动轴，所述第一转动轴上固定设有驱动摩擦轮，所述驱动摩擦轮与其中一个所述传动摩擦轮摩擦传动。
10.根据权利要求9所述的一种耐高温的乳酸菌选育方法，其特征在于：所述引导槽交错分布在所述滑轨的两侧，最上侧的一个所述引导槽位于所述滑轨靠近所述电源模块的一侧。
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