CN114561451B - 一种精准修饰的纳米孔道膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜,所述纳米孔道膜内表面修饰有疏水涂层,所述纳米孔道膜外表面修饰有亲水涂层和复合DNA探针;本发明还提供一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜的制备方法,包括以下步骤:步骤S1、采用化学气相沉积法将疏水涂层沉积于纳米孔道膜内表面和外表面;步骤S2、将所述步骤S1的纳米孔道膜使用物理气相沉积法将亲水涂层沉积在纳米孔道膜的外表面;步骤S3、将所述步骤S3获得的纳米孔道膜接枝复合DNA探针;本发明还提供一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜检测微囊藻毒素的方法。本发明具有提高检测微囊藻毒素灵敏度的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域。更具体地说,本发明涉及一种精准修饰的纳米孔道膜及其制备方法和应用。
背景技术
基于纳米孔的传感器已经成为一种用于分析生命关键组成部分的重要工具,包括核酸、蛋白质、多糖和在生命和医疗保健中发挥重要作用的大量生物分子。仿生纳米孔道在单分子水平检测生物分析物领域上具有重要研究意义,通过在固态纳米孔表面修饰DNA 适配体与特定靶标结合,从而达到纳米孔道对特定靶标具有高度特异性和亲和力的目的。
微囊藻毒素是由两个蛋白质氨基酸和五个非蛋白质氨基酸组成的七元肽环,具有显著肝毒性、遗传毒性、神经毒性和致癌性,对环境水资源具有重大威胁。为更好监测水体环境中的微囊藻毒素,急需开发出提高微囊藻毒素检测灵敏度的方法。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜,一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜的制备方法以及一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜检测微囊藻毒素的方法。本方法构筑了一种内表面疏水、外表面亲水的区域化精准可控修饰的纳米孔道,通过对DNA序列的设计,使其通过碱基互补配对作用构建了一种新型的三维交联结构的复合探针,使得该复合探针在纳米孔道外表面自主的进行自组装和解组装过程。由于靶标与复合DNA探针中特异性结构结合,引起复合DNA探针解组装,从而导致纳米孔道跨膜电流变化。通过本发明的纳米孔道膜,可以实现对液体中微囊藻毒素的特异性检测,并提高检测微囊藻毒素灵敏度。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,提供了一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜,所述纳米孔道膜内表面修饰有疏水涂层,所述纳米孔道膜外表面修饰有亲水涂层和复合DNA探针。
优选的是,复合DNA探针包括碱基序列如SEQ ID NO.1所示、碱基序列如SEQ IDNO.2所示、碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的是,所述纳米孔道膜的材料为表面具有羟基的阳极氧化铝,所述纳米孔道膜具有50mm的直径,且包括平均孔径为20-40nm的若干纳米孔道,平均密度为10-11-10-12个/cm2。
优选的是,所述疏水涂层为氟硅烷,所述亲水涂层为Au层。
本发明还提供一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜的制备方法,包括以下步骤:
步骤S1、采用化学气相沉积法将疏水涂层沉积于纳米孔道膜内表面和外表面,所述疏水涂层为氟硅烷;
步骤S2、将所述步骤S1的纳米孔道膜使用物理气相沉积法将亲水涂层沉积在纳米孔道膜的外表面,所述亲水涂层为Au;
步骤S3、将所述步骤S3获得的纳米孔道膜接枝复合DNA探针,通过Au-S键将复合探针修饰在纳米孔道外表面上,得基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜;
步骤S4、将所述步骤S3获得的纳米孔道膜表面滴加巯基乙醇溶液,使其封闭膜上未接枝的复合DNA探针的功能位点。
优选的是,所述步骤S2中纳米孔道膜外表面修饰亲水涂层的具体方法为:预先在纳米孔道膜外表面沉积铬层,沉积时间90-110s,再在铬层表面沉积Au层,沉积时间 1800-2000s,沉积速率为0.08-0.1nm·s-1,使得所述纳米孔道膜外表面沉积Au形成亲水涂层。
优选的是,所述步骤S3中纳米孔道膜接枝复合DNA探针的具体方法为:将复合DNA探针溶液滴加在的纳米孔道膜外表面上,反应1-4h,复合DNA探针溶液与纳米孔道膜外表面的比例为30-40μL:0.2-0.3cm2。
优选的是,所述步骤S4中纳米孔道膜封闭未接枝在膜上的复合结构探针的具体方法为:将巯基乙醇溶液滴加在纳米孔道膜外表面上,反应0.5-1h,2mM巯基乙醇溶液与纳米孔道膜外表面的比例为30-40μL:0.2-0.3cm2。
本发明还提供一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜检测微囊藻毒素的方法,将微囊藻毒素溶液滴加在纳米孔道膜外表面上,反应1-4h,复合DNA探针的核酸序列和微囊藻毒素组成具有信号放大机制的新型三维交联结构,从而完成微囊藻毒素的检测。
优选的是,微囊藻毒素溶液与纳米孔道膜外表面的比例为30-40μL:0.2-0.3cm2,微囊藻毒素溶液的浓度为0.01~100ppb。
本发明至少包括以下有益效果:
使用了气相沉积的方法,使得氟硅烷均匀修饰在纳米孔道膜表面,实现了纳米孔道膜内、外表面具有疏水性;
使用了气相沉积的方法,使得Au层覆盖住外表面的疏水涂层,实现外表面改性,形成亲水涂层,最终实现了纳米孔道膜内表面具有疏水性、外表面具有亲水性;
通过修饰具有信号放大机制的新型三维交联结构的复合探针,实现纳米孔道膜功能化的可控性及纳米孔道膜的特异性,提高检测微囊藻毒素灵敏度。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例的内表面疏水、外表面亲水的纳米孔道膜表面的示意图;
图2为本发明实施例的内表面疏水、外表面亲水的纳米孔道膜横截面的示意图;
图3为本发明实施例中内表面疏水、外表面修饰复合探针的纳米孔道膜检测微囊藻毒素的检测限图;
图4为本发明实施例中内表面疏水、外表面修饰复合探针纳米孔道膜对其他毒素的特异性检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是,下述实施方案中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
本发明提供了一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜,设计一种由核酸序列 (DNA)和微囊藻毒素组成的具有信号放大机制的新型三维交联结构的复合探针,通过构筑内表面疏水、外表面亲水的区域化精准可控修饰的纳米孔道来提高检测微囊藻毒素的灵敏度,将复合探针修饰在具有亲水涂层的纳米孔道膜外表面,使得该复合探针在纳米孔道外表面能够自主的进行自组装和解组装过程。由于纳米孔道膜外表面的复合探针与微囊藻毒素特异性结合引起有效孔径、表面电荷和内壁润湿性的变化,从而导致添加微囊藻毒素前后的电化学信号的变化。通过本发明,可以实现对液体中微囊藻毒素的特异性检测,并提高检测微囊藻毒素灵敏度。
所述纳米孔道膜的材料为表面具有羟基的阳极氧化铝,所述纳米孔道膜具有50mm的直径,且包括平均孔径为20-40nm的若干纳米孔道,平均密度为10-11-10-12个/cm2。
所述疏水涂层为氟硅烷,所述亲水涂层为Au层。
该基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜的制备方法,包括以下步骤:
步骤S1、采用化学气相沉积法将疏水涂层沉积于纳米孔道膜内表面和外表面,使得所述纳米孔道膜内、外表面疏水功能化,所述疏水涂层为氟硅烷;
步骤S2、将所述步骤S1的纳米孔道膜使用物理气相沉积法将亲水涂层沉积在纳米孔道膜的外表面,覆盖住所述步骤S1外表面的疏水涂层,所述亲水涂层为Au,使得外表面功能化改性;功能化改性的目的是让纳米孔道膜表面沉积Au层使其具有亲水涂层,使其与带有巯基基团的复合探针通过末端巯基反应形成Au-S键;
具体方法为:预先在纳米孔道膜外表面沉积铬层,沉积时间90-110s,再在铬层表面沉积Au层,沉积时间1800-2000s,沉积速率为0.08-0.1nm·s-1,使得所述纳米孔道膜外表面沉积Au形成亲水涂层。
步骤S3、将所述步骤S3获得的纳米孔道膜接枝复合DNA探针,通过Au-S键将复合探针修饰在纳米孔道外表面上,得基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜;
具体方法为:将复合DNA探针溶液滴加在的纳米孔道膜外表面上,反应1-4h,复合DNA探针溶液与纳米孔道膜外表面的比例为30-40μL:0.2-0.3cm2。
步骤S4、将所述步骤S3获得的纳米孔道膜表面滴加巯基乙醇溶液,使其封闭膜上未接枝的复合DNA探针的功能位点;
具体方法为:将巯基乙醇溶液滴加在纳米孔道膜外表面上,反应0.5-1h,2mM巯基乙醇溶液与纳米孔道膜外表面的比例为30-40μL:0.2-0.3cm2。
本发明提供一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜检测微囊藻毒素的方法,将微囊藻毒素溶液滴加在纳米孔道膜外表面上,反应1-4h,复合DNA探针的核酸序列和微囊藻毒素组成的具有信号放大机制的新型三维交联结构,从而完成微囊藻毒素的检测;
微囊藻毒素溶液与纳米孔道膜外表面的比例为30-40μL:0.2-0.3cm2,微囊藻毒素溶液的浓度为0.01~100ppb。
<实施例>
本实施例提供一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜检测微囊藻毒素的方法,包括以下步骤:
(1)取圆形的阳极氧化铝膜片(AAO),其直径为50mm,膜片上的孔道直径为20-40nm。
(2)纳米孔道膜内、外表面疏水修饰
将纳米孔道膜悬挂于真空干燥器中,滴入适量氟硅烷于真空干燥器中,使真空干燥器处于真空状态,放于80-100℃条件下加热,加热时间为8-12h。
(3)纳米孔道外表面亲水修饰
将氟硅烷化的阳极氧化铝膜片(AAO)预先在纳米孔道外表面沉积铬层,沉积时间90-110s,再在铬层表面沉积Au,沉积时间1800-2000s;沉积速率为0.08-0.1nm·s-1;最终使阳极氧化铝膜片内表面具有疏水涂层、外表面具有亲水涂层;保持表面干燥,表征,获得的纳米孔道膜片的表面结构示意图如图1和图2所示。
(4)使用化学修饰方法修饰微囊藻毒素适配体复合探针
将30-40μL的复合DNA探针滴加在步骤(3)中所获得的纳米孔道膜表面,反应时间1-4h,为保证复合DNA探针不大量挥发,可在膜的附近滴加清水维持一定湿度,复合 DNA探针包括碱基序列如SEQ ID NO.1所示、碱基序列如SEQ ID NO.2所示、碱基序列如SEQ IDNO.3所示。
SEQ ID NO.1:
5’-HS-C6-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3’(Capture)
SEQ ID NO.2:
5`-TAATTGTCATGGTGGTCCTGTTTGGCGCCGGGCGGAGATGGGGCATAATGAGG TGGTATG-3`(P1)
SEQ ID NO.3:
5’-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCA TCTCCGC-3’(P2)
为防止有其余未接枝的复合探针干扰后续实验,采用在膜上滴加巯基乙醇溶液的方式来封闭纳米孔膜金层上未接枝复合探针的结合位点;具体方法将30-40μL的0.2mM巯基乙醇溶液滴加在0.2-0.3cm2的纳米孔道膜表面上,反应时间0.5-1h;
(5)使用内表面具有疏水涂层、外表面具有亲水涂层且复合探针修饰的的纳米孔道膜检测液体中的微囊藻毒素
将约30-40μL的微囊藻毒素溶液滴加在内表面疏水、外表面亲水且修饰复合探针的纳米孔道膜表面上,反应时间1-4h,微囊藻毒素溶液的浓度为0.01~100ppb;由于该结构的存在会使得纳米孔道膜中有效孔径、表面电荷和内壁润湿性的变化,从而导致添加微囊藻毒素前后的电化学信号的变化。
<对比例>
以所述的相同步骤重复实施例,区别在于内表面疏水、亲水外表面修饰ssDNA探针的纳米孔道膜检测液体中的微囊藻毒素。
测试内表面疏水、亲水外表面修饰复合探针的纳米孔道膜表面的跨膜电流,得到微囊藻毒素溶液的检测限如图3所示,其中横坐标表示微囊藻毒素溶液浓度,纵坐标表示检测限,可以直观的看到,修饰复合探针的纳米孔道膜具有更强的电流信号;
该实施例证明,通过本发明的方法在固体纳米孔道内表面修饰疏水涂层、亲水外表面修饰复合DNA探针,可以促使纳米孔道膜在检测液体中微囊藻毒素时实现信号放大,在提高检测微囊藻毒素的灵敏度的同时,又降低了检测微囊藻毒素的检测限。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
<110> 中国地质大学(武汉)
<120> 一种精准修饰的纳米孔道膜及其制备方法和应用
<160> 3
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
GGCGCCAAAC AGGACCACCA TGACAATTAC CCATACCACC TCATTATGCC CCATCTCCGC
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
TAATTGTCAT GGTGGTCCTG TTTGGCGCCG GGCGGAGATG GGGCATAATG AGGTGGTATG
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
GGCGCCAAAC AGGACCACCA TGACAATTAC CCATACCACC TCATTATGCC CCATCTCCGC
Claims (8)
1.一种基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜,其特征在于,所述纳米孔道膜内表面修饰有疏水涂层,所述纳米孔道膜外表面修饰有亲水涂层和复合DNA探针;
所述复合DNA探针包括碱基序列如SEQ ID NO.1所示、碱基序列如SEQ ID NO.2所示、碱基序列如SEQ ID NO.3所示;
所述纳米孔道膜的材料为表面具有羟基的阳极氧化铝;
所述疏水涂层为氟硅烷,所述亲水涂层为Au层;
所述纳米孔道膜的制备方法,包括以下步骤:
步骤S1、采用化学气相沉积法将所述疏水涂层沉积于纳米孔道膜内表面和外表面;
步骤S2、将所述步骤S1的纳米孔道膜使用物理气相沉积法将所述亲水涂层沉积在纳米孔道膜的外表面;
步骤S3、将所述步骤S3获得的纳米孔道膜接枝所述复合DNA探针,通过Au-S键将所述复合探针修饰在纳米孔道外表面上,得基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜;
步骤S4、将所述步骤S3获得的纳米孔道膜表面滴加巯基乙醇溶液,使其封闭膜上未接枝的复合DNA探针的功能位点。
2.如权利要求1所述的基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜,其特征在于,所述纳米孔道膜具有50 mm的直径,且包括平均孔径为20-40 nm的若干纳米孔道,平均密度为1011 -1012个/cm2。
3.如权利要求1或2所述的基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤S1、采用化学气相沉积法将疏水涂层沉积于纳米孔道膜内表面和外表面,所述疏水涂层为氟硅烷;
步骤S2、将所述步骤S1的纳米孔道膜使用物理气相沉积法将亲水涂层沉积在纳米孔道膜的外表面,所述亲水涂层为Au;
步骤S3、将所述步骤S3获得的纳米孔道膜接枝复合DNA探针,通过Au-S键将复合探针修饰在纳米孔道外表面上,得基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜;
步骤S4、将所述步骤S3获得的纳米孔道膜表面滴加巯基乙醇溶液,使其封闭膜上未接枝的复合DNA探针的功能位点。
4.如权利要求3所述的基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中纳米孔道膜外表面修饰亲水涂层的具体方法为:预先在纳米孔道膜外表面沉积铬层,沉积时间90-110 s,再在铬层表面沉积Au层,沉积时间1800-2000 s,沉积速率为0.08-0.1 nm·s-1,使得所述纳米孔道膜外表面沉积Au形成亲水涂层。
5.如权利要求3所述的基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜的制备方法,其特征在于,所述步骤S3中纳米孔道膜接枝复合DNA探针的具体方法为:将复合DNA探针溶液滴加在的纳米孔道膜外表面上,反应1-4 h,复合DNA探针溶液与纳米孔道膜外表面的比例为30-40 µL:0.2-0.3 cm2。
6.如权利要求3所述的基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜的制备方法,其特征在于,所述步骤S4中纳米孔道膜封闭未接枝在膜上的复合结构探针的具体方法为:将巯基乙醇溶液滴加在纳米孔道膜外表面上,反应0.5-1 h,2 mM的巯基乙醇溶液与纳米孔道膜外表面的比例为30-40 µL:0.2-0.3 cm2。
7.如权利要求1或2所述的基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜检测微囊藻毒素的方法,其特征在于,将微囊藻毒素溶液滴加在纳米孔道膜外表面上,反应1-4 h,复合DNA探针的核酸序列和微囊藻毒素组成具有信号放大机制的新型三维交联结构,从而完成微囊藻毒素的检测。
8.如权利要求7所述的基于浸润性区域化精准修饰的纳米孔道膜检测微囊藻毒素的方法,其特征在于,微囊藻毒素溶液与纳米孔道膜外表面的比例为30-40 µL:0.2-0.3 cm2,微囊藻毒素溶液的浓度为0.01~100ppb。
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