CN114533754B - 一种广谱抗病毒纳米人工抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有广谱抗病毒效果的纳米人工抗体及其制备方法,基于该方法制备获得的广谱制剂,该制剂具有n个结合甘露糖的位点(n≥60),该制剂能够与病毒包膜蛋白上的高甘露聚糖多价结合,该制剂的尺寸为纳米级(30~100nm),且为刚性结构,其与病毒包膜蛋白上的高甘露聚糖结合后通过位阻效应阻断病毒和宿主细胞受体结合,同时诱导病毒聚集,促进免疫细胞对病毒的清除,从而实现对含有高甘露聚糖病毒的广谱抑制感染的效果,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于制药领域,尤其是涉及一种广谱抗病毒纳米人工抗体及其制备方法和应用。
背景技术
由病毒感染引起的传染病对人类生命和健康构成重大威胁。许多包膜病毒,包括艾滋病毒、流感病毒、拉沙病毒、严重急性呼吸综合征病毒、寨卡病毒、登革病毒和伊波拉病毒等,在宿主细胞复制过程中利用宿主细胞的聚糖片段来修饰它们的蛋白质,导致病毒包膜上的蛋白广泛糖基化。宿主细胞来源的聚糖在病毒生命周期中发挥功能作用。尤其的,广泛糖基化的病毒蛋白通过在免疫原蛋白表面覆盖一层密集的宿主来源的聚糖,从而有助于逃离受感染宿主的免疫监视。由于许多病毒糖蛋白不遵循经典的分泌途径,一些蛋白质直接从内质网运输到质膜,绕过了高尔基体中聚糖的成熟,从而产生以高甘露聚糖修饰为主的蛋白。此外,这些含有高甘露聚糖的病毒糖蛋白可作为宿主细胞附着因子,增强或促进免疫细胞感染。
疫苗是对抗新冠病毒的有效手段之一,然而新冠病毒的不断演化和变异,已经有多个变异株在全球流行。特别是2020年12月在印度发现的德尔塔变异株,已成为许多国家新冠病毒流行的主要毒株,最新发现的新冠拉姆达突变株、奥密克戎突变株都增加了新冠疫苗的人群被“突破感染”的威胁。中和抗体也是对抗新冠病毒的重要手段。然而,由于人体获得性免疫所产生的中和抗体的速度远落后于病毒变异的速度,病毒的变异会导致“抗原漂移”,大大减弱疫苗和抗体的抵抗作用。此外,抗体本身具有一些内在的缺陷,包括稳定性低,潜在的ADE效应、免疫原性以及价格昂贵等。小分子抑制剂在抗击新冠疫情中发挥着重要的作用,但是目前并没有预防性的药物问世,而且小分子抑制剂开发周期长,研发成本高,成药风险大,譬如默沙东的莫努匹韦即使通过快速研发通道,也耗时近两年才首次获批上市,这对于突发性传染病疫情的快速反应以及及时控制是很不利的。因此,发展对各种病毒,尤其是新冠病毒变异株具有广谱性的抑制剂是非常必要和紧迫的。
研究表明,SARS-CoV-2包膜上的蛋白也存在广泛的糖基化修饰,影响宿主的识别、渗透、结合、循环和发病机制。SARS-CoV-2的刺突蛋白上N234和N709上的聚糖主要为高甘露聚糖糖型,N61、N122、N603、N717、N801和N1074这6个位点上的聚糖为高甘露聚糖糖型和复杂型聚糖混合修饰。SARS-CoV-2的刺突蛋白上鉴定到的N糖中,28%为高甘露聚糖糖型。因此,以病毒蛋白上保守的高甘露糖为靶点可能成为应对不断突变的病毒的突破口。然而,由于糖的免疫原性弱,以及难制备的原因,能够特异性识别聚糖的试剂很少。目前报道的能够特异性结合高甘露糖特异性亲和试剂仅限于少数抗体和凝集素。而抗体和凝集素均存在价格昂贵,稳定性差的问题,且对于病毒的抑制效果未知。此外,现有的能够和高甘露聚糖识别的试剂多为单价或是二价结合,能够多价结合高甘露聚糖的试剂尚未见报道。
发明内容
针对现有的抑制病毒的手段存在的问题,本发明以病毒在演化和变异中病毒颗粒表面的聚糖存在结构保守的高甘露聚糖的特征,合理设计并可控合成出能多价结合病毒颗粒表面高甘露聚糖的强结合、单分散的人工抗体。该人工合成抗体有多个甘露糖识别位点,尺寸为纳米级(30-100nm),且为刚性结构,其能够与病毒颗粒表面的蛋白上修饰的高甘露糖结合,通过位阻效应阻断病毒和宿主细胞受体结合;通过多价结合病毒诱导病毒聚集,促进免疫细胞对病毒的清除,从而实现对含有高甘露聚糖病毒的广谱抑制感染的效果。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
本发明第一个方面提供一种与病毒包膜蛋白上的高甘露聚糖多价结合的纳米人工抗体的制备方法,所述方法包括如下步骤:
步骤1功能单体的制备:称取3-甲基-2,4-二氟苯硼酸,分子筛,氰基硼氢化钠,加入无水甲醇搅拌溶解,移取3-氨丙基三乙氧基硅烷加入上述溶液,室温下反应,反应结束后过滤,旋干溶剂甲醇,用石油醚和乙酸乙酯洗涤,真空干燥,得到功能单体;
步骤2中间产物的制备:
①称取疏水性基团修饰的甘露糖作为模板分子,曲拉通-100,移取环己烷,正己醇,磁力搅拌均匀后,加入水和氨水,持续搅拌,待模板分子完全分散后,缓慢滴加原硅酸四乙酯和步骤1制备获得的所述功能单体,室温下反应;
②配制原硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合物,向①的反应体系内加入上述混合物,室温下继续反应;
③向②中加入丙酮,搅拌至充分破乳,离心分离产物,分别用乙醇和水重悬洗涤三次,加入醋酸溶液,在摇床上悬摇洗脱模板分子,离心,干燥过夜,得到中间产物;
步骤3:将步骤2制备获得的中间产物分散于溶于水中,超声分散均匀,加入PBS缓冲液,加入聚乙二醇,涡旋分散均匀,在摇床上悬摇反应,反应结束后,离心分离产物,并分别用乙醇和水洗涤各一次,离心,干燥过夜,得到纳米人工抗体;
进一步的,所述步骤1中使用原料3-甲基-2,4-二氟苯硼酸,氰基硼氢化钠,3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为:(1~2):(1~2):5,优选1:1:5。
进一步的,所述步骤2中①使用疏水性基团修饰的甘露糖模板分子,其修饰基团可以选自如下疏水性基团:包含2-15个C链的烷烃,或芳香烃;
进一步的,所述步骤2中①使用的模板分子,曲拉通-100的质量比例为(1~1000):1770,优选100:1770;
进一步的,所述步骤2中②使用原硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的配制比例为10:(1~8),优选5:3;
本发明提供的第二方面为提供一种根据本发明的制备方法制备获得的纳米人工抗体
进一步的,所述纳米抗体具有n个识别甘露糖的位点,n>60。
本发明提供的第三个方面为,一种制剂,所述制剂包含第二方面的纳米人工抗体和药剂学上可接受的辅料。
本发明第四个方面为,根据第一方面的方法制备获得的纳米人工抗体或者根据第三方面的制剂用于制备抑制病毒药物中的用途,所述制剂能够多价结和病毒包膜蛋白上的高甘露聚糖。
进一步的,所述病毒为包膜蛋白含有高甘露聚糖的病毒。
进一步的,所述病毒为冠状病毒,优选的所述冠状病毒包括严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV),中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV),猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),人冠状病毒NL63,新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
进一步的,所述病毒包括猪流行性腹泻病毒(PEDV),拉沙热病毒(LASV)和艾滋病毒(HIV)、寨卡病毒、人***瘤病毒(HPV)。
本发明第五方面提供一种药物组合物,所述药物组合物含有根据第一方面的方法制备获得的纳米人工抗体和抗病毒制剂,所述抗病毒制剂具有抑制或中和病毒的活性。
进一步的,所述抗病毒制剂为抗体鸡尾酒,所述抗体鸡尾酒包含至少两种病毒抗体的混合物,所述病毒抗体选自与严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV),中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV),猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),人冠状病毒NL63,新型冠状病毒(SARS-CoV-2),猪流行性腹泻病毒(PEDV),拉沙热病毒(LASV)和艾滋病毒(HIV),人***瘤病毒(HPV)所组成组中的一种或者几种结合的抗体。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
1)不依赖蛋白质抗原,直接结合病毒表面的高甘露聚糖糖盾,从而能阻断病毒利用糖盾的免疫逃逸和避免因抗原漂移的病毒阻断失效。
2)克服了现有技术中由于糖的免疫原性差,结合糖的抗体很难制备,即使能制备,亲和力常常也不够强的缺陷,本发明的纳米人工抗体能够多价结合甘露糖,结合含有高甘露聚糖的新冠S1蛋白的结合常数(Kd)达到10-7M。
3)新冠刺突蛋白受体结合位点(RBD)上存在两个高甘露聚糖表达占优的糖基化位点,本发明所制备的纳米人工抗体与这些位点的结合后,利用位阻效应和自身的刚性结构,能阻挡新冠刺突蛋白RBD与血管紧张素转化酶2(ACE2)的结合,抑制病毒对宿主细胞的浸染,且此种结合具有广谱性,不限于某个新冠病毒变种。
4)本发明所制备的纳米抗体与病毒的结合方式为多价态结合。基于现有研究,冠病毒颗粒上有十几到几十个S蛋白,而常规的IgG抗体为2价,因此以IgG对付病毒,在结合价态上始终处于劣势。由于本发明的纳米抗体存在n个结合位点(n>60),一个纳米抗体粒子能够结合多个病毒颗粒。
5)本发明所制备的纳米抗体能够通过多价结合病毒颗粒的方式诱导病毒颗粒的聚集,进而促进巨噬细胞对病毒颗粒的吞噬。
6)生物兼容性好,没有Fc片段,不存在抗体依赖增强效应(ADE)。
总体来说,本发明中的纳米人工抗体具备有效抵御含有高甘露糖的病毒,对已知的含有高甘露糖的病毒具有广谱的结合和抑制效果,尤其是,本发明对新型冠状病毒尤其是新冠病毒的多种变异株的具有广谱抑制效果。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1:本发明实施例1中纳米纳米人工抗体的透射电镜图;
图2:本发明实施例1中纳米人工抗体的红外谱图;
图3:本发明实施例1中纳米人工抗体元素分布图以及元素分布峰;
图4:本发明实施例2中1mg(a)、100mg(b)和1000mg(c)的苄基甘露糖为模板制备的纳米人工抗体结合甘露糖的饱和吸附量;100mg(d)的乙基甘露糖为模板制备的纳米人工抗体结合甘露糖的饱和吸附量
图5:本发明实施例3中纳米人工抗体对甘露糖的选择性;
图6:本发明实施例4中纳米人工抗体和S蛋白的结合亲和力;
图7:本发明实施例5中纳米人工抗体阻断新冠病毒和ACE2的结合;
图8:本发明实施例6中纳米人工抗体的细胞毒性;
图9:本发明实施例7中纳米人工抗体中和新冠野生株假病毒的抑制率;
图10:本发明实施例8中纳米人工抗体中和新冠变异株假病毒的抑制率;
图11:本发明实施例9中纳米人工抗体诱导病毒颗粒聚集;
图12:本发明实施例10中巨噬细胞胞吞纳米人工抗体识别的假病毒的共聚焦荧光图;
图13:本发明实施例11中纳米人工抗体中和拉沙热假病毒和HIV假病毒抑制率;
图14:本发明实施例11中不同包膜病毒中高甘露糖的分布。从左至右依次为HK68HA、SARS-CoV刺突蛋白、SARS-CoV-2刺突蛋白、MERS-CoV刺突蛋白、Vic11HA、LASVGPC、HIV-1Env。绿色的深浅代表高甘露糖的含量;
图15:本发明实施例11中人冠状病毒HCoV-NL63的S蛋白上由冷冻电镜鉴定的糖的位置(a,b图,蓝色球状代表糖)和质谱鉴定到的每个位点最广泛的糖结构(c);
图16:HPV16病毒L1蛋白和不同凝集素反应性。
具体实施方式
本发明术语:
纳米人工抗体,通过化学合成的方式制备的能够特异性和靶标分子结合,且尺寸在纳米尺度的试剂。
多价态结合,制备的纳米纳米人工抗体一个颗粒能够同时结合10个以上的甘露糖分子,优选的可以结合50个以上,60个以上,100个以上,200个以上,2000个以上的甘露糖分子。
分子筛,一种包含有精确和单一的微小孔洞的材料,可用于吸附气体或液体。足够小的分子可以通过孔道被吸附,而更大的分子则不能,在结构上有许多孔径均匀的孔道和排列整齐的孔穴,不同孔径的分子筛把不同大小和形状分子分开。因此,分子筛常用来作干燥剂,一个分子筛能吸附高达其自身重量22%的水分。
除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下面结合实施例来详细说明本发明。
具体实施方法:
实施例1纳米人工抗体的制备
1)本发明纳米人工抗体的制备方法包括步骤如下:
步骤1:功能单体制备,称取1.86g3-甲基-2,4-二氟苯硼酸,4g4A分子筛(货号:M24119-100G;品牌:MERYER),1.26g氰基硼氢化钠,加入80mL无水甲醇搅拌溶解,移取5mL3-氨丙基三乙氧基硅烷,室温下反应24h。反应结束后过滤,旋干溶剂甲醇,用石油醚和乙酸乙酯洗涤,真空干燥,得到功能单体。
步骤2:称取100mg苄基修饰的甘露糖作为模板,1.77g曲拉通-100,移取7.5mL环己烷,1.6mL正己醇,磁力搅拌10min,加入480μL水,100μL浓氨水,持续搅拌12h,待模板分子完全分散,缓慢滴加92μL原硅酸四乙酯,8μL步骤1制备获得的功能单体,室温下反应24h。按照体积比为5:3配制原硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合物,向反应体系内加入20μL上述混合物,室温下继续反应12h。加入6mL丙酮破乳,搅拌15min,以4000rpm离心30min,分别用乙醇和水重悬沉淀洗涤三次,加入0.1M的醋酸溶液,在摇床上以300rpm悬摇12h,充分洗脱模板分子,离心,干燥过夜,得到中间产物。
步骤3,取1.5mL离心管,将上述中间产物分散于溶于1mL水中,超声分散均匀,加入170μLPBS缓冲液,称取10mgPEG-750,涡旋分散均匀,在摇床上1000rpm悬摇24h,反应结束后,离心除去未反应的PEG-750,并分别用乙醇和水洗涤各一次,离心,干燥过夜,得到纳米人工抗体。
2)对步骤2中的模板用量进行调整:
调整苄基甘露糖模板的用量为1mg,其余制备方法同上。
调整苄基甘露糖模板的用量为1000mg,其余制备方法相同上。
3)对步骤2中模板的甘露糖修饰类型进行调整:
采用乙基甘露糖为模板,用量为100mg,其余制备方法同上。
4)实验结果:
透射电镜考察制备的纳米人工抗体的形态结果展示在图1,所制备的纳米人工抗体为球形,尺寸分布均一,平均粒径为纳米级别,具体为30nm。
考察制备的纳米人工抗体红外光谱,结果展示在图2,3400cm-1处的谱峰归属于Si-OH的吸收峰,2980cm-1处的谱峰归属于C-H伸缩振动峰,385cm-1和1100cm-1处的谱峰归属于C-H弯曲振动峰;
通过能谱分析,考察制备的纳米人工抗体的元素分布,结果展示在图3,所制备的纳米人工抗体是由硅、氧、碳、硼元素组成。
实施例2纳米人工抗体对甘露糖的结合位点测定
1)实验步骤:用磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.4)制备了一系列苄基修饰的甘露糖标准溶液。将2mg的实施例1制备的纳米人工抗体分散到200μL的标准溶液中。在室温下,将分散液在旋转器上振荡2小时后,通过离心收集纳米人工抗体,用200μL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.4)冲洗3次。用20μL 100mM醋酸溶液中洗脱,离心收集上清液。通过测定上清液在230nm处的紫外吸光度来测定吸附的苄基甘露糖的含量。通过绘制上清液230nm处紫外吸光度与苄基甘露糖对数浓度的关系,确定吸附等温线。为了估算纳米人工抗体对甘露糖的结合亲和力,根据Scatchard方程绘制苄基甘露糖与纳米人工抗体结合的数量,方程如下所示:
其中Qe,[s],Qmax和Kd分别为纳米人工抗体与苄基甘露糖结合的平衡紫外吸收量、吸附平衡自由浓度、饱和吸附量的平衡紫外吸收和解离常数。通过绘制Qe/[s]与Qe的关系图,可以分别从斜率和截距计算出Qmax和K d。
2)实验结论:所制备的纳米人工抗体,其对甘露糖的结合吸附等温线:
采用苄基甘露糖为模板如图4a-4c所示:模板量为1mg时,所制备的纳米人工抗体和苄基甘露糖的亲和力为3.7×10-4M,每个粒子结合约60个甘露糖分子;模板量为100mg时,所制备的纳米人工抗体和苄基甘露糖的亲和力为32.54×10-4M,每个粒子结合约2576个甘露糖分子;模板量为1000mg时,所制备的纳米人工抗体和苄基甘露糖的亲和力为3.7×10-4M,每个粒子结合约199个甘露糖分子。
采用乙基甘露糖为模板如图4d所示:模板量为100mg时,所制备的纳米人工抗体和己基甘露糖的亲和力为2.2×10-4M,每个粒子结合约2389个甘露糖分子
实施例3纳米人工抗体特异性结合甘露糖实验
采用实施例1方法制备的获得的纳米人工抗体,选择对甘露糖的结合个数大于2000的纳米人工抗体为材料组(命名为MIP)
设置无模板分子加入制备获得的材料组(命名为NIP)
1)实验步骤,分别称取5mg的纳米人工抗体材料(命名为MIP)和无模板分子加入制备获得的材料(命名为NIP),将材料分散到甘露糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖和甲苯的溶液中,为了方便紫外检测,甘露糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖均修饰了带有紫外吸收的苄基,溶液浓度均为0.1mg/mL,室温下震荡2小时后,离心分离材料,用PBS溶液重悬清洗3次后烘干,将材料分散到50μL的0.1M的乙酸溶液中,震荡1小时后,离心,用紫外光谱仪测试上清液中的波长为230nm处的紫外吸光度的值,每组测试3个平行样
2)实验结论:本发明制备的纳米人工抗体与不同糖结合的吸光度值展示在图5,甘露糖吸光度最高,其次是葡萄糖、半乳糖和岩藻糖,通过吸光度值计算可知:对葡萄糖交叉反应率最高为46%,对半乳糖的交叉反应率为26%,对岩藻糖的交叉反应率为20%(图5),可见本发明制备的纳米人工抗体能够特异性的结合甘露糖。
实施例4基于生物膜干涉技术(BLI)测定纳米人工抗体对S蛋白的结合力
1)实验步骤,称取1mg的实施例1方法制备的对甘露糖的结合个数大于2000的纳米人工抗体,分散到1mL的PBS缓冲液中;将制备的纳米人工抗体分散液固定在氨丙基传感器上,将固定有纳米人工抗体的传感器在PBS缓冲液中平衡后,分别和不同浓度的SARS-CoV-2S1蛋白溶液(2000nM,1500nM,1000nM,500nM,250nM)作用,记录S1蛋白结合在纳米人工抗体上引起的光谱相位差,结合平衡后,将传感器置于PBS缓冲液中,记录S1蛋白从纳米人工抗体上解离引起的光谱相位差,所记录的结果展示在图6中,根据相位差拟合纳米人工抗体对S1蛋白的亲和力。
2)实验结论:结果如图6所示,制备的纳米人工抗体对S1蛋白的亲和力为Kd:5.29×10-7M。
实施例5基于生物膜干涉技术(BLI)测定纳米人工抗体阻断ACE2对假病毒的结合
ACE2是SARS-CoV-2进入细胞所需的主要受体,检测本发明的纳米人工抗体对于ACE2与SARS-CoV-2结合的阻断作用,验证本发明人工抗体在阻断新型冠状病毒感染的效果。
1)实验步骤:将SARS-CoV-2(野生型)的假病毒颗粒固定在传感器上,再和不同浓度的实施例1方法制备的对甘露糖的结合个数大于2000的实施例1方法制备的对甘露糖的结合个数大于2000的纳米人工抗体(0、10、25、75、100μg/ml)结合,结合后再与ACE2的蛋白结合;记录结和过程的相位差。
2)实验结论:所记录的结果展示在图7中,随着纳米人工抗体(Man-nanoMIP)浓度的增加,ACE2的结合减少,说明纳米人工抗体与SARS-CoV-2假病毒结合后,可以有效阻断SARS-CoV-2与ACE2的相互作用。
实施例6通过细胞毒性实验评价纳米人工抗体细胞水平的安全性,
1)实验步骤:将非洲绿猴肾细胞种植在96孔板上,每孔种植细胞1×104个,培养细胞24小时后,在细胞中加入不同浓度的实施例1方法制备的对甘露糖的结合个数大于2000的纳米人工抗体材料,每个浓度3个平行样,和细胞共培养24h后,采用MTT比色方法检测细胞活力,以和空白对照组细胞的存活做比例,评价纳米人工抗体的细胞毒性。
2)实验结论:结果如图8所示,在给药剂量高达540μg/mL时候,未见对细胞有明显的毒性。
实施例7通过假病毒中和实验考察纳米人工抗体抑制新冠野生株假病毒浸染宿主细胞的能力
1)实验材料:新冠野生株假病毒为表面含有新冠病毒的野生型的刺突糖蛋白,病毒内包裹绿色荧光蛋白(GFP)及荧光素酶(Luciferase)的RNA序列逆转录病毒
2)实验步骤:将表达有ACE2的HEK293T细胞种植在96孔板中,培养细胞24h;将病毒溶液和不同浓度的实施例1方法制备的对甘露糖的结合个数大于2000的纳米人工抗体共孵育30min后,加入到种植的细胞中,共培养48h后,裂解细胞,检测细胞内的荧光素酶的表达,用于表征细胞受到病毒感染的情况,并和以只加入病毒,不含有纳米人工抗体的细胞组的荧光素酶作比值,得到不同浓度的纳米人工抗体抑制新冠假病毒的抑制效率,拟和抑制半最大效应浓度(EC50)值。
3)实验结论:结果如图9所示,对于新冠野生株假病毒的抑制EC50值为37.5μg/mL
实施例8通过假病毒中和实验考察纳米人工抗体抑制新冠变异株假病毒浸染宿主细胞的能力
1)实验材料:新冠野生株假病毒为表面含有新冠病毒的N501Y变异,D614G变异,N439K变异,Δ69-70变异,和Omicron变异株相同的刺突糖蛋白,病毒内包裹荧光素酶(Luciferase)的RNA序列逆转录病毒。Delta变异株假病毒为表面含有Delta变异株相同的刺突糖蛋白,包裹荧光素酶(Luciferase)的RNA序列VSV病毒,。
2)实验步骤:将表达有ACE2的HEK293T细胞种植在96孔板中,培养细胞24h;将不同变异株病毒溶液和不同浓度的实施例1方法制备的对甘露糖的结合个数大于2000的纳米人工抗体共孵育30min后,加入到种植的细胞中,共培养48h后,裂解细胞,检测细胞内的荧光素酶的表达,用于表征细胞受到病毒感染的情况,并和只加入病毒,不含有纳米人工抗体的细胞组的荧光素酶作比值,得到不同浓度的纳米人工抗体抑制新冠假病毒的抑制效率,拟和抑制半最大效应浓度(EC50)值。
3)实验结论:结果如图10所示,对于N501Y变异株的EC50为49.3μg/mL,对于D614G变异株的EC50为45.7μg/mL,N439K变异株的EC50为41.4μg/mL,Δ69-70变异株的EC50为36.9μg/mL,Delta变异株的EC50为44.2μg/mL,Omicron变异株的EC50为43.7μg/mL。由于该纳米人工抗体的表观分子量约为36,000-50,000kDa,以上EC50值均在10-9M水平。
实施例9通过透射电镜观察纳米人工抗体诱导病毒颗粒聚集
1)实验方案:将SARS-CoV-2假病毒颗粒(野生型)和纳米人工抗体预先孵育1h,然后将病毒颗粒和纳米人工抗体的混合液滴到铜网上,用滤纸吸收流动液体。在铜网中加入3%磷钨酸,孵育1min,然后用滤纸吸附浮液,将样品在室温下风干24小时,用透射显微镜观察。在对照实验中,除样品中没有加入纳米人工抗体外,其他步骤均与上述步骤相同。
2)实验结果:透射电镜图片如图11所示,对照组中,未处理的病毒粒子分散为个体;相比之下,纳米人工抗体处理的病毒粒子大多呈团簇状,在这些团簇之外可以观察到少数单个病毒粒子,纳米人工抗体能够有效的诱导病毒颗粒聚集。可见所制备的纳米人工抗体表面具有2000以上结合甘露糖的位点,因此纳米人工抗体能够多价格结合病毒,此外每个纳米人工抗体能够结合多个病毒颗粒,发挥交联的作用,因此能够诱导病毒颗粒聚集。
实施例10通过共聚焦荧光显微镜观察巨噬细胞吞噬纳米人工抗体识别的假病毒
1)实验步骤:将巨噬细胞Raw264.7种植在共聚焦皿中,培养过夜,将荧光染料标记的纳米人工抗体和假病毒在室温下孵育后30min后,加入到巨噬细胞中,设置为C+MIP+病毒组;以荧光染料标记的纳米人工抗体直接加入巨噬细胞中作为对照组C+MIP;共培养6小时后,用细胞固定液固定细胞,用DAPI染色剂染色细胞核,通过共聚焦荧光显微镜拍摄荧光图片。
2)实验结论:结果如图12所示,纳米人工抗体能够结合假病毒颗粒,并促进巨噬细胞对假病毒的吞噬,有利于巨噬细胞对病毒的清除,激发固有免疫。
实施例11纳米人工抗体的广谱抑制效果的验证
1)实验步骤:
将HEK293T细胞种植在96孔板中,培养细胞24h;将LASV假病毒溶液和不同浓度的实施例1方法制备的对甘露糖的结合个数大于2000的纳米人工抗体共孵育30min后,加入到种植的细胞中,共培养48h后,裂解细胞,检测细胞内的荧光素酶的表达,用于表征细胞受到病毒感染的情况,并和只加入病毒,不含有纳米人工抗体的细胞组的荧光素酶作比值,得到不同浓度的纳米人工抗体抑制LASV假病毒的抑制效率,拟和抑制半最大效应浓度(EC50)值。
将TZM-bl细胞种植在96孔板中,培养细胞24h;将HIV的假病毒溶液和不同浓度的实施例1方法制备的对甘露糖的结合个数大于2000的纳米人工抗体共孵育30min后,加入到种植的细胞中,共培养48h后,裂解细胞,检测细胞内的荧光素酶的表达,用于表征细胞受到病毒感染的情况,并和只加入病毒,不含有纳米人工抗体的细胞组的荧光素酶作比值,得到不同浓度的纳米人工抗体抑制新冠假病毒的抑制效率,拟和抑制半最大效应浓度(EC50)值。
2)实验结论:
图13展示了以LASV和HIV的假病毒为例子,所制备的纳米人工抗体的抑制EC50值分别为27.6μg/mL和18.9μg/mL。
基于之前的实施例可以看出本发明所制备的纳米人工抗体能够通过识别病毒表面的高甘露聚糖,进而发挥病毒抑制的作用,因此本发明的纳米人工抗体可广谱性抑制的病毒范围为现有技术已知的含有高甘露糖型的糖基化修饰的病毒类型,图14展示了不同包膜病毒中高甘露糖的分布:从左至右依次为HK68 HA、SARS-CoV刺突蛋白、SARS-CoV-2刺突蛋白、MERS-CoV刺突蛋白、Vic11 HA、LASV GPC、HIV-1Env,绿色的深浅代表高甘露糖的含量(参考文献:Chang-Chun D.Lee et al.A cross-neutralizing antibody between HIV-1and influenza virus.PLoS Pathogens,2021,doi:10.1371/journal.ppat.1009407.);图15展示了人冠状病毒HCoV-NL63的S蛋白上由冷冻电镜鉴定的糖的位置(a,b图,蓝色球状代表糖)和质谱鉴定到的每个位点最广泛的糖结构(c)(参考文献:Glycan shieldandepitope masking of acoronavirus spike protein observed by cryo-electronmicroscopy.Nature Structural&Molecular Biology 2016,23(10),899-905.);图16中的表格展示了HPV16病毒L1蛋白和不同凝集素反应性,由该表可以看出,其和凝集素ConA有非常强的反应性,说明HPV16病毒表面含有高甘露聚糖。基于上述内容,本发明制备的纳米人工抗体可拓展到的病毒包括但不限于人冠状病毒(HCoV-OC43,HCoV-NL63,HCoV-HKU1,HCoV-229E),严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV),中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV),猪流行性腹泻病毒(PEDV),猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),HPV16,拉沙热病毒(LASV)和艾滋病毒(HIV)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种与病毒包膜蛋白上的高甘露聚糖多价结合的纳米人工抗体的制备方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:
步骤1功能单体的制备:称取3-甲基-2,4-二氟苯硼酸,4A分子筛,氰基硼氢化钠,加入无水甲醇搅拌溶解,移取3-氨丙基三乙氧基硅烷加入上述溶液,室温下反应,反应结束后过滤,旋干溶剂甲醇,用石油醚和乙酸乙酯洗涤,真空干燥,得到功能单体;
步骤2中间产物的制备:
①称苄基修饰的甘露糖作为模板分子,曲拉通-100,移取环己烷,正己醇,磁力搅拌均匀后,加入水和氨水,持续搅拌,待模板分子完全分散后,缓慢滴加原硅酸四乙酯和步骤1制备获得的所述功能单体,室温下反应;
②配制原硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合物,向①的反应体系内加入上述混合物,室温下继续反应;
③向②中加入丙酮,搅拌至充分破乳,离心分离产物,分别用乙醇和水重悬洗涤三次,加入醋酸溶液,在摇床上悬摇洗脱模板分子,离心,干燥过夜,得到中间产物;
步骤3:将步骤2制备获得的中间产物分散于溶于水中,超声分散均匀,加入PBS缓冲液,加入聚乙二醇,涡旋分散均匀,在摇床上悬摇反应,反应结束后,离心分离产物,并分别用乙醇和水洗涤各一次,离心,干燥过夜,得到纳米人工抗体;
步骤1中使用原料3-甲基-2,4-二氟苯硼酸,氰基硼氢化钠,3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为:(1~2):(1~2):5;
步骤2中①使用的模板分子,曲拉通-100的质量比例为(1~1000):1770;
步骤2中②使用原硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的配制比例为10:(1~8)。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤1中使用原料3-甲基-2,4-二氟苯硼酸,氰基硼氢化钠,3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为1:1:5。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤2中①使用的模板分子,曲拉通-100的质量比例为100:1770。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤2中②使用原硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的配制比例为5:3。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法制备获得的纳米人工抗体,所述纳米人工抗体具有n个识别甘露糖的位点,n>60。
6.一种制剂,其特征在于:所述制剂包含根据权利要求5所述的纳米人工抗体和药剂学上可接受的辅料,所述制剂能够多价结合病毒包膜蛋白上的高甘露聚糖。
7.根据权利要求6所述制剂的用途,其特征在于:所述病毒为包膜蛋白含有高甘露聚糖的病毒。
8.根据权利要求6所述制剂的用途,其特征在于:所述病毒包括严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV,中东呼吸综合征病毒MERS-CoV,人冠状病毒NL63,新型冠状病毒SARS-CoV-2。
9.根据权利要求6所述制剂的用途,其特征在于:所述病毒包括拉沙热病毒LASV和艾滋病毒HIV、人***瘤病毒HPV。
10.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物含有根据权利要求6所述的纳米人工抗体和抗病毒制剂,所述抗病毒制剂具有抑制或中和病毒的活性。
11.根据权利要求10所述的药物组合物,其特征在于,所述抗病毒制剂为抗体鸡尾酒,所述抗体鸡尾酒包含至少两种病毒抗体的混合物,所述病毒抗体选自与严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV,中东呼吸综合征病毒MERS-CoV,人冠状病毒NL63,新型冠状病毒SARS-CoV-2,拉沙热病毒LASV和艾滋病毒HIV,人***瘤病毒HPV所组成组中的一种或者几种结合的抗体。
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