CN104338126B - 一种具有治疗或预防hpv病毒的疫苗组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疫苗组合物及其在药物中的用途。尤其涉及由包被HPV L1蛋白的纳微球制成的疫苗组合物或疫苗制剂及其在治疗或预防HPV病毒药物中的应用。具体而言，本发明针对HPV L1抗原蛋白，纳微球粒径大小及其组合、纳微球材料、纳微球对抗原装载方式对其免疫应答的影响，设计制备粒径均一、不同粒径的PLGA、PLA，PLGA/PC纳微球，以其包埋或吸附HPV L1抗原蛋白，制备成疫苗组合物或疫苗制剂，研究其对体内免疫应答强度和水平的影响，开发高效的HPV L1蛋白疫苗组合物。

Description

一种具有治疗或预防HPV病毒的疫苗组合物及其应用

技术领域

本发明涉及疫苗组合物及其在药物中的用途。尤其涉及由包被或吸附HPV L1蛋白的纳微球制成的疫苗组合物或疫苗制剂及其在治疗或预防HPV病毒药物中的应用。

技术背景

人***瘤病毒(Human papillomaviruses，HPV)是无囊膜的双链DNA病毒，主要由病毒外壳和基因组DNA组成(Bernard，Burk et al.2011)。HPV病毒外壳是由360个L1蛋白(形成72个五聚体)和至多72个L2蛋白构成的二十面体结构，直径55-60nm(Howley andLowy2007)。病毒外壳蛋白具有自组装特性，在体外L1蛋白单独或与L2蛋白共同自组装形成类病毒样颗粒(Virus-like Particle，VLP)(Chen，Garcea et al.2000，Finnen，Ericksonet al.2003，Buck，Cheng et al.2008，Wang and Roden 2013)。目前的HPV疫苗都是以VLP作为靶抗原，已有两种基于HPV L1VLP预防性疫苗上市(Jansen and Shaw 2004，Howleyand Lowy 2007，Buonaguro，Tomesello et al.2009，Harper 2009，Frazer，Leggatt etal.2011，Hariri，Dunne et al.2011，Malagon，Drolet et al.2012，Lehtinen andDillner 2013，Shaw 2013)。2006年6月8日，美国食品与药品管理局(FDA)正式批准美国Merck公司(即默沙东公司)生产的Gardasil HPV预防性疫苗上市；它是由酿酒酵母表达并纯化的HPV16/18/6/11L1VLP四价***预防性疫苗，以无定形羟基磷酸铝铝硫酸盐(amorphous aluminum Hydroxyphosphatesulfate，AAHS)为佐剂，被批准用于预防6～26岁女孩和妇女HPV16、18、6、11型感染所引起的***、癌前病变和生殖器疣，这是FDA通过的世界上第一个肿瘤疫苗(Villa，Costa et al.2005，Villa，Ault et al.2006，Bryan 2007，Olsson，Villa et al.2007，Goldstone and Vuocolo 2012)。随后英国葛兰素史克(GSK)公司生产的商品名为Cervarix的HPV预防性疫苗也成功上市，它是由来源于昆虫表达***的HPV16/18L1VLP二价***预防性疫苗，采用AS04佐剂(氢氧化铝复合MPL)(Paavonen，Jenkins et al.2007，Garcon，Morel et al.2011，Kreimer，Gonzalez et al.2011，Szarewski 2012)。临床实验证明，上述两种预防性疫苗均具有良好的耐受性，且无严重不良反应(Paavonen，Jenkins et al.2007，Reisinger，Block et al.2007，Perez，Lazcano-Ponce et al.2008，Verstraeten，Descamps et al.2008，Paavonen，Naud et al.2009，Garcon，Morel et al.2011，Herrero，Wacholder et al.2011，Kreimer，Gonzalez etal.2011，Seemann and Dodet 2011，Goldstone and Vuocolo 2012，Lehtinen，Paavonenet al.2012，Szarewski，Poppe et al.2012)。但这两种预防性疫苗价格昂贵，且需要低温保存，极大限制了在发展中国家和落后地区的使用，因此开发一种低成本的高效价HPV疫苗就显得尤为重要(Jansen and Shaw 2004，Buonaguro，Tornesello et al.2009，Campo andRoden 2010，Frazer，Leggatt et al.2011，Hariri，Dunne et al.2011，Lehtinen andDillner 2013，Shaw 2013)。研究表明，以HPV L1五聚体蛋白免疫实验动物后可以诱导产生保护性的免疫应答(Rose，White et al.1998，Yuan，Estes et al.2001，Ohlschlager，Osenet al.2003，Senger，Schadlich et al.2010，Wu，Gersch et al.2011)，而基于原核生物Ecoli的表达技术可以大大降低HPV疫苗的生产成本。在中国发明专利02129070.9《***瘤病毒衣壳蛋白的原核制备和应用》中提供HPV 16L1五聚体的空间三维结构，及利用大肠杆菌大量表达和制备人***瘤病毒衣壳蛋白L1的技术方法。

铝佐剂是目前应用最为广泛的一类佐剂，有着80多年的应用历史和数百亿人次的使用记录，也是长期以来一度是被美国食品和药品监督管理局(FDA)批准用于人类疫苗的唯一佐剂(Glenny，Pope et al.1926，Gupta and Siber 1995，Gupta 1998，Baylor，Eganet al.2002，Clements and Griffiths 2002，Lindblad 2004，Lindblad 2004)。但其在HPVL1蛋白抗原的应用中存在一些不足。铝盐佐剂仅在注射部位形成贮库效应(Gupta，Changet al.1996，Hem 2002，Verdier，Burnett et al.2005，Hem and Hogenesch 2007，Noe，Green et al.2010)，通过炎症反应吸引树突状细胞(DC)(Morefield，Sokolovska etal.2005，Kool，Soullie et al.2008，Sharp，Ruane et al.2009，Flach，Ng et al.2011，Ghimire，Benson et al.2012)、巨噬细胞(Hamilton，Byrne et al.2000，Jordan，Mills et al.2004，Rimaniol，Gras et al.2004，Rimaniol，Gras et al.2007)等抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)，这些细胞通过吞噬作用摄取抗原并经NLRP3炎性小体激活免疫应答(De Gregorio，Tritto et al.2008，Dostert，Petrilli et al.2008，Eisenbarth，Colegio et al.2008，Franchi and Nunez 2008，Kool，Petrilli etal.2008，Li，Willingham et al.2008，Cassel，Joly et al.2009，Demento，Eisenbarth etal.2009，Duewell，Kono et al.2010，Davis，Wen et al.2011)。同时，铝佐剂通过刺激IL-10分泌等机制对细胞免疫产生抑制作用(Chen，Ni et al.2011)，而对于病毒感染而言，细胞免疫效果将发挥更好的地免疫保护和免疫防治作用(O′Hagan and Valiante2003，Demento，Cui et al.2012，Levitz and Golenbock 2012，Olive 2012，Cain，Sanders etal.2013，HogenEsch 2013)。另外，铝佐剂可引起IgE介导的过敏反应(如注射部位肉芽肿)以及神经***不良反应等，从而引起人们对铝佐剂安全性的担忧(Petrik，Wong etal.2007，Bystrianyk2009，Shaw and Petrik 2009，Munks，McKee et al.2010，Tomljenovic and Shaw 2011)。为此，需要针对HPV L1蛋白抗原，无论是对基于L1五聚体，还是L1VLP的候选疫苗开发新型免疫佐剂(Campo and Roden 2010，Mariani and Venuti2010，Chen，Ni et al.2011，Foged 2011，Gattoc，Nair et al.2013，Koff，Burton etal.2013，Shaw 2013，Tomljenovic，Spinosa et al.2013)。

近年来大量文献证实，体内可生物降解的聚合物纳微球通过包埋抗原，可将其转化为颗粒型抗原，有利于被抗原提呈细胞摄取，进而在胞内释放抗原，通过后续抗原加工、提呈，增强免疫应答强度和水平(Langer，Cleland et al.1997，Johansen，Men etal.2000，Sahay，Alakhova et al.2010，De Temmerman，Rejman et al.2011，Danhier，Ansorena et al.2012)。例如，Torres M.P.等人制备了聚苷类微球，以卵清蛋白(OVA)为模型抗原，研究微球的佐剂效果，结果表明微球能够提高抗原提呈细胞表面MHC分子表达和相关细胞因子分泌，显示其具有一定的佐剂效应(Torres，Wilson-Welder et al.2011)；又如Uto T.等人制备了生物可降解的聚谷氨酸纳微球(γ-PGA NPs)并从机制上研究了其佐剂性能，揭示此微球能通过TLR4(Toll样受体)和MyD88信号通路诱发强有力的固有和获得性免疫应答反应(Uto，Akagi et al.2011)。研究表明，上述携载抗原的微粒型佐剂使可溶性抗原变成颗粒型抗原，而颗粒型抗原被APC摄取后，可以改变抗原的提呈途径，不仅可以激活CD4+T细胞，而且可以激活CD8+T细胞，大大提升细胞免疫功能，实现胞内感染的彻底清除，是有前景的病毒感染疫苗佐剂与递送***(Wang and Singh 2011，Dierendonck，DeKoker et al.2012)。此外，生物可降解聚合物微球可以提供大量抗原并保护其免受在生理条件下的快速降解，通过微球对所包埋抗原的持续或脉冲释放行为，有效模拟传统疫苗多次免疫程序，减少接种次数和免疫原的使用总量，因而改进了病人的适应性、降低了用药成本(Langer，Cleland et al.1997，Johansen，Estevez et al.2000，De Temmerman，Rejmanet al.2011，Demento，Cui et al.2012)。

作为抗原蛋白的佐剂与递送***，聚合物颗粒的很多理化性质会影响其在体内与免疫细胞的相互作用，并最终影响免疫应答类型、强度和水平，包括粒径、形态、表面性质等(Gupta and Siber 1995，Hem and Hogenesch 2007，Mastelic，Ahmed et al.2010，Wangand Singh 2011，Korsholm，Andersen et al.2012)。例如，Xiang S.D.等(Xiang，Scholzenet al.2006)在综述文章里提到，表面带正电荷的颗粒与表面带负电荷和不带电荷的颗粒相比，更易于诱导高水平的抗体和CD8+T细胞应答；Foged C.等人(Foged，Brodin etal.2005)研究了颗粒表面电荷对DC细胞摄取行为的影响，得到了类似结果，即表面带正电荷的颗粒更易于被DC摄取；而Yasuhiko T.等人(Tabata and Ikada 1988)的研究却得到了相反的结论，他们认为带负电荷的纤维素微球能够促进巨噬细胞的摄取。同样，聚合物颗粒粒径对免疫学效应的影响也尚未形成统一定论。Gutierro I.等人(Gutierro，Hernandezet al.2002)发现，与200和500nm粒径相比，1相比，的PLGA微球可产生高水平抗体；MannJ.S.F.等人(Mann，Shakir et al.2009)制备了载流感抗原的天然生物膜微囊(Biosome)，结果表明小粒径有利于诱导高效体液免疫应答，而大粒径则倾向诱导机体产生细胞免疫应答；WendorfJ等人(Wendorf，Chesko et al.2008)采用表面带负电的PLGA微球(110nm和1000nm)吸附HIV-1和诱发脑膜炎的MenB(Meningococcal B)蛋白，2个粒径产生了相似的免疫应答。不同研究者针对颗粒同一性质得到不同的结果。本发明针对HPV L1抗原蛋白，纳微球粒径大小对其免疫应答的影响，设计制备粒径均一、不同粒径的PLGA纳微球，以其包埋HPV L1抗原蛋白，研究PLGA纳微球粒径对体内免疫应答强度和水平的影响，开发高效的HPVL1蛋白疫苗组合物。

发明内容

第一方面本发明提供一种疫苗组合物，包含与佐剂组合的抗原，抗原与佐剂的比例为10-80μg/mg，所述抗原包含HPV L1蛋白，所述佐剂组合物包括聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)或聚乳酸(PLA)。

在本发明的具体实施例中本发明的疫苗组合物，其中所述的HPV L1蛋白包埋在PLGA中或吸附在PLGA表面，均以粒径分布在100nm～100μm之间的纳微球形式存在。

在本发明的具体的实施例中疫苗组合物，其中所述的纳微球0-90％分布在100-1000nm、1-10μm或10-100μm任一范围内粒径或其组合之间。

在本发明的具体的实施例中疫苗组合物，优选纳微球0-90％分布在200-900nm、2-9μm或20-90μm任一粒径或其组合之间。

在本发明的具体的实施例中疫苗组合物，优选纳微球0-90％分布在400-700nm、4-7μm或40-70μm任一粒径或其组合之间。

在本发明的具体的实施例中疫苗组合物，所述的纳微球10-90％分布在100-1000nm、90-10％分布在1-10μm。

在本发明的一个具体的实施例中的疫苗组合物，优选的纳微球10-90％分布在300-800nm、90-10％分布在3-8μm。

在本发明的一个具体的实施例中的疫苗组合物，更优选所述的纳微球10-90％分布在500-600nm、90-10％分布在5-6μm。

在本发明的具体的实施例中的疫苗组合物，其中所述的纳微球10-90％分布在1-10μm、90-10％分布在10-100μm。

在本发明的一个具体的实施例中的疫苗组合物，优选所述的纳微球10-90％分布在3-8μm、90-10％分布在30-80μm。

在本发明的另一个具体的实施例中的疫苗组合物，优选其中所述的纳微球10-90％分布在5-6μm、90-10％分布在50-60μm。

在本发明的具体的实施例中疫苗组合物，优选纳微球10-90％分布在100-1000nm、90-10％分布在10-100μm。

在本发明的另一个具体的实施例中疫苗组合物，其中所述的纳微球10-90％分布在300-800nm、90-10％分布在30-80μm。

在本发明的另一个具体的实施例中的疫苗组合物，其中所述的纳微球10-90％分布在500-600nm、90-10％分布在50-60μm。

在本发明的具体的实施例中，其中所述的纳微球在每一个粒径范围内的粒径分散系数范围为0.005～0.2。

在本发明的一个具体的实施例中的疫苗组合物，其中所述佐剂中进一步包含如下免疫增强组分脂类物质：卵磷脂、硬脂胺、甘油磷脂中一种或几种的组合，其中脂类物质与PLGA或PLA的比例为1-99∶99-1，优选1-50∶100。

更具体的，在本发明的具体的实施例中疫苗组合物，其中所述佐剂中进一步包含小分子免疫佐剂：CpG、MPLA、咪喹莫特、PolyI：C等中一种或几种的组合，其中小分子免疫佐剂与PLGA或PLA的比例为10-100μg/mg。

在本发明的具体的实施例中的疫苗组合物，其中HPV L1蛋白是指HPV全长、截短或重组的L1形成的VLP、五聚体或多聚体。

在本发明的具体的实施例中疫苗组合物，其中HPV L1蛋白是指6、11、16、18、26、30、31、33、34、35、39、45，51、52、53、56、58、59、66、67、68、69、70、72、73或82、85、97型HPV中一种和/或几种的组合。

另一方面本发明公开一种疫苗制剂，该疫苗制剂由19所述的疫苗组合物与HPV L1蛋白及药用辅料制成，其中纳微球中HPV L1与游离HPV L1比例为10-90％∶90-10％，进一步更优选10-50％∶90-50％。

在本发明的具体的实施例中的疫苗制剂，所述的药用辅料为生理盐水或PBS缓冲液。

另一方面在本发明的具体的实施例中疫苗组合物的制备方法主要包含包埋和吸附两种方法，其中该包埋方法包括如下步骤：

(1)含药乳滴的制备：将HPV L1蛋白和/或小分子免疫佐剂CpG等溶于缓冲盐体系制备成内水相(W1)；

(2)将PLGA/PLA或PLGA/PLA与脂类物质溶于有机溶剂中制成油相(O)，将所述水相(W1)与油相(O)混合，制成油包水型(W1/O)预乳液，将此预乳液加入外水相(W2)中，制得W1/O/W2型预复乳液，将所述W1/O/W2型预复乳液反复过膜得到尺寸均一的W1/O/W2型乳液；

(3)乳滴固化：将W1/O/W2型乳液常温固化，洗涤、干燥后制成疫苗组合物。

在本发明的具体的实施例中提供一种制备方法，步骤(1)所述的内水相pH值范围为4.0-12.0，步骤(1)所述的缓冲盐体系为枸橼酸-磷酸氢二钠、醋酸-醋酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。

在本发明的一个具体的实施例中提供的制备方法，步骤(1)所述的内水相pH值范围为6.0-8.0。

在本发明的一个具体的实施例中步骤(2)所述油相为常温下呈液体与水不互溶的油性物质，优选为乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷或上述至少两种以上的混合物。

在本发明的具体的实施例中步骤(2)所述的外水相(W2)为含有0.001-10％的PVA水溶液，其醇解度为87～90％，聚合链节数为1700-1750；或为含有0.001-10％的PVA-PEG混合水溶液，PVA与PEG的质量百分比为20-80∶30-90。

在本发明的具体的实施例中步骤(2)中所述的油包水型(W1/O型)预乳液是通过采用均相乳化器或超声波乳化器制得的。

在本发明的具体的实施例中步骤(2)中所述的尺寸均一的W1/O/W2型乳液是通过将W1/O/W2型预乳液在较高压力作用下反复压过微孔膜得到的。

在本发明的具体的实施例中步骤(2)中所述的含抗原乳滴，水相(W1)与油相(O)体积比为1∶1～1∶50。

在本发明的具体的实施例中步骤(3)固化方式为溶剂蒸发法和溶剂萃取法。

在本发明的具体的实施例中，步骤(3)固化时间为1h-8h。

另一方面在本发明的具体的实施例中公开另一种疫苗组合物的制备方法，即吸附方法包括如下步骤(1)将PLGA/PLA或PLGA/PLA与脂类物质溶于有机溶剂中制成油相(O)，将此油相加入外水相(W2)中，制得O/W2型预复乳液；

(2)将所述O/W2型预复乳液反复过膜得到尺寸均一的O/W2型乳液；洗涤、干燥后得PLGA/PLA微球；

(3)将HPV L1蛋白和/或小分子免疫佐剂CpG溶于缓冲盐体系中，得1-40μg/0.2-1mL的HPV抗原溶液，将PLGA/PLA微球溶于缓冲盐体系中，得1-10mg/mL的溶液；将两溶液等体积混合，吸附过夜，得到吸附有HPV抗原的PLGA悬液，即为HPV疫苗组合物。

上述提到吸附方法中的具体操作步骤可以参照包埋方法中的相应步骤。

另一方面在本发明的具体的实施例中提供一种疫苗制剂的制备方法，在疫苗组合物的制备方法中的乳滴固化步骤后还包括如下步骤：

疫苗制剂形成：取质量比10-90％∶90-10％的疫苗组合物(纳微球)与游离的HPVL1蛋白用生理盐水或PBS缓冲液悬浮，配制成含有1-40μg/0.2-1mL的HPV抗原的微球悬液，制得HPV疫苗制剂。

在本发明的具体的实施例中提供的疫苗制剂的制备方法，PBS缓冲液PH值范围6-8，纳微球浓度为1-10mg/mL。

另一方面在本发明的具体的实施例中公开疫苗组合物在制备治疗或预防HPV感染的药物中的应用。

在本发明的具体的实施例中公开的疫苗制剂在制备治疗或预防HPV感染的药物中的应用。

在提供的任何方法的一个实施方案中，通过口服、皮下、肺部、鼻内、腹腔、淋巴、真皮内或肌肉给药施用该剂型。

在另一个实施方案中，提供一种人***瘤病毒的疫苗制剂，它是以包被了HPVL1VLP抗原的PLGA均一微球为主的一种疫苗制剂，同时可共包埋或复配其他分子佐剂，还可向疫苗中复配一定量的未包被的HPVL1VLP抗原，即由包被在纳微球的HPV L1抗原与游离的HPV L1抗原共同及临床或药学上可接受的药用辅料制成疫苗制剂。

在另一个实施方案中微球中抗原装载率为20ug/mg以上；包被抗原与游离抗原质量比为0-100％。

采用本发明所制备微球表面光滑平整，球形良好(图1，图2，图3)，在每一个粒径范围内所制备的粒径均一可控(图4)，粒径分散系数在范围为0.005～0.2，优选0.005～0.1，更优选0.005～0.05。载药量和包埋率高，动物实验表明本发明的新型HPV疫苗是安全的，对实验动物无可见的毒性，可有效的刺激动物产生较强的体液免疫和细胞免疫应答(图5，图6，图7，图8)可用于人***瘤病毒的相关疾病或感染的预防和治疗。

为了清楚理解本发明，以下将结合附图和实例进一步说明之，但以下的实施例并非限定本发明。

附图说明

图1PLGA包埋HPVL1五聚体抗原纳微球扫描电镜图(430nm)

图2PLGA包埋HPVL1五聚体抗原纳微球扫描电镜图(1.38μm)

图3PLGA包埋HPVL1五聚体抗原纳微球扫描电镜图(5.60μm)

图4PLGA包埋HPVL1五聚体抗原纳微球扫描电镜图(400nm)

图5PLGA包埋HPVL1五聚体抗原纳微球扫描电镜图(800nm)

图6PLGA包埋HPVL1五聚体抗原纳微球扫描电镜图(1.3抗原)

图7PLGA/PC包埋HPVL1五聚体抗原纳微球扫描电镜图(400nm)

图8PLGA包裹HPV16L1五聚体纳微球扫描电镜图(1聚体)

图9PLGA包裹HPV16L1五聚体和CpG的纳微球(1纳微)

图10PLGA包埋HPVL1VLP抗原纳微球扫描电镜图(1原纳)

图11PLGA/HSPC包埋HPVL1VLP抗原纳微球扫描电镜图(1原纳)

图12PLA包埋HPVL1VLP抗原纳微球扫描电镜图(1原纳)

图13PLGA包埋HPVL1VLP抗原纳微球扫描电镜图(10纳微)

图14PLGA纳微球扫描电镜图(1微球)

图15载HPV16L1五聚体抗原PLGA纳微球粒径分布图

图16不同粒径载抗原PLGA微球组免疫小鼠38天后血清中中和抗体滴度

图17不同粒径载抗原PLGA微球组免疫小鼠38天后血清中特异性抗体IgG滴度

图18各组免疫小鼠后脾细胞上清中的细胞因子水平检测结果(Luminex技术)

图19各组免疫小鼠后脾细胞上清中IFN-小和IL-4水平检测结果(ELISA法)

图20各组免疫小鼠后脾细胞IL-4和IFN-小酶联免疫斑点形成细胞数(SFC)(ELISPOT法)

图21HPV L1五聚体蛋白采用不同佐剂***免疫小鼠后，血清结合抗体滴度

图22HPV L1五聚体蛋白采用不同佐剂***免疫小鼠后，中和抗体的滴度

图23HPV L1五聚体蛋白采用不同佐剂***免疫小鼠后，ELISPOT测定的细胞免疫应答结果

图24HPV L1五聚体蛋白采用不同佐剂***免疫小鼠，取其脾细胞在体外培养条件下经抗原刺激后，ELISA测定IFN-A和IL-4细胞因子分泌情况

图25HPV L1五聚体蛋白采用不同佐剂***免疫小鼠，取其脾细胞在体外培养条件下经抗原刺激后，Luminex方法测定细胞因子分泌情况。

图26PLGA复配CpG小分子佐剂包被HPV16L1五聚体的微球免疫小鼠后中和抗体滴度

图27PLGA复配CpG小分子佐剂包被HPV16L1五聚体的微球免疫小鼠后结合抗体滴度

图28不同粒径及其组合的PLGA包被HPV16L1五聚体的微球免疫小鼠后结合抗体滴度

图29不同粒径及其组合的PLGA包被HPV16L1VLP的微球免疫小鼠后中和抗体滴度

图30PLGA、PLGA/HSPC、PLA包被HPV16L1VLP的微球免疫小鼠后中和抗体滴度

图31PLGA、PLGA/HSPC、PLA包被HPV16L1VLP的微球免疫小鼠后结合抗体滴度

图32PLGA微球吸附HPV16L1VLP后免疫小鼠后的结合抗体滴度

具体实例

本发明参照如下表格实施本发明的技术方案，本发明的技术方案包括但不限于如下实施例。

表1

表2

表3

表4

上述表格中涉及具体实施例如下：

具体实施例一——100nmPLGA载HPV 6L1五聚体抗原微球的制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为1.33mg/mL的HPV 6L1五聚体溶于枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲盐溶液的抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为600r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以1.5M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为0.6μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为400nm，PDI值为0.04，药物包埋率为90.8％。

具体实施例二——包含游离抗原的HPV疫苗的制备

称取实施例一所制备的平均粒径为100nm的载HPV 6L1五聚体抗原微球4.45mg复配120.3μL浓度为1.333mg/mL的HPV 6L1五聚体抗原，加入pH＝7.0的PBS缓冲液至1mL，配制得含有200μg/mL的且纳微球中包被抗原与游离抗原比为2∶8的HPV抗原的微球悬液，制得HPV疫苗制剂。

具体实施例三——430nm PLGA载HPV 16L1五聚体抗原微球的制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为4mg/mL的HPV 16L1五聚体抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为600r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以1M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为1.4μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为430nm，PDI值为0.03，药物包埋率为92.6％。所制得微球扫描电镜图见图1。

具体实施例五——1.38μm PLGA载HPV16L1五聚体抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为6.67mg/mL的HPV 16L1五聚体抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为400r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以0.25MPa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为5.2μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为1.38μm，PDI值为0.05，药物包埋率为93.1％。所制得载抗原纳微球扫描电镜图如图2所示。

具体实施例六——1μm PLGA载HPV16L1五聚体抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为6.67mg/mL的HPV 16L1五聚体抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为400r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以0.25MPa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为5.2μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为1μm，PDI值为0.05，药物包埋率为93.1％。所制得载抗原纳微球扫描电镜图如图8所示。

具体实施例七——5.6μm PLGA载HPV16L1五聚体抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为9.33mg/mL的HPV 16L1五聚体抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为300r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以40kPa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为15μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为5.6μm，PDI值为0.08，药物包埋率为79.7％。所制得载抗原纳微球扫描电镜图如图3所示。

具体实施例十七——20.82μm PLGA载HPV45L1五聚体抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为5.333mg/mL的HPV 45L1五聚体抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为250r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以5kPa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为52μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为20.82μm，PDI值为0.10，药物包埋率为89.2％。

具体实施例十八——80.71μm PLA载HPV58L1五聚体抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为5.333mg/mL的HPV 58L1五聚体抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为250r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以0.1kPa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为190.3μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为80.71μm，PDI值为0.18，药物包埋率为85.5％。

具体实施例十九——400nm PLGA/HSPC载HPV16L1五聚体抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将300mg的PLGA和100mg卵磷脂溶于10.0mL的MC溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为1.333mg/mL的HPV 6L1五聚体抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为500r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以1M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为1.4μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为400nm，PDI值为0.05，药物包埋率为92.8％。所得微球扫描电镜图如7。

具体实施例二十——800nm PLGA载HPV16L1五聚体抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将300mg的PLGA溶于10.0mL的MC溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为4mg/mL的HPV 11L1五聚体抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为500r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以1M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为9.2μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为800nm，PDI值为0.06，药物包埋率为88.2％。所得微球的扫描电镜图如图5。

具体实施例二十一——1300nm PLGA载HPV16L1五聚体抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将300mg的PLGA溶于10.0mL的MC溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为4mg/mL的HPV 11L1五聚体抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为500r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以1M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为9.2μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为1300nm，PDI值为0.06，药物包埋率为88.2％。所得微球的扫描电镜图如图6。

具体实施例二十六——1000nm PLGA载抗原纳微球共包埋CPG1826载HPV16L1五聚体抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为4mg/mL的HPV 16L1五聚体抗原蛋白和5μg CpG1826作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为400r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以0.25M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为1.4μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为1000nm，PDI值为0.06，药物包埋率为87.8％。所得微球扫描电镜图如图9。

具体实施例二十七——1.57μm PLGA载抗原纳微球共包埋MPLA载HPV16L1五聚体抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为6.67mg/mL的HPV 16L1五聚体抗原蛋白和5μg MPLA作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为400r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以0.25M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为5.2μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为1.57μm，PDI值为0.05，药物包埋率为82.2％。

具体实施例二十九——23.57μm PLA载抗原纳微球共包埋PolyI：C载HPV45L1五聚体抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为5.33mg/mL的HPV 16L1五聚体抗原蛋白和5μg PolyI：C作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为400r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以0.25M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为5.2μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为23.57μm，PDI值为0.09，药物包埋率为86.3％。具体实施例三十一——400nmPLGA载HPV 16L1五聚体抗原微球的制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为1.33mg/mL的HPV16L1VLP抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为600r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以1.5MPa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为1.4μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为400nm，PDI值为0.05，药物包埋率为90.5％。所制备得到微球的扫描电镜图如图4所示

具体实施例三十六——128nmPLGA载HPV 6L1VLP抗原微球的制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为1.33mg/mL的HPV 6L1VLP抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为600r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以1.5M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为0.4μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为128nm，PDI值为0.03，药物包埋率为91.7％。

具体实施例三十七

称取实施例三十六所制备的平均粒径为128nm的载HPV 6L1VLP抗原微球4.4mg复配12.03μL浓度为13.33mg/mL的HPV 6L1五聚体抗原，加生理盐水或pH＝7.0的PBS缓冲液至1mL，配制得含有200μg/mL的且纳微球中包被抗原与游离抗原比为2∶8的HPV抗原的微球悬液，制得HPV疫苗制剂。

具体实施例三十八——467nm PLGA载HPV 11L1VLP抗原微球的制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为4mg/mL的HPV 11L1VLP抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为600r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以1M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为1.4μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为467nm，PDI值为0.05，药物包埋率为89.2％。

具体实施例四十——1μm PLGA载HPV16L 1VLP抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为6.67mg/mL的HPV16L1VLP抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为400r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以0.25MPa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为5.2μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为1μm，PDI值为0.05，药物包埋率为89.5％。所制得载抗原纳微球扫描电镜图如图10所示。

具体实施例四十二——5.87μm PLGA载HPV18L1VLP抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为9.33mg/mL的HPV18L1VLP抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为300r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以40kPa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为15μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为5.87μm，PDI值为0.07，药物包埋率为89.2％。

具体实施例五十二——25.02μm PLA载HPV45L1VLP抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为5.33mg/mL的HPV 45L1VLP抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为250r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以5kPa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为52μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为25.02um，PDI值为0.06，药物包埋率为75.3％。

具体实施例五十五——1000nm PLGA/HSPC载HPV16L1VLP抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将300mg的PLGA和100mg卵磷脂溶于10.0mL的MC溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为4mg/mL的HPV 16L1VLP抗原蛋白作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为500r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以1MPa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为9.2μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为1000nm，PDI值为0.07，药物包埋率为80.6％。所制得载抗原纳微球扫描电镜图如图11所示。

具体实施例五十六——489nm PLGA载抗原纳微球共包埋CPG1826载HPV11L1VLP抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为4mg/mL的HPV 11L1VLP抗原蛋白和5μg CpG1826作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为400r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以0.25M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为1.4μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为489nm，PDI值为0.05，药物包埋率为90.8％。

具体实施例六十六——1000nm PLA载抗原纳微球载HPV16L1VLP抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为6.67mg/mL的HPV 16L1VLP抗原蛋白和5μg CpG1826作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为400r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以0.25M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为1.4μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为1000nm，PDI值为0.04，药物包埋率为89.4％。所制得载抗原纳微球扫描电镜图如图12所示。

具体实施例六十八——10μm PLGA载抗原纳微球载HPV16L1VLP抗原微球制备

采用快速膜乳化技术结合复乳溶剂去除法制备载抗原纳微球。具体方法为：将400mg的PLGA溶于10.0mL的EA溶剂中作为油相(O)，加入3mL浓度为6.67mg/mL的HPV16L1VLP抗原蛋白和5μg CpG1826作为内水相(W1)，用S-450D超声波细胞破碎仪在冰水浴条件下进行初乳化(超声功率设定为30％，超声时间为60s)制备W1/O型初乳，然后将初乳液倒入65mL的含1.5％PVA(w/v)的NaCl的水溶液(外水相W2)中，采用磁力搅拌制备预复乳液(W1/O/W2)，乳化条件为400r/min下搅拌2min。随后，将此预复乳液倒入快速膜乳化的储料罐中，以0.25M Pa压力的氮气将复乳液反复压过膜孔径为50.2μm的SPG膜，直至得到均一的复乳液滴(W1/O/W2)。将所制得的均一复乳液滴倒入780mL的0.9％NaCl溶液中，在室温下搅拌4h(磁力搅拌速率200rpm)去除有机溶剂，固化后的微球用去离子水离心洗涤3次，最后冷冻干燥制成成品。用激光粒度仪测定粒径分布情况，平均粒径为10μm，PDI值为0.07，药物包埋率为90.2％，所制得载抗原纳微球扫描电镜图如图13所不。

具体实施例七十四

分别取实施例三十一制备得到的430nm纳微球1.128mg和实施例五制备得到的1.38五制纳微球1.157mg配制成抗原质量比为50％∶50％的粒径组合，加入PH值为7的PBS缓冲液1mL，制备得含有100μg/mL的抗原且纳微球浓度为2.31mg/mL混悬液。

具体实施例七十九

分别取实施例三十一制备得到的430nm纳微球1.128mg和实施例三十三制备得到的20.65μm纳微球1.147mg配制成抗原质量比为50％∶50％的粒径组合，加入PH值为7的PBS缓冲液1mL，制备得含有100μg/mL的抗原且纳微球浓度为2.27mg/mL混悬液。

具体实施例八十四

分别取实施例五制备得到的1.38μm纳微球1.157mg和实施例三十三制备得到的20.65μm纳微球1.147mg配制成抗原质量比为50％∶50％的粒径组合，加入PH值为7的PBS缓冲液1mL，制备得含有100μg/mL的抗原且纳微球浓度为2.31mg/mL混悬液。

具体实施例九十二

分别取实施例三十一制备得到的430nm纳微球0.68mg、实施例五制备得到的1.38μm纳微球0.69mg和实施例三十三制备得到的20.65μm纳微球0.92mg配制成抗原质量比为30％∶30％∶40％的粒径组合，加入PH值为7的PBS缓冲液1mL，制备得含有100μg/mL的抗原且纳微球浓度为2.29mg/mL混悬液。

具体实施例一百零一

分别取实施例六十八制备得到的10μm纳微球和实施例四十制备得到的1μm纳微球配制成抗原质量比为20％∶80％的粒径组合，加入PH值为7的PBS缓冲液1mL，制备得含有100μg/mL的抗原且纳微球浓度为2.35mg/mL混悬液。

具体实施例一百零二

分别取实施例六十八制备得到的10μm纳微球和实施例四十制备得到的1μm纳微球配制成抗原质量比为80％∶20％的粒径组合，加入PH值为7的PBS缓冲液1mL，制备得含有100μg/mL的抗原且纳微球浓度为2.35mg/mL混悬液。

具体实施例一百零三

分别取实施例六十八制备得到的10μm纳微球1.175mg和实施例四十制备得到的1μm纳微球1.174mg配制成抗原质量比为50％∶50％的粒径组合，加入PH值为7的PBS缓冲液1mL，制备得含有100μg/mL的抗原且纳微球浓度为2.35mg/mL混悬液。

具体实施例一百零六

分别取实施例六十六制备得到的458nm纳微球1.175mg和实施例六十八制备得到的23.58μm纳微球1.164mg配制成抗原质量比为50％∶50％的粒径组合，加入PH值为7的PBS缓冲液1mL，制备得含有100μg/mL的抗原且纳微球浓度为2.34mg/mL混悬液。

具体实施例一百一十一

分别取实施例四十制备得到的1.69μm纳微球1.174mg和实施例六十八制备得到的23.58μm纳微球1.164mg配制成抗原质量比为50％∶50％的粒径组合，加入PH值为7的PBS缓冲液1mL，制备得含有100μg/mL的抗原且纳微球浓度为2.34mg/mL混悬液。

具体实施例一百二十

分别取实施例六十六制备得到的458nm纳微球0.71mg、实施例四十制备得到的1.69μm纳微球1.174mg和实施例六十八制备得到的0.47μm纳微球0.004mg配制成抗原质量比为30％∶50％∶20％的粒径组合，加入PH值为7的PBS缓冲液1mL，制备得含有100μg/mL的抗原且纳微球浓度为2.35mg/mL混悬液。

表格中其他实施例的具体实施步骤参照以上相关具体实施例施行。实例一百二十五——微球粒径及粒径分布表征

将其中一些实施例制备得到的微球悬浮液于蒸馏水中超声使其均匀分散，采用激光粒度仪(3000HS，UK)测定其粒径大小及分布，不同载抗原纳微球佐剂粒径分布图如图15所示。

实施例一百二十六——HPV装载率测定

将制备好的所述冻干纳微球5mg悬浮于1.0mL含5％(w/v)SDS浓度为0.1M的NaOH溶液，室温下振荡24小时，使微球完全溶解(水解)，溶液中蛋白质含量micro-BCA试剂盒进行测定。

实施例一百二十七——不同粒径PLGA载抗原微球免疫后抗体水平评价比较

取实施例五和实施例三制备好的所述冻干微球，悬浮于生理盐水中，得微球悬液，使得微球悬液中抗原的含量为20μg/100μL，即制得HPV疫苗制剂。

取实施例五和实施例三制得的两种纳微球疫苗制剂背部皮下免疫8-10周的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠注射抗原剂量为20μg/100μL，同时设立以铝盐为佐剂的HPV五聚体抗原作为对照组。

检测以上三组的体液免疫效果。检测的指标包括不同粒径PLGA微球载抗原组免疫小鼠38天后的中和抗体水平和特异性抗体IgG水平，分别图16和图17所示。

不同粒径的PLGA载抗原纳微球免疫小鼠后产生的特异性抗体中和抗体水平不同。由图16可知，小鼠免疫38天后1.38μm载抗原PLGA微球产生的中和抗体水平和IgG水平均值都高于铝佐剂组，但无显著性差异；但1.38μm载抗原PLGA组血清中中和抗体水平和IgG水平均显著高于430nm载抗原PLGA组(P＜0.05或P＜0.01)。

实施例一百二十八——不同粒径PLGA载抗原微球免疫后细胞因子水平评价比较

取实施例五和实施例三制得的两种纳微球疫苗制剂背部皮下免疫8-10周的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠注射抗原剂量为20μg/100μL，同时设立以铝盐为佐剂的HPV五聚体抗原作为对照组。

检测以上三组的细胞免疫效果。检测指标包括采用抗原体外刺激小鼠脾细胞72h后，脾细胞上清中细胞因子水平(Luminex技术、ELISA法)，结果如图18和图19所示；以及采用抗原体外刺激小鼠脾细胞36h后，IFN-γ和IL-4酶联免疫斑点形成细胞数(ELISPOT法)，结果如图20所示。

IL-4和IL-6代表Th2型应答的细胞因子，IFN-γ和IL-2代表Th1型应答的细胞因子由图18、图19和图20均可以看出，430nm和1.38μm两个粒径的载抗原PLGA微球组脾细胞上清中的IFN-γ水平均显著高于铝佐剂组(P＜0.05或P＜0.01)，且430nm载抗原PLGA纳微球组脾细胞上清中的IFN-γ水平极显著高于1.38μm载抗原PLGA纳微球组组(P＜0.01)；由图7可知，430nm载抗原PLGA纳微球组脾细胞上清中的IL-2水平也显著高于铝佐剂组(P＜0.05)，且430nm载抗原PLGA纳微球组脾细胞上清中IL-2的分泌水平也高于1.38μm载抗原PLGA组，但二者无显著差异。这表明，相比铝佐剂，载抗原PLGA纳微球组能够有效诱导Th1型免疫应答，增强细胞免疫应答，且粒径较小的PLGA载抗原纳微球(430nm)相比大粒径PLGA载抗原纳微球(1.38μm)更能够有效诱导Th1型免疫应答，增强细胞免疫应答。

在Th2型细胞因子分泌水平方面，不同粒径载抗原PLGA纳微球组能诱导与铝佐剂类似的IL-4分泌水平，无显著性差异，1.38μm载抗原PLGA纳微球组脾细胞上清中的IL-4水平显著高于430nm载抗原PLGA纳微球组组(P＜0.05或P＜0.01)；1.38μm载抗原PLGA纳微球组脾细胞上清中的IL-6水平显著高于铝佐剂组(P＜0.05)，且1.38μm载抗原PLGA纳微球组脾细胞上清中的IL-6水平极显著高于430nm载抗原PLGA纳米球组(P＜0.01)。

以上结果表明载抗原PLGA纳微球组可以诱导与铝佐剂相似的IL-4的分泌水平，可以有效诱导体液免疫，以及更高水平的IFN-γ水平，显著提升细胞免疫应答；而且大粒径的载抗原PLGA微球(1.38μm)能更显著提高IL-6、IL-4的分泌水平，增强Th2型免疫应答，促进B细胞活化产生抗体，有效地诱导体液免疫应答；而小粒径载抗原PLGA微球(430nm)显著提升IFN-γ的分泌水平，增强Th1型免疫应答，有助于细胞免疫应答的提升。

实施例一百二十九——1.38μmPLGA载抗原纳微球复配游离抗原免疫小鼠后免疫效果分析

取实施例六制得的微球制剂背部皮下免疫8-10周的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠注射抗原剂量为20μg/100μL，其中微球疫苗制剂中HPV抗原含量为10μg/只，游离HPV抗原含量为10μg/只，同时设立以铝盐为佐剂的HPV五聚体抗原和实施例5制备的1.38μm PLGA载抗原纳微球作为对照组。检测以上几组的体液免疫和细胞免疫效果。

结果显示1.38μm PLGA载抗原纳微球复配游离抗原产生的中和抗体滴度和特异性抗体IgG滴度是1.38μm PLGA载抗原纳微球组的5倍左右，这表明PLGA载抗原纳微球复配游离抗原可以有效地增强体液免疫效果。

实施例一百三十四——五聚体及VLP纳微球的制备

参照以上具体实施方式，按照以下表格的配方制备不同比例、不同粒径及不同型别的五聚体及VLP的纳微球的制备。

表5载HPV16L1五聚体PLGA微球不同粒径的序号

表6载HPV16L1五聚体抗原的PLGA微球不同粒径组合序号

表7载HPV16L1五聚体抗原的PLGA微球不同HPV型别序号

表8载HPV16L1五聚体抗原的PLGA微球复配脂类物质序号

表9载HPV16L1五聚体抗原的PLGA微球复配不同分子佐剂的序号

表10载HPV16L1VLP抗原的PLGA微球的不同粒径的序号

表11载HPV16L1VLP抗原的PLGA微球的不同粒径组合序号

表12载HPV16L1VLP抗原的PLGA微球的不同HPV型别序号

表13载HPV16L1VLP抗原的PLGA微球的复配脂类物质序号

表14载HPV16L1VLP抗原的PLGA微球的复配不同分子佐剂的序号

实施例一百三十五——不同粒径的纳微球HPV L1五聚体免疫原性研究

取实施例十九、二十、三十和二十一制备的样品，以400nm、800nm、1.3μm三种不同粒径PLGA包埋的HPV L1五聚体蛋白以及400nmPLGA/PC包被的HPV L1五聚体蛋白免疫小鼠，初步实验结果表明，该佐剂***可以有效诱导包括中和抗体和细胞免疫在内的抗原特异性免疫应答。在图4中，分析血清中的抗体，结果表明，与传统铝盐佐剂组相比，400nm和800nmPLGA佐剂组的中和抗体滴度基本相同，但1.3μm的中和抗体佐剂组以及400nmPLGA+卵磷脂(PLGA/PC)复合佐剂组的中和抗体和结合滴度较高；另800nm和1.3μ.3nm的佐剂组的结合抗体滴度均显著高于400nm PLGA，但两者之间无显著性差异。以ELISPOT方法检测HPV特异性CTL免疫应答，结果表明，传统铝佐剂组基本没有诱导出特异性CTL免疫应答，而PLGA佐剂组均有效地诱导出比较高水平的HPV特异性CTL免疫应答，其中尤以400nm和800nm PLGA佐剂组为最高(图2)。取免疫后小鼠的脾细胞在体外培养条件下经抗原刺激后测定上清里的细胞因子分泌情况，结果表明，比较Th1型(刺激细胞免疫)细胞因子IFN-细和TNF-细等的分泌量，PLGA佐剂组均显著高于传统铝盐佐剂组；而在Th2型细胞因子(刺激体液/抗体免疫应答)IL-4方面，PLGA佐剂组基本与传统铝盐佐剂组相同，但使用PLGA+卵磷脂(PLGA/PC)的复合佐剂组则显著高于其它组。结果见图21、22、23、24、25。

实施例一百三十六——1000nm PLGA载抗原纳微球共包埋CPG1826联合免疫小鼠后免疫效果分析

按照实施例二十六制备共包埋CpG1826的PLGA载抗原纳微球。将所制得的微球冻干后，悬浮于生理盐水中，得微球悬液，使得微球悬液中抗原的含量为20μg/100μL，即制得HPV疫苗制剂。将其背部皮下免疫8-10周的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠注射抗原剂量为20μg/100μL，同时设立以铝盐为佐剂的HPV五聚体抗原和1000nm PLGA载抗原纳微球作为对照组。检测以上几组的体液免疫和细胞免疫效果。PLGA复配CpG小分子佐剂包被HPV16L1五聚体的微球免疫小鼠后中和抗体和结合抗体滴度分别见图26和27，结果显示共包埋CpG的1000nm载抗原PLGA纳微球组可免疫小鼠后能诱导与铝盐佐剂水平相当的中和抗体水平。而在结和抗体水平上，1μm PLGA包埋的HPV16L1五聚体蛋白在初次免疫时诱导了显著高于铝盐佐剂的结合抗体水平，在第二次免疫时能诱导与铝盐佐剂相当水平的结合抗体滴度，并且在添加CpG小分子佐剂后在第二次免疫时诱导的结合抗体水平显著高于不添加CpG组，同时在第一次和第二次免疫时诱导的结合抗体水平均显著高于传统铝盐佐剂。

实施例一百三十七——不同粒径组合的PLGA载抗原纳微球免疫小鼠后免疫效果分析

取实施例一百零一、一百零二、一百零三制得的不同粒径组合的微球制剂背部皮下免疫8-10周的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠注射抗原剂量为20μg/100μL，同时设立以铝盐为佐剂的HPV五聚体抗原和实施例四十、六十八制备的不同粒径的PLGA载抗原纳微球作为对照组。检测以上几组的体液免疫效果。不同粒径及其组合的PLGA包被HPV16L1五聚体的微球免疫小鼠后结合抗体滴度和中和抗体滴度分别如28和29。

结果显示1μm或10μm或两粒径按一定比例组合的PLGA包埋的HPV16L1VLP诱导的中和抗体滴度无显著差异，而1μm PLGA-HPV16L1VLP组在初次免疫后诱导的结合抗体滴度显著低于HPV16L1VLP-1μm+10μm(0.5+0.5)组，在第二次免疫后显著低于HPV16L1VLP-1μm+10μm(0.2+0.8)组和HPV16L1VLP-1μm+10μm(0.8+0.2)组。

实施例一百三十八——不同佐剂的HPV 16L1VLP免疫效应的研究

以PLGA，PLGA/HSPC，PLA包埋HPV 16L1VLP免疫小鼠后，诱导产生的中和抗体和结合抗体滴度均无显著差异，如图30和31。

实施例一百三十九——PLGA的颗粒的制备

将100mg的PLGA溶于20mL的二氯甲烷中作为油相(O)，配制1.0％的PVA溶液作为外水相(W2)，将油相(O)加入至50mL的外水相(W2)中，制备得到水包油型的预乳液(W2/O)，将此预复乳液采用快速膜乳化的方法反复过膜制备得到粒径均一的水包油的复乳液(O/W2)；固化3h，离心洗涤，冻干，得到干燥的PLGA微球，PLGA的SEM照片如图2所示。

实施例一百四十——PLGA的颗粒吸附HPV16L1VLP疫苗组合物的制备

将制备得到的PLGA微球溶于0.8mL的pH＝5、10mM PBS缓冲溶液中，得20mg/mL的PLGA微球悬液；取一定量的HPV溶于0.8mL的pH＝5、10mM PBS缓冲溶液中，得20ug/mL的HPV抗原溶液，将两者等体积混合，吸附过夜，得到1.6mL吸附有HPV抗原的PLGA悬液，即为HPV疫苗组合物。

实施例一百四十——PLGA微球对HPV 16L1VLP吸附免疫应答的研究

取实施例一百三十九中1施例的PLGA吸附HPV 16L1VLP样品后免疫小鼠，PLGA-HPV16L1VLP可以诱导与Merck公司的Gardasil疫苗相当水平的结合抗体滴度。结果如图32。

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Claims (20)

1.一种疫苗组合物，包含与佐剂组合的抗原，抗原与佐剂的比例为10-80μg/mg，所述抗原包含HPV L1蛋白，所述佐剂组合物包括聚乳酸-聚乙醇酸共聚物PLGA或聚乳酸PLA，所述的HPV L1蛋白包埋在PLGA或PLA中或吸附在PLGA或PLA表面，均以纳微球形式存在，所述的纳微球10-90％分布在1-10μm、90-10％分布在10-100μm，所述的纳微球在每一个粒径范围内的粒径分散系数范围为0.005～0.2；所述佐剂中进一步包含卵磷脂，其中卵磷脂与PLGA或PLA的比例为1-99：99-1；其中HPV L1蛋白是指HPV全长、截短或重组的L1形成的VLP或五聚体。

2.如权利要求1的疫苗组合物，其中所述的纳微球10-90％分布在3-8μm、90-10％分布在30-80μm。

3.如权利要求2的疫苗组合物，其中所述的纳微球10-90％分布在5-6μm、90-10％分布在50-60μm。

4.如权利要求3所述疫苗组合物，其中所述佐剂中进一步包含小分子免疫佐剂：CpG、MPLA、咪喹莫特、PolyI:C中的一种或几种的组合，其中小分子免疫佐剂与PLGA或PLA的比例为10-100μg/mg。

5.如权利要求1所述疫苗组合物，其中HPV L1蛋白是指6、11、16、18、26、30、31、33、34、35、39、45，5l、52、53、56、58、59、66、67、68、69、70、72、73或82、85、97型HPV中一种和/或几种的组合。

6.一种疫苗制剂，其特征在于该疫苗制剂由权利要求5所述的疫苗组合物与HPV L1蛋白及药用辅料制成，其中纳微球中HPV L1与游离HPV L1比例为10-90％：90-10％。

7.如权利要求6所述的疫苗制剂，其特征在于所述的药用辅料为生理盐水或PBS缓冲液。

8.如权利要求4所述疫苗组合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)含药乳滴的制备：将HPV L1蛋白和小分子免疫佐剂CpG溶于缓冲盐体系制备成pH值范围为4.0-12.0的内水相W1；

(2)将PLGA或PLA与脂类物质溶于有机溶剂中制成油相O，将所述内水相W1与油相O混合，制成油包水型W1/O预乳液，将此预乳液加入外水相中，制得W1/O/W2型预复乳液，将所述W1/O/W2型预复乳液反复过膜得到尺寸均一的W1/O/W2型乳液；

(3)乳滴固化：将W1/O/W2型乳液常温固化，洗涤、干燥后制成疫苗组合物。

9.如权利要求5所述疫苗组合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)将PLGA或PLA与脂类物质溶于有机溶剂中制成油相O，将此油相加入外水相W2中，制得O/W2型预复乳液；

(2)将所述O/W2型预复乳液反复过膜得到尺寸均一的O/W2型乳液；洗涤、干燥后得PLGA或PLA微球；

(3)将HPV L1蛋白和小分子免疫佐剂CpG溶于缓冲盐体系中，得1-40μg/0.2-1mL的HPV抗原溶液，将PLGA或PLA微球溶于缓冲盐体系中，得1-10mg/mL的溶液；将两溶液等体积混合，吸附过夜，得到吸附有HPV抗原的PLGA悬液，即为HPV疫苗组合物。

10.如权利要求8或9所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于所述缓冲盐体系为枸橼酸-磷酸氢二钠、醋酸－醋酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。

11.如权利要求8所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的内水相pH值范围为6.0-8.0。

12.如权利要求8或9所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于，所述油相为常温下呈液体与水不互溶的油性物质。

13.如权利要求8或9所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于，所述的外水相W2为含有0.001-10％的PVA水溶液，其醇解度为87～90％，聚合链节数为1700-1750；或为含有0.001-10％的PVA-PEG混合水溶液，PVA与PEG的质量百分比为20-80：30-90。

14.如权利要求8所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的油包水型W1/O型预乳液是通过采用均相乳化器或超声波乳化器制得的。

15.如权利要求8所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的尺寸均一的W1/O/W2型乳液是通过将W1/O/W2型预乳液在压力作用下反复压过微孔膜得到的。

16.如权利要求8所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于，固化方式为溶剂蒸发法或溶剂萃取法。

17.如权利要求8所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于，固化时间为1h-8h。

18.一种疫苗制剂的制备方法，其特征在于在如权利要求8所述疫苗组合物的制备方法中的乳滴固化步骤后还包括如下步骤：

(4)疫苗制剂形成：取质量比10-90％：90-10％的疫苗组合物与游离的HPVL1蛋白用生理盐水或PBS缓冲液悬浮，配制成含有1-40μg/0.2-1mL的HPV抗原的微球悬液，制得HPV疫苗制剂。

19.如权利要求5所述的疫苗组合物在制备治疗或预防HPV感染的药物中的应用。

20.如权利要求6或7所述的疫苗制剂在制备治疗或预防HPV感染的药物中的应用。