CN114525362B

CN114525362B - 用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合及其应用

Info

Publication number: CN114525362B
Application number: CN202210267190.8A
Authority: CN
Inventors: 丁君; 常亚青; 国超; 王荦; 宋坚
Original assignee: Dalian Ocean University
Current assignee: Dalian Ocean University
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2022-03-18
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2042-03-18
Also published as: CN114525362A

Abstract

本发明涉及用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合及其应用，属于分子生物学领域，所述的引物组合如表1所示。本发明还提供利用上述引物组合来进行鉴定“安源1号”刺参群体的方法，采用SDS法提取刺参样品的DNA，以所述引物组合进行待测样品SNP基因分型，检测“安源1号”刺参群体特有标记位点；判定标准为：检测个体具有全部3个上述引物标记位点，判定为“安源1号”刺参个体；群体样品大于等于30只，检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出，群体中阳性检出率达到80％及以上，判定“安源1号”刺参群体。

Description

用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及鉴定“安源1号”刺参群体的分子鉴定标记引物组合及应用。

背景技术

刺参是我国传统高端保健食品，在我国辽宁、山东广泛养殖，是我国海水养殖的支柱产业，年产量保持在20万吨左右，产业链长，产品多元化，年产值达到300-400亿元。截止2021年，经全国水产原种与良种委员会审定，农业农村部公告，刺参“安源1号”(GS-01-014-2017)获批国审水产新品种并推广，刺参“安源1号”是以棘刺数数量超过50个且生长速度快的“水院1号”为亲本，以棘刺数量、体重和出肉率为选育目标，经过连续4代选育而成。在相同的养殖条件下，与普通刺参相比，“安源1号”刺参体表颜色呈褐色或黑褐色，棘刺数量多且长度较长，生长速率快，加工出成率高，目前已在山东、辽宁、福建沿海广泛推广养殖，经济效益显著，市场上已有冒充“安源1号”海参幼苗，扰乱市场，开发可用于鉴别“安源1号”刺参的分子标记不但可有效解决纠纷，而且对规范海参市场，有效开展刺参种质资源保护具有重要意义。

单核苷酸多态性(SNPs)标记作为第三代分子标记，为共显性标记，具有较高的多态性，可通过测序技术快速检测。本研究利用重测序数据进行“安源1号”特有SNP位点挖掘，结合KASP分型技术设计可用于鉴别“安源1号”刺参的引物组合，为刺参新品种“安源1号”亲权鉴定和种质资源保护提供技术支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于基于重测序技术和KASP分型技术提供一共可用于鉴别“安源1号”刺参群体的SNP标记的引物，应用此引物可以成功鉴别“安源1号”刺参群体和个体。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

一种用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合，所述引物组合见表1：

表1用于鉴定“安源1号”刺参的SNP标记引物组合

/>

本发明提供利用上述3组引物用于鉴定刺参新品种“安源1号”群体的方法，所述方法具体如下：

采用SDS法提取刺参样品的DNA，以KASP组合标记进行待测样品SNP基因分型，检测“安源1号”刺参群体特有标记位点；判定标准为：检测个体具有全部3个上述引物标记位点，判定为“安源1号”刺参个体。群体样品大于等于30只，检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出，群体中阳性检出率达到80％及以上，判定“安源1号”刺参群体。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明利用重测序数据进行刺参“安源1号”群体特有SNP位点挖掘，结合KASP分型技术设计可用于鉴别刺参“安源1号”群体的引物组合，为刺参“安源1号”亲权鉴定和种质资源保护提供技术支持。

附图说明

图1为使用本发明引物鉴别待检刺参群体的分型图(显示部分结果)。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1

1“安源1号”刺参特异性SNP标记获取

1.1样本选择

采集刺参新品种“安源1号”、山东烟台、山东牟平、山东长岛县、山东威海、辽宁大连、辽宁庄河7个有代表性的刺参养殖、野生群体共256只。

1.2提取DNA

采用SDS法进行基因组总DNA的提取。试剂盒选用TIANGEN amp Marine AnimalsDNA Kit(TIANGEN，中国北京市)，提取刺参的肌肉组织，以1％的琼脂糖凝胶电泳初步检测核酸的纯度和完整度，合格的DNA样品主带清晰，无降解或轻度降解。经检验合格的刺参DNA样品质量浓度调至约100ng/ul保存。

1.3基因组重测序

检测合格的样本采用BioruptorPico超声破碎仪随机打断成350bp的片段，然后利用基因组DNA文库构建试剂盒进行文库制备。按照以下步骤进行文库构建：

(1)通过BionuptorPico超声破碎仪将基因组DNA的打断；

(2)DNA片段末端补平:将基因组末端修复成平末端，并在5'末端加磷酸基团；

(3)DNA片段3’末端加'A'；

(4)DNA末端连接adaptor:通过TA连接将adaptor添加到DNA片段两端；

(5)PCR扩增:将添加完接头的连接产物进行PCR扩增形成可进行测序的文库。

构建完成的文库通过Qubit文库浓度定量、琼脂糖电泳检测文库大小特征和qPCR对文库的有效浓度进行准确定量3种方式进行文库质检，质检合格的文库进行浓度均一化，并在Illumina HiSeq2500测序平台上进行高通量测序。

1.4SNP获取与质控

在得到clean reads后，采用BWA软件将clean reads与参考基因组(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/002/754/855/GCA_002754855.1_ASM275485v1/)比对。使用软件GATK(v3.8)对样本进行群体SNP检测，并对获得的结果进行过滤，过滤标准为“--minQ 200--minDP 3--min-meanDP 3--max-missing 0.8--maf0.05”。

1.5关联分型

使用Plink软件进行基因组关联分析，

“安源1号”刺参和其他种群的刺参分为两个亚群。

采用Logistic模型进行关联分析，获得每个SNP对应的显著性P值，使用Bonferroni对获得的P进行校正，最终获得“安源1号”刺参显著关联SNP位点。

1.6KASP引物设计

根据上述“安源1号”显著SNP位点设计出42对PCR 3’末端特异性扩增引物，设计软件为Primer 5，每个序列需要3条引物，即两条特异的上游引物和一条通用的下游引物。引物设计原则为：(1)引物自身无发夹结构，上下游引物之间不会形成引物二聚体；(2)引物的GC含量在40～60％，Tm值在55～65℃之间。

2KASP标记验证

2.1验证群体DNA提取和标记检测

随机选“安源1号”刺参，其他群体刺参各15只，以SDS法提取DNA，在Douglas ArrayTapeRPlatform进行标记检测，在SOELLEX高通量PCR水浴环境中进行荧光定量PCR反应，试剂选用TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ,配制出20μl混合体系以“变性—退火延伸”的两步法反应程序进行特异性扩增。

2.2KASP标记分型

利用ARAYA荧光阅读仪读取到FAM和VIC两种荧光基团的信号，将结果导入数据库。

在Douglas Scientific Dashboard按照分型明确、NTC(无样品阴性对照)、无特异性扩增的原则进行样品SNP分型。利用SNP viewer基因型读取软件对分型结果进行分析，KASP标记在样本中读取到杂合基因型即为分型成功。在分型图中，X:X代表纯合型，包括A:A、T:T、C:C、G:G、-:-(缺失)五种类型，X:Y代表杂合型，包括A:G、C:T、A:-(部分缺失)三种类型，？代表无信号或信号较弱，Uncallable代表有信号但无明确分型。

从42个KASP标记中筛选出3个标记，筛选条件是在“安源1号”群体检出率达到100％，同时在其他群体中不出现，3个KASP标记所在的序列见表1。

2.3“安源1号”刺参鉴定标准与应用

判定标准为：采用SDS法提取刺参样品的DNA，以KASP组合标记进行待测样品SNP基因分型，检测“安源1号”刺参群体特有标记位点；判定标准为：检测个体具有全部3个上述引物标记位点，判定为“安源1号”刺参个体。群体样品大于等于30只，检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出，群体中阳性检出率达到80％及以上，判定“安源1号”刺参群体。

判定标准设置说明：基于前期调研显示，刺参池塘、底播养殖过程中极易出现非有意的个体、群体混杂现象，设置80％的阳性检出率作为“安源1号”群体判别指标较客观。

应用：

1.对已知种质的30只刺参(5只“安源1号”刺参，25只为不同地域普通刺参)进行鉴定，结果显示：5只“安源1号”刺参个体全部具有3个引物标记；25只不同地域普通刺参3个标记全部检出的为0，(具2个标记的4只，1个标记的8只)，判定为非“安源1号”刺参。检出准确率为100％。

2.检测4个群体(1个群体为购买“安源1号”刺参苗种的池塘养殖群体，32只；另4个群体为大连、山东随机抽取池塘采样群体，每个池塘30只，共120只)，SNPviewer检测结果显示(显示部分结果，见图1)：“安源1号”苗种养殖群体共32只，具3个标记的29只，“安源1号”群体阳性检出率为90.63％，判定为“安源1号”刺参群体。其他4个群体的中，3个标记全部检出的为0，(具2个标记的17只，1个标记的32只)，判定为非“安源1号”刺参群体。

序列表

<110> 大连海洋大学

<120> 用于鉴定“安源 1 号”刺参群体的引物组合及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttttcttcgt acttcgtaga ctgtga 26

<210> 2

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcttcgtact tcgtagactg tgg 23

<210> 3

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcaatgca ataaacaact ttccctcat 29

<210> 4

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggagccatcc attgatacta tgaag 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggagccatcc attgatacta tgaaa 25

<210> 6

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagagactac actgggtata cagtaataa 29

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccagggatga ctatcgctga g 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccagggatg actatcgctg aa 22

<210> 9

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttacacagtc agtccttcaa acaacacat 29

Claims

1.一种用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合，其特征在于，所述引物组合见下表

2.利用权利要求1所述引物组合来进行鉴定“安源1号”刺参群体的方法，其特征在于，所述方法具体如下：

采用SDS法提取刺参样品的DNA，以所述引物组合进行待测样品SNP基因分型，检测“安源1号”刺参群体特有标记位点；判定标准为：检测个体具有全部3个上述引物标记位点，判定为“安源1号”刺参个体；群体样品大于等于30只，检测个体在AX-294749位点为G/G、AX-741061位点为T/T和AX-762538位点为T/C则判定为阳性个体，群体中阳性检出率达到80％及以上，判定“安源1号”刺参群体。