CN114509569A - 一种检测白介素6的试剂盒、检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测白介素6的试剂盒及制备和应用。试剂盒包括：磁性微球包被的第一抗体和示踪标记物标记的第二抗体；第一抗体为近岸，目录号为DA011的12H6；或者为金斯瑞，目录号为P1810035的IL‑6‑55E9；或者为格瑞林，目录号为20180915的IL‑6‑01；第二抗体相应地为近岸，目录号为DA012的15H5；或者为金斯瑞，目录号为P1904008的IL‑6‑55C6；或者为格瑞林，目录号为20180919的IL‑6‑02。本发明操作简单、成本低、检测时间短，灵敏度高且线性范围较宽，可以实现全自动、快速、灵敏、定量检测样本的IL‑6的浓度。
Description
技术领域
本发明属于免疫医学检测领域，具体涉及一种检测白介素6的试剂盒、检测方法和应用。
背景技术
1985年Kishimoto等从人T细胞中首先获得白介素6(IL-6)的cDNA克隆。人IL-6基因位于第7号染色体，分子量为26kDa。IL-6在1986年统一命名为白细胞介素-6(Interleμkin-6，IL-6)，此前曾根据实验***和功能的不同，被命名为杂交瘤/浆细胞瘤生长因子(HPGF)、B细胞刺激因子-2(BSF-2)和肝细胞刺激因子(HSF)等。
白介素6(IL-6)是由纤维母细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核巨噬细胞、以及多种肿瘤细胞等产生的。白介素6(IL-6)是一种多效应的细胞因子，不仅能够诱导B细胞分化产生免疫球蛋白，促进T细胞的增殖生长，促进骨髓造血干细胞的增殖，增强血细胞的分化及其抗瘤效应等，而且还是炎性介质网络中的关键成分，在炎症反应中起到重要作用。
IL-6参与许多疾病的发生和发展，其血浆水平与炎症、病毒感染、自身免疫疾病密切相关，它的变化比CRP更早。目前认为IL-6是炎症、脓毒症的早期敏感性标志物及慢性炎症的量化标志物，能有效地指导抗生素的使用；并且还能有效评估脓毒血症以及脓毒血症性休克的预后情况。
目前，白介素6的免疫检测方法主要包括荧光免疫层析法(FICA)以及化学发光法(CLIA)。
荧光免疫层析法(FICA)是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。以双抗体夹心法为例，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。荧光免疫层析法(FICA)存在自动化程度低、检测通量较小的缺点。
化学发光法(CLIA)作为近年来逐渐兴起的一种免疫检测技术，是将免疫反应***和化学发光技术紧密结合的产物。其中化学发光技术是利用发光物质，如吖啶酯等，经氧化剂氧化和催化剂催化后，形成一个激发态的中间体，再利用相应的测量仪器测量该中间体在回到基态时产生的光量子产额的检测手段。而免疫反应***是将发光标记物质标记在抗原或抗体上，再通过形成抗原-抗体复合物进行检测。该技术具有特异性强、灵敏度高、精密度好、线性范围宽、高通量和易于实现自动化的优点。
化学发光根据其标记物的不同，分为直接化学发光免疫分析、酶促化学发光免疫分析法和电化学发光免疫分析法。
直接化学发光免疫分析是指用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，在氧化剂(H2O2)和NaOH的作用下，吖啶酯便可分解、发光，无需催化剂。强烈的直接发光在一秒内完成，为快速的闪烁发光，发光强度同待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。中国专利申请CN107817354A也为吖啶酯标记，磁悬液和吖啶酯标记物加液量为150μl，温育时间为15min，分析灵敏度为3.8pg/mL。
酶促化学发光法是辣根过氧化物酶***和碱性磷酸酶***，中国专利申请CN103048465A为辣根过氧化物酶***，反应温育时间长，需要60min；激发发光时间长，底物液A、B需要避光反应5min。中国专利申请CN104330551A为碱性磷酸酶***，最低检测限为1.3pg/mL，精密度为6％以内。中国专利申请CN108519487A为亲和素-生物素***，反应步骤多，反应时间长，需要约8～30min。
电化学发光法是三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物在三丙胺的作用下发生氧化还原反应后发出可见光。其激发过程复杂，时间长，每一个发光速度约为25秒。但是电化学发光法仪器成本高，技术也较为复杂，难度较大。
发明内容
针对现有技术中检测白介素6(IL-6)的化学发光试剂盒灵敏度低、线性范围窄等缺陷，本发明提供了一种化学发光检测白介素6的试剂盒、检测方法和应用。采用本发明的试剂盒检测IL-6，操作简单、成本低、检测时间短的同时，检测的灵敏度较高。此外，本发明试剂盒的线性范围较宽，可达到3～5000pg/ml；并且精密度较好，变异系数CV小于5％；临床符合率较好，临床样本相关性R值可达0.9962。
本发明人经过大量实验意外发现，基于直接化学发光法，采用抗原结合位点不同的、分别包被磁珠和示踪标记物标记的两种抗体，配合化学发光免疫分析仪使用，可以方便快速检测白介素6的同时，具备高灵敏度和较宽线性范围。进一步地，本发明人还筛选了检测过程中的检测条件，进一步提高了灵敏度和线性范围等。
为了解决上述技术问题，本发明的第一方面提供一种检测白介素6(IL-6)的试剂盒，所述试剂盒包括：磁性微球包被的第一抗体和示踪标记物标记的第二抗体；所述第一抗体和第二抗体为IL-6单克隆抗体，并识别不同的抗原表位。
较佳地，所述第一抗体为近岸(近岸蛋白质科技有限公司)，目录号为DA011的12H6单克隆抗体；所述第二抗体为近岸，目录号为DA012的15H5单克隆抗体。
较佳地，所述的第一抗体为金斯瑞(南京金斯瑞生物科技有限公司)，目录号为P1810035的IL-6-55E9单克隆抗体；所述第二抗体为金斯瑞，目录号为P1904008的IL-6-55C6单克隆抗体。
较佳地，所述的第一抗体为格瑞林(广州市格瑞林生物科技有限公司)，目录号为20180915的IL-6-01单克隆抗体；所述第二抗体为格瑞林，目录号为20180919的IL-6-02单克隆抗体。
本发明采用双抗体夹心法检测IL-6，使用两株不同的特异性单克隆抗体，其中被标记于示踪标记物的抗体的结合位点与包被于磁性微球上的抗体结合位点不同。选择这些结合位点不仅有利于示踪物的标记或磁性微球的包被，也不会阻碍抗体与抗原结合形成夹心复合物，因此，提高了反应的特异性和灵敏度。
并且利用双抗体夹心法形成的双试剂反应体系，相较于三试剂反应体系节约了成本以及反应时间，从而增加测试通量。
所述的磁性微球可为本领域常规；优选地，所述磁性微球为纳米级Fe2O3和Fe3O4的磁性微粒与高分子材料进行复合后，形成的具有顺磁性和极大蛋白吸附量的微米级固相微球，可以提高包被效率。
所述磁性微球可以在外加磁场的作用下迅速磁化，在磁场消失后剩磁为零。而其复合所用的高分子材料种类没有限制。
所述的磁性微球粒径可为1～5μm，并且，所述磁性微球可以通过表面改性而添加多个活性基团，包括但不限于-OH和-COOH。
所述磁性微球的粒径为1～5μm；优选为3μm。
所述磁性微球的浓度为0.1～1mg/ml；优选为0.1～0.5mg/ml；更优选为0.15～0.25mg/ml。
在本发明一较佳实施方案中，所述磁性微球的平均粒径为3μm，购于JSR公司，固含量10％左右。
所述磁性微球包被的第一抗体的制备包括：将磁性微球包被的第一抗体用浓度为200mg/mL的BSA溶液封闭的步骤。
在本发明一较佳实施方案中，所述磁性微球包被的第一抗体的制备还包括：在所述封闭前，将所述磁性微球与所述第一抗体在包被缓冲液中进行包被的步骤。
包被时，所述磁性微球与所述第一抗体的质量比为100:0.5～100:1.25；优选为100:0.75～100:1；更优选为100:1。
所述磁性微球与第一抗体的偶联时间为0.5h～2h；优选为0.5h。
所述包被时的偶联缓冲液为0.05～0.2M MES缓冲液，优选为0.1M MES缓冲液；所述MES缓冲液的pH为5.0～6.0；优选为5.2～5.8，更优选为5.4～5.6；例如为5.5。
所述第一抗体的工作浓度为0.1～10μg/ml；优选为0.1～5μg/ml；更优选为1.5～2.5μg/ml。
所述磁性微球包被的第一抗体使用发光恢复液进行保存、清洗和稀释。
在本发明一较佳实施方案中，所述发光恢复液的组成为：pH7.4的PBS、2％牛血清白蛋白和1～2‰的蔗糖；所述％和‰分别为质量百分比和质量千分比。
所述的示踪标记物可为本领域常规，优选为鲁米诺、草酸酯、吖啶酯或金刚烷，例如吖啶酯。
当示踪标记物为吖啶酯时，由于吖啶酯分子量小，可以进一步减小反应的空间位阻效应，有助于提高整体***的灵敏度。
所述示踪标记物与所述第二抗体的摩尔比可为本领域常规(可以是在本发明常规范围即可)，较佳地大于等于为15:1。
所述示踪标记物标记的第二抗体的制备包括：在标记缓冲液中用所述示踪标记物来标记所述第二抗体的步骤。
在本发明一较佳实施方案中，所述标记缓冲液为0.05～0.1M HEPES缓冲液，优选为0.05M HEPES缓冲液；所述HEPES缓冲液的pH为6.8～8.2；较佳地为7.4～8.2；更佳地为7.9～8.1；例如8.0。
所述标记的时间为1～2h；较佳地为1h。
所述第二抗体的工作浓度为0.1～2.5μg/ml；优选为0.75～1.25μg/ml。
所述示踪标记物的浓度为0.1～2.5μg/ml；优选为0.1～1.25μg/ml；更优选为0.375～0.625μg/ml。
在本发明一较佳实施方案中，所述的检测试剂盒还包括IL-6校准品、清洗液和与所述示踪标记物反应产生检测信号的化学发光底物液(即化学发光激发液)。
在本发明一较佳实施方案中，所述的IL-6校准品通过含有0.1％Proclin300、1％BSA的0.02M PBS溶液进行稀释；
所述的0.1％Proclin 300中的百分比为质量百分比，所述1％BSA的百分比为质量体积百分比。
在本发明一较佳实施方案中，所述的IL-6校准品中还添加防腐剂。所述的校准品可以在4℃条件下稳定保存。
所述的清洗液是含有表面活性剂的PBS缓冲液。
在本发明一较佳实施方案中，所述的清洗液还添加防腐剂。
所述的化学发光底物液包含双氧水和硝酸溶液。
在本发明一较佳实施方案中，所述的化学发光底物液(即化学发光激发液)包括底物液A(即化学发光预激发液A)和底物液B(即化学发光预激发液B)；所述的底物液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2的质量分数为0.01～5.0％，HNO3的浓度为0.01～1.0mol/L；所述的底物液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01～2.0％，NaOH的浓度为0.05～1mol/L。
所述的防腐剂可为本领域常规，优选为山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、proclin-300(主要活性成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3酮，是一种较安全的防腐剂，为免疫诊断中较常用的防腐剂之一)和抗生素中的一种或两种。
所述的表面活性剂可为本领域常规，优选为Triton X-100、Triton X-405、Tween20和Tween 80的一种或两种。所述表面活性的添加量为0.1-2‰，这样，更有利于磁性微球的分散。
在本发明一较佳实施方案中，所述清洗液为pH7.0～9.0、浓度0.02mol/L的PBST溶液，其中Tween-20的质量分数为0.5％。
为了解决上述技术问题，本发明的第二方面提供一种上述试剂盒检测IL-6的方法，包括以下步骤：
(1)将工作浓度的磁性微球包被的第一抗体、示踪标记物标记的第二抗体和待测样本混匀后温育；
(2)将(1)中温育好的混合物置于磁性条件下，清洗后加入化学发光底物液，检测光子值。
优选地，所述(1)中工作浓度的磁性微球包被的第一抗体、示踪标记物标记的第二抗体和待测样本的体积相同；
优选地，所述温育为在37℃温育；温育时间为6min。
优选地，所述(2)中的清洗为使用清洗液清洗。
所述待测样本的来源可为直接获得的血清、血浆和全血。
采用本发明的检测IL-6的方法，可以实现全自动、快速、高灵敏度、定量检测样本的IL-6的浓度，有利于早期监测机体的免疫状态、炎症反应等，可有效地指导抗生素的使用；并且还能作为有效评估脓毒血症以及脓毒血症性休克的预后情况的参考。同时，本领域技术人员应当知晓的是，该方法也可用于非诊断目的，例如实验室检测动物血样本，以便后续的生理生化分析等操作。
为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的试剂盒在检测IL-6中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)采用本发明的试剂盒检测IL-6，操作简单、成本低、检测时间短的同时，所述试剂盒的灵敏度较高。在某一较佳实施例中，使用本发明的试剂盒检测IL-6的灵敏度可达1.29pg/ml，远高于现有技术中的3.8pg/ml。在某一较佳实施例中，使用本发明的试剂盒的试剂加液量只需50μl，温育时间为6min，全程仅在10分钟内即可完成检测。
(2)本发明的试剂盒线性范围较宽，可达到3～5000pg/ml(而现有技术中线性范围不超过1000pg/ml)；并且精密度较好，变异系数CV小于5％；准确度较好，回收率可达101.16％；临床符合率较好，临床样本相关性R值可达0.9962。
附图说明
图1为实施例中检测原理的示意图。
图2为实施例9线性相关性图。
图3为实施例9样本符合率图。
图4为实施例9钩状效应图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中检测原理的示意图见图1。
实施例1
制备1：包被第一抗体的磁性微球悬浮液
(1)量取10mg磁性微球(平均粒径3μm，JSR公司，固含量10％)，并混悬于1mL 0.1MpH5.5的MES缓冲液中，磁铁吸附5～10min进行清洗，弃去上清后，重复前述清洗步骤3次，加入1mL 0.1M MES，涡旋混匀。
(2)加入100μg第一抗体(近岸，Lot：DA011)，使磁性微球:抗体的质量比为100:1，涡旋混匀后37℃包被孵育30min。
(3)加入10μL 10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐(EDC)，涡旋混匀，37℃孵育1.5h。
(5)向包被的抗体溶液中加入200μL 200mg/mL BSA溶液，室温旋转混匀过夜(不少于16h)进行第二阶段的封闭，用磁铁或磁力架吸附磁性微球，弃去上清；
(6)向封闭后的磁性微球-抗体混悬液中添加1mL发光恢复液，磁铁吸附进行清洗，去上清后，重复上述清洗步骤3次，完成包被第一抗体的磁性微球悬浮液的制备。
所述的发光恢复液的组成为：pH7.4 PBS、2％牛血清白蛋白和1-2‰的蔗糖；所述％和‰分别为质量百分比和质量千分比。
(7)将上述制备好的磁性微球-抗体混悬液置于1mL的发光恢复液中，2～8℃保存。
制备2：吖啶酯标记的第二抗体溶液的制备
(1)将1mg第二抗体(近岸，Lot：DA012)置于超滤离心管中，使用不少于1mL的0.05MHEPES缓冲液(pH 8.0)7500g离心透析15min，重复2次，使抗体浓度大于5mg/mL。
(2)向经过透析的第二抗体中加入100μL 5mg/mL NSP-SA-NHS的DMF溶液，使NSP-SA-NHS与第二抗体的摩尔比不小于15:1，混匀后，4℃(避光)反应1h～2h进行标记。
(3)加入100μL 100mg/mL的赖氨酸溶液，反应30min，终止反应。然后加入不少于2mL的PBS缓冲液(10M，pH7.4)7500g超滤20min，中间换液3次，以分离游离的NSP-SA-NHS，完成吖啶酯标记的第二抗体溶液的制备。
(4)收集分离后的标记物，加入5％BSA溶液使BSA的质量终浓度为1％，然后等体积加入甘油，-20℃保存。
制备3：校准品的制备
取IL-6工作液(中科安体，LOT：AY10001-Ag)，使用抗原稀释液稀释至50pg/mL和250pg/mL，制备高低点标准品溶液。
所述的抗原稀释液为含1％牛血清白蛋白的0.02M PBS溶液。
制备4：化学发光底物液的配制
底物液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2质量分数为0.01～5.0％，HNO3浓度为0.01～1.0mol/L。
底物液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01～2.0％，NaOH的浓度为0.05～1mol/L。
制备5：清洗液的配制
所述清洗液为pH7.0～9.0、浓度0.02mol/L的PBST溶液，其中Tween-20的质量分数为0.5％。
实施例2
使用实施例1中制备的各组分组成的试剂盒与自制的全自动化学发光分析仪配套使用，检测待测样本中的IL-6浓度。
具体步骤如下：
1.将实施例1中制备1得到的包被第一抗体的磁性微球悬浮液按磁性微球的工作浓度用发光恢复液稀释第一抗体的浓度到2.5μg/mL(试剂1)，将实施例1中制备2得到的吖啶酯标记的第二抗体的浓度用1％BSA溶液稀释到1.25μg/mL(试剂2)；
2.向反应杯中依次加入50μL的试剂1和50μL的试剂2；
3.向反应杯中加入50μL的待测样本或50μL的校准品，整个加样过程需要0.5分钟；
4.将反应杯中的溶液充分混匀后，37℃温育6分钟；
5.将温育后的反应杯置于磁性条件下，使用清洗液清洗3次，整个过程需要2分钟；
6.向反应杯中加入100μL的化学发光底物液，并检测光子值；
7.根据反应杯中检测到的光强度，仪器自动计算待测样本中IL-6的浓度，整个检验、计算过程需要1分钟。
整个过程耗时约9分钟。
实施例3第一抗体和第二抗体的配对组合筛选
(1)抗体配对组合(配组)筛选
候选IL-6单克隆抗体共有8种：
抗体1：IL-6-2F7(重庆探生，Lot：20190521)；
抗体2：IL-6-7E5(重庆探生，Lot：20190520)；
抗体3：15H5(近岸，Lot：DA012)；
抗体4：12H6(近岸，Lot：DA011)；
抗体5：IL-6-55C6(金斯瑞，Lot:P1904008)；
抗体6：IL-6-55E9(金斯瑞,Lot:P1810035)；
抗体7：IL-6-01(格瑞林，Lot:20180915)
抗体8：IL-6-02(格瑞林，Lot:20180919)
将抗体1、2、3、4、5、6、7、8分别包被磁性微球，形成抗体1-磁性微球、抗体2-磁性微球、抗体3-磁性微球、抗体4-磁性微球，抗体5-磁性微球，抗体6-磁性微球，抗体7-磁性微球，抗体8-磁性微球；同时将抗体1、2、3、4、5、6、7、8标记吖啶酯，形成抗体1-吖啶酯、抗体2-吖啶酯、抗体3-吖啶酯、抗体4-吖啶酯、抗体5-吖啶酯、抗体6-吖啶酯、抗体7-吖啶酯、抗体8-吖啶酯。将以上抗体进行组合配对，使用实施例1和2中的实验步骤检测来源于医院收集的不同病人的血清样本，从中筛选最优组合，相对发光值(RLU)结果如表1-1、表1-2、表1-3、表1-4和表1-5所示。
表1-1抗体配对组合筛选结果
表1-2抗体配对组合筛选结果
表1-3抗体配对组合筛选结果
表1-4抗体配对组合筛选结果
表1-5抗体配对组合筛选结果
如表所示，组合1、组合2、组合3、组合13、组合36中，抗体1、抗体2、抗体3、抗体5、抗体8与抗体2、抗体1、抗体4、抗体6、抗体7的配对，检测白介素6整体信号值偏低，区分度较低；其它组合的抗体配对整体无明显反应。组合4、组合20以及组合29中，抗体4与抗体3的配对、抗体6与抗体5的配对以及抗体7与抗体8的配对各项指标结果较好(信号值较高，且区分度高)，进一步检测样本符合率，检测结果如表2和表3所示。
表2血清样本符合率检测结果
表3血同源样本符合率检测结果
参照表2和表3的结果，抗体4和抗体3组合的样本符合率以及同源样本检测符合率都较其他组合要好。
实施例4抗原稀释液筛选
对稀释校准品工作液的抗原稀释液，选用含含有0.1％Proclin 300的1％酪蛋白、1％BSA的0.02M PBS溶液以及新生牛血清作为抗原稀释液进行筛选。
表4抗原稀释液热加速稳定性结果
结果如表4所示，使用新生牛血清稀释抗原，37℃加速7天后，稳定性下降超过70％；使用1％酪蛋白稀释抗原，加速7天后，稳定性下降超过15％；而抗原经过1％BSA稀释后，与4℃保存相比，稳定性下降在10％以内。因此，选择含有0.1％Proclin 300的1％BSA作为校准品稀释液，以提高校准品的稳定性。
实施例5磁性微球包被抗体工艺优化
磁性微球-抗体的偶联缓冲液优化筛选结果如表5所示。
表5磁性微球包被抗体偶联缓冲液优化
综合比较各组数据，选择0.1M pH5.5 MES缓冲液作为偶联缓冲液。
针对磁性微球-抗体的使用比例进行优化，结果如表6所示。
表6磁性微球-抗体使用比例筛选结果
| 磁性微球:抗体 | pg/ml | 100:0.5 | 100:0.75 | 100:1 | 100:1.25 |
| S0 | 0 | 54 | 82 | 159 | 134 |
| S1 | 140 | 5966 | 7566 | 14077 | 13366 |
| S2 | 1400 | 25991 | 34691 | 55894 | 54591 |
| S3 | 2500 | 54967 | 72466 | 109169 | 108067 |
| S4 | 3500 | 84419 | 106112 | 168274 | 161512 |
| S5 | 5000 | 121080 | 161880 | 232603 | 233880 |
| 符合率 | 0.9956 | 0.9953 | 0.9964 | 0.9967 |
由上表可知，抗体加入量增加，抗原检测信号值也随之增加，并对抗原符合率没有明显影响；当磁性微球:抗体的质量比达到100:1.25时，整体的发光值没有明显上升，因此，选择100:1作为优选的磁性微球-抗体的加入比例。
针对封闭的封闭液进行筛选的结果如表7所示。
表7封闭液筛选
从表7可知，这三种封闭液对于检测校准品的发光值以及符合率差距不是特别大，用三种不同的封闭液封闭成的三种磁性微球与吖啶酯一起检测样本，检测其符合率，结果如表8所示。
表8不同封闭液检测样本
如表8所示，由20％BSA封闭液所做的磁性微球与吖啶酯所检测的样本符合率最好，为0.9674，并且检测过程样本也未出现检测异常，而由1M Gly与5％BSA封闭液所做的磁性微球与吖啶酯所检测的样本符合率较差，并且有些样本出现了检测异常，发光值过高的现象，所以还是选择20％BSA作为封闭液。
实施例6吖啶酯标记抗体的工艺优化
针对吖啶酯标记的偶联缓冲液进行优化，结果如表9所示。
表9吖啶酯标记抗体的偶联缓冲液优化
由表9可知，三种偶联缓冲液对抗原稀释液检测符合率无明显影响，HEPES样本检测信号值整体较高，且低值区分范围较大，优选HEPES作为吖啶酯标记抗体偶联缓冲液。
针对吖啶酯标记的偶联时间进行优化，结果如表10所示。
表10吖啶酯标记抗体偶联时间优化
由表10可知，抗体与吖啶酯偶联1h，反应达到平台期。
针对吖啶酯:抗体的使用比例进行筛选，结果如表11所示。
表11吖啶酯:抗体使用比例筛选
| 吖啶酯:抗体 | 40:1 | 30:1 | 20:1 | 15:1 |
| S0 | 54 | 82 | 114 | 124 |
| S1 | 6053 | 7566 | 11349 | 13862 |
| S2 | 26073 | 32591 | 48886.5 | 56405 |
| S3 | 51973 | 62466 | 87699 | 102192 |
| S4 | 67290 | 84112 | 126168 | 149190 |
| S5 | 99104 | 123880 | 185820 | 201596 |
| 符合率 | 0.9982 | 0.9987 | 0.9982 | 0.9986 |
根据上表实验数据，吖啶酯:抗体应不得低于15:1。
实施例7抗体工作浓度筛选
针对第一抗体和第二抗体的工作浓度进行筛选，结果如表12-1和表12-2所示。
表12-1抗体工作浓度筛选结果
表12-2抗体工作浓度筛选结果
如表12-1和表12-2所示，第一抗体工作浓度为2.5μg/ml，第二抗体工作浓度为1.25μg/ml时，符合率最好，并且信噪比和区分度也较好。
实施例8稳定性研究
将实施例2试剂盒组分中的试剂1、试剂2以及校准品放入35～37℃烘箱中7天，测试7天加速稳定性与4℃试剂的相对偏差，结果如表13所示。
表13稳定性测试结果
如表13所示，试剂盒所有组分在35～37℃中加速7天后的信号值与4℃放置的试剂相对偏差在±15％以内，试剂盒的稳定性表现很好。
实施例9性能测试
对实施例1制得的试剂盒进行性能测试。
(1)空白限的检测
其检测方法参考国家食品药品监督管理总局发布的YY/T 1233-2014《心肌肌钙蛋白-I定量测定试剂(盒)(化学发光免疫分析法)》的试验方法进行。
重复检测空白样本(样本稀释液)20次，再根据检测结果，利用公式计算空白限，结果见表14-1和14-2。
表14-1初始校准曲线的检测结果
| RLU | 浓度 | |
| S0 | 134 | 0 |
| S1 | 10765 | 201.73 |
| S2 | 48366 | 1136.24 |
| S3 | 78759 | 2012.54 |
| S4 | 123552 | 3542.56 |
| S5 | 200125 | 6046.88 |
表14-2空白限的检测结果
根据零浓度校准品(S0)和相邻的校准品(S1)之间的浓度-化学发光(RLU)值的结果进行两点回归拟合得出一次方程，再将20孔空白样本(S0)检测获得的Mean+2SD所对应的RLU值代入上述方程，所获得的浓度值，即为分析灵敏度，试剂盒的空白限可达到1.29pg/mL，这对于炎症的早期诊断具有极大的意义。
(2)天内精密度的检测
重复检测高、低点校准品各10次，再根据检测结果，计算CV，结果见表14-3。
表14-3天内精密度的检测结果
| 测试次数 | QCL信号 | QCH信号 | QCL浓度 | QCH浓度 |
| 1 | 3448 | 16127 | 55.04629839 | 340.2847376 |
| 2 | 3211 | 15772 | 50.60691106 | 321.4575927 |
| 3 | 3129 | 14604 | 49.08445104 | 302.6717449 |
| 4 | 2864 | 13842 | 49.21433522 | 304.1131516 |
| 5 | 3081 | 15011 | 48.19658441 | 302.6568423 |
| 6 | 3114 | 15259 | 48.80672636 | 310.7652572 |
| 7 | 3203 | 13731 | 50.45806583 | 291.4248799 |
| 8 | 2984 | 13907 | 46.4100102 | 295.6891772 |
| 9 | 3050 | 13445 | 47.6244958 | 294.5164954 |
| 10 | 3061 | 14476 | 47.82737521 | 299.5417885 |
| MEAN | 49.32752535 | 306.3121667 | ||
| CV | 4.82％ | 4.81％ |
试剂盒的天内精密度可达到4.82％和4.81％，这对于炎症的诊断准确性具有极大的意义。
(3)线性相关性的检测
复孔检测线性样本，并计算各点的理论值和实测值的线性相关系数，结果见表14-4及图2。
表14-4线性相关性的检测结果
试剂盒的线性相关性R>0.990。复孔检测线性样本(7点)，并计算各点的理论值和实测值的线性相关系数。其中，理论浓度未利用校准曲线计算所得的浓度，而实测值为利用比对机器罗氏检测后的样本值。图2表明线性相关性良好。
(4)准确度的检测
其检测方法参考国家食品药品监督管理总局发布的YY/T 1233-2014《心肌肌钙蛋白-I定量测定试剂(盒)(化学发光免疫分析法)》的试验方法进行，血清添加比例按照1:9稀释后检测。
采取回收试验检测试剂盒的准确度，检测结果见表14-5。
表14-5回收试验的检测结果
回收试验结果可达到101.16％，准确度良好。
对试剂盒的钩状效应进行检测，结果如表14-6和图4所示。
表14-6钩状效应
使用实施例1的试剂盒检测高浓度抗原样本，当样本浓度达到200ng/ml时，开始出现钩状效应，但检测值仍大于5,000pg/ml，超过检测上限，因此，说明本试剂盒检测样本可忽略钩状效应的影响。
(6)方法学比对
使用罗氏诊断(Roche Diagnostics)生产检测白介素6试剂盒(电化学发光法)检测部分血清或血浆样本后，使用本发明的试剂盒检测上述样本，检测结果如图3所示。使用本发明的试剂盒检测101例罗氏样本，将罗氏试剂盒检测的的浓度值(pg/ml)与本发明试剂盒的检测信号值做散点图，发现符合率较好，整体符合率R值可达0.9962。可见，本发明的试剂盒与国内外公认的罗氏白介素6试剂盒有较好的相关性，能较为准确地从健康人群中筛查出患病个体。
Claims (10)
1.一种化学发光检测IL-6的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：磁性微球包被的第一抗体和示踪标记物标记的第二抗体；
所述的第一抗体为近岸，目录号为DA011的12H6单克隆抗体；所述第二抗体为近岸，目录号为DA012的15H5单克隆抗体；或者，
所述的第一抗体为金斯瑞，目录号为P1810035的IL-6-55E9单克隆抗体；所述第二抗体为金斯瑞，目录号为P1904008的IL-6-55C6单克隆抗体；或者，
所述的第一抗体为格瑞林，目录号为20180915的IL-6-01单克隆抗体；所述第二抗体为格瑞林，目录号为20180919的IL-6-02单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球包被所述第一抗体时，使用的偶联缓冲液为MES缓冲液，其浓度优选为0.05～0.2M；例如为0.1M；其pH优选为5.0～6.0，更优选为5.2～5.8，最优选为5.4～5.6，例如为5.5；
和/或，所述磁性微球包被所述第一抗体时，所述磁性微球与所述第一抗体的质量比为100:0.5～100:1.25；优选为100:0.75～100:1；
和/或，所述磁性微球包被所述第一抗体时，所述磁性微球与第一抗体的偶联时间为0.5h～2h；优选为0.5h；
和/或，所述磁性微球包被所述第一抗体时，在所述包被后还包括将所述磁性微球包被的第一抗体封闭的步骤；所述封闭时使用的封闭液优选为20％BSA溶液；所述％为质量体积百分比。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述示踪标记物为鲁米诺、吖啶酯或金刚烷；某一较佳实施例中为吖啶酯；
和/或，所述示踪标记物标记所述第二抗体时，使用的标记缓冲液为HEPES缓冲液，其浓度为0.05～0.1M；优选为0.05M；其pH优选为6.8～8.2，更优选为7.4～8.2，最优选为7.9～8.1，例如8.0；
和/或，所述示踪标记物标记所述第二抗体时，所述示踪标记物与所述第二抗体的摩尔比为≥15:1；
和/或，所述示踪标记物标记所述第二抗体时，所述标记的时间为1～2h。
4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体的工作浓度为0.1～10μg/ml；优选为0.1～5μg/ml；更优选为1.5～2.5μg/ml；
和/或，所述磁性微球的粒径为1～5μm；优选为3μm；
和/或，所述磁性微球的浓度为0.1～1mg/ml；优选为0.1～0.5mg/ml；更优选为0.15～0.25mg/ml；
和/或，所述第二抗体的工作浓度为0.1～2.5μg/ml；优选为0.75～1.25μg/ml；
和/或，所述示踪标记物的浓度为0.1-2.5μg/ml；优选为0.1～1.25μg/ml；更优选为0.375～0.625μg/ml。
5.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球包被的第一抗体使用发光恢复液进行保存、清洗和稀释；
较佳地，所述发光恢复液的组成为：pH7.4的PBS、2％牛血清白蛋白和1～2‰的蔗糖；所述％和‰分别为质量百分比和质量千分比。
6.如权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括白介素6校准品、清洗液和与所述示踪标记物反应产生检测信号的化学发光底物液；
较佳地，所述的化学发光底物液包括底物液A和底物液B；所述的底物液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2的质量分数为0.01～5.0％，HNO3的浓度为0.01～1.0mol/L；所述的底物液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01～2.0％，NaOH的浓度为0.05～1mol/L。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述白介素6校准品包含校准品缓冲液；和/或，所述清洗液包含防腐剂和含有表面活性剂的缓冲液；
较佳地，所述清洗液为pH 7.0～9.0、0.02M并包含质量分数为0.5％的Tween-20的PBST溶液；
更佳地，所述表面活性剂的添加量为所述清洗液总体积的0.1-2‰，所述‰为质量千分比。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述白介素6校准品通过含有0.1％Proclin 300、1％BSA的0.02M PBS溶液进行稀释；
所述的0.1％Proclin 300中的百分比为质量百分比，所述1％BSA的百分比为质量体积百分比。
9.一种检测IL-6的方法，其特征在于，使用如权利要求1～8任一项所述的试剂盒进行检测；
较佳地，所述的方法包括以下步骤：
(1)将工作浓度的磁性微球包被的第一抗体、示踪标记物标记的第二抗体和待测样本混匀后温育；
(2)将(1)中温育好的混合物置于磁性条件下，清洗后加入化学发光底物液，检测光子值；
更佳地，所述(1)中工作浓度的磁性微球包被的第一抗体、示踪标记物标记的第二抗体和待测样本的体积相同；
所述温育为在37℃温育；
所述(2)中的清洗为使用清洗液清洗。
10.一种如权利要求1～8任一项所述的试剂盒在检测IL-6中的应用。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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