CN114507326B - 一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物及其制备和应用 - Google Patents

一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物及其制备和应用。本发明所述聚合物为聚甲基丙烯酸‑2‑苯氧乙酯‑b‑聚甲基丙烯酸‑2‑氧代丙酯‑b‑聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯，该聚合物的亲水侧链易于调控，能够自组装形成稳定性不同的胶束。所述聚合物的pH响应交联胶束，可以有效负载水难溶性药物。本发明的胶束通过亲水侧链调控和交联策略增强胶束在生理环境下的稳定性，且有较好的pH响应性能，在肿瘤微环境中能快速释放药物，提高药物递送效率。

Description

一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物及其 制备和应用
技术领域
本发明属于生物高分子聚合物材料技术领域，具体涉及一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物及其制备和应用。
背景技术
近年来，癌症对人类健康的危害得到越来越多的关注。在众多癌症治疗策略中，化学治疗是一种主流的治疗手段。然而，传统的化疗药物存在水溶性差、毒副作用强等缺点。使用药物载体材料来递送药物可有效弥补这些缺陷。在目前开发的载药材料中，聚合物胶束因其卓越的生物相容性、化学易修饰等特点被广泛用于水难溶性药物的包载和递送。
聚合物胶束是两亲性嵌段聚合物在水性介质中自组装形成的动态平衡聚集体。在体内的药物递送过程中，胶束常因吸附血液中的蛋白质、脂质等物质而失稳，最终导致结构的瓦解。同时，吸附在胶束表面的蛋白等外源物质可能会通过桥接作用，促使胶束聚集沉降。此外，血液循环中具有大量流体，通过稀释作用将胶束浓度降至临界胶束浓度(CMC)以下，使胶束失稳解体，从而严重影响药物递送效果。针对以上问题，主要通过提高结构稳定性和胶体稳定性两方面来实现。采用化学共价键交联是提高胶束结构稳定性的有效策略之一。Zhang等制备了一种基于四臂星型聚合物的壳层可逆交联胶束，在壳层形成带有可逆腙键和二硫键的交联结构，1000倍去离子水稀释后，交联胶束仍保持完整的结构，具有良好的抗稀释能力和稳定性。而对胶体稳定性而言，改变表面胶束亲水嵌段的性质(如调控其长度、接枝密度和化学结构等)可以增强其胶体稳定性(Polymer 2017,114,161-172)。Shoichet等研究了亲水聚乙二醇(PEG)的接枝密度对纳米粒子稳定性的影响，随着PEG接枝密度的增加，纳米粒子在生理环境下的稳定性得到增强(Chem.Mater.2014,26,2847-2855)。
聚合物胶束在药物递送过程中，除了要保持较高的生理环境稳定性，还要在肿瘤部位实现准确、快速的药物释放。选择在肿瘤微环境下响应断裂的可逆交联键结构，可以实现上述二者的结合，最大程度发挥药物递送的效果。专利CN111978553B公布了一种三重刺激响应性界面交联聚合物胶束，在还原性条件二硫交联键断裂，有效提高了药物释放量。然而，针对聚合物结构对稳定性的调控，以及稳定性和药物快速释放的结合尚没有深入***的研究。
综上，如何实现上述胶束稳定性和药物控制释放等需求是目前需要解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术中聚合物结构复杂、稳定性难以调控、受控释放性能欠佳等不足，本发明的首要目的在于提供一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物。
本发明聚合物的结构为：聚甲基丙烯酸-2-苯氧乙酯-b-聚甲基丙烯酸-2-氧代丙酯-b-聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA)。
本发明所述聚合物制备工艺简便，可以精准快捷地调控两亲性嵌段聚合物的亲水侧链长度，进而增强聚合物形成的胶束的稳定性和药物递送性能。
本发明的另一目的在于提供上述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物的制备方法。该方法首先用氯铬酸吡啶将甲基丙烯酸-2-羟丙酯(HPMA)氧化为酮基官能化单体甲基丙烯酸-2-氧代丙酯(OPMA)；然后采用电子转移活化再生原子转移自由基聚合(ARGET ATRP)法，利用小分子引发剂将疏水性单体甲基丙烯酸-2-苯氧乙酯(POEMA)、酮基官能化单体甲基丙烯酸-2-氧代丙酯(OPMA)、亲水性单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA)依次聚合，最终得到三嵌段聚合物PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA。其中，通过加入不同相对分子量的等摩尔量PEGMA，可调控得到亲水侧链不同的三嵌段聚合物。
本发明的再一目的在于提供上述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物在负载水难溶性药物中的应用，特别是水难溶性抗癌药物(如阿霉素)的负载。本发明的三嵌段聚合物溶于溶剂后透析，可得到核层为疏水嵌段、中间层含有可用于可逆共价键交联的酮基、壳层为亲水嵌段的聚合物胶束，在pH 6.5的环境和催化剂2-氨基-5-甲氧基苯甲酸作用下，与交联剂己二酸二酰肼中的酰肼键反应，生成在酸性条件下可逆断键的酰腙键交联结构。在正常生理环境下，阿霉素通过与胶束核层的苯环的π-π堆积作用稳定负载在胶束内核中，同时由于交联结构和长亲水侧链的作用进一步增强了负载的稳定性。当胶束处于肿瘤酸性微环境下，胶束中间层的酰腙交联键断裂，导致胶束结构瓦解，阿霉素从胶束内核释放出来。同时阿霉素的氨基在酸性下质子化提高了药物的水溶性，进一步加快药物的释放。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物，其结构式如下所示：
Figure BDA0003472577830000031
其中，x＝15～35，y＝5～20，z＝15～35，亲水嵌段单体PEGMA的侧链乙二醇基团的结构单元数n为5～20。
本发明的基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物命名为PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA。
所述基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物的数均分子量为8499～43503g/mol。
上述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备酮基官能团化单体(OPMA)：将氯铬酸吡啶(PCC)和硅胶粉溶于溶剂中，冰浴条件下加入甲基丙烯酸-2-羟丙酯(HPMA)，转至室温继续反应，得到酮基官能化单体甲基丙烯酸-2-氧代丙酯(OPMA)；
(2)制备两亲性三嵌段聚合物(PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA)：将催化剂、单体甲基丙烯酸-2-苯氧乙酯(POEMA)、配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)溶于溶剂中，充分搅拌后加入还原剂，搅拌均匀，加入小分子引发剂并加热反应，待单体转化完全后加入步骤(1)制备的酮基官能化单体甲基丙烯酸-2-氧代丙酯(OPMA)继续反应，待单体转化完全后，再加入单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA)继续反应，得到两亲性三嵌段聚合物(PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA)。
优选地，步骤(1)所述甲基丙烯酸-2-羟丙酯和氯铬酸吡啶的摩尔比为1：1.2～2。
优选地，步骤(1)所述硅胶粉是为了利于分散反应物，提高反应产率，其用量与PCC质量相同。
优选地，步骤(1)所述溶剂为二氯甲烷；所述氯铬酸吡啶与溶剂的摩尔体积比为0.3～0.5mmol/mL。
优选地，步骤(1)所述室温继续反应的时间为12～18h。
优选地，步骤(2)所述催化剂为溴化铜(CuBr2)和氯化铜中的至少一种；所述还原剂为辛酸亚锡(Sn(Oct)2)和抗坏血酸中的至少一种；所述小分子引发剂为溴代异丁酸乙酯(EBriB)。
优选地，步骤(2)所述催化剂、甲基丙烯酸-2-苯氧乙酯、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、还原剂、小分子引发剂、甲基丙烯酸-2-氧代丙酯和甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯的摩尔比为0.04～0.06：15～35：0.4～0.6：0.4～0.6：1：5～20：15～35。
优选地，步骤(2)所述溶剂为苯甲醚和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的至少一种；所述单体甲基丙烯酸-2-苯氧乙酯和溶剂的摩尔体积比为0.52～2.09mmol/mL。
优选地，步骤(2)所述单体甲基丙烯酸-2-苯氧乙酯加热反应的温度为40～50℃，时间为4～10h；甲基丙烯酸-2-氧代丙酯反应的温度为40～50℃，时间为12～18h；所述甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯反应的温度为60～70℃，时间为36～72h。
优选地，步骤(1)所述反应完成后，将反应产物体系纯化、浓缩，得到纯化后的产物。所述的纯化指先把反应液加入硅藻土中减压抽滤，旋蒸浓缩滤液，得到粗产物，再通过硅胶柱层析洗脱出产物，最终将洗脱液旋蒸浓缩得到纯化后产物。
优选地，步骤(2)所述单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯反应完成后，将反应产物体系冷却、纯化、干燥，得到纯化后的产物。所述纯化指冷却后往反应产物体系中加入四氢呋喃(THF)终止反应，然后过中性氧化铝层析柱除去催化剂，旋蒸浓缩后滴加至10倍冰正己烷沉淀，旋蒸-沉淀重复三遍，真空干燥后得到纯化后产物。
优选地，步骤(1)～(2)所述反应均在惰性气体保护和无水条件下进行。
一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物在负载水难溶性药物中的应用。
优选地，所述应用为：将上述基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物和水难溶性药物溶于溶剂中，混合均匀后，在磷酸缓冲盐溶液中透析，再加入催化剂和交联剂，室温搅拌反应，用去离子水透析，得到负载水难溶性药物的pH响应交联胶束体系。
更优选地，所述溶剂为二甲基亚砜(DMSO)；所述基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物与溶剂的质量体积比为1～5mg/mL。
更优选地，所述基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物和水难溶性药物的质量比为2～10：1。
更优选地，所述水难溶性药物为水难溶性抗癌药物，如脱酸的阿霉素(DOX)和紫杉醇；所述水难溶性药物指在1L水中溶解度小于或等于1g的药物。
更优选地，所述混合均匀的时间为3～5h。
更优选地，所述催化剂为2-氨基-5-甲氧基苯甲酸；所述交联剂为己二酸二酰肼(ADH)；所述基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物和交联剂的摩尔比为2：1；所述催化剂在磷酸缓冲盐溶液中透析后所得的胶束溶液中的浓度为8～12mmol/L。
更优选地，所述室温搅拌反应的时间为20～30h。
更优选地，所述磷酸缓冲盐溶液的pH＝6.5；所述在磷酸缓冲盐溶液中透析的时间为18～30h，每隔2～6h更换透析液一次。
更优选地，所述经去离子水透析的时间为10～24h，每隔2h更换透析液一次。
所述负载水难溶性药物的pH响应交联胶束体系中负载的药物在正常生理环境(pH7.4)释放缓慢，在肿瘤酸性微环境(pH 5.0)中pH响应交联键断裂，促进药物快速释放。
本发明的机理为：
本发明利用氧化剂氯铬酸吡啶(PCC)将甲基丙烯酸-2-羟丙酯(HPMA)氧化为酮基官能化单体甲基丙烯酸-2-氧代丙酯(OPMA)，进而通过ARGET ATRP法，依次聚合甲基丙烯酸-2-苯氧乙酯(POEMA)、OPMA和甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA)得到三嵌段聚合物，将其溶于溶剂后透析，经过室温交联反应，即得到疏水性PPOEMA为内核、具有酰腙键交联结构的POPMA为中间层、亲水层PPEGMA为外壳的交联聚合物胶束。POEMA带有苯环，可通过π-π堆积作用高效负载疏水抗癌药物阿霉素(DOX)，OPMA中的酮基可在室温温和条件下形成pH响应的酰腙键交联结构，PEGMA亲水性和生物相容性良好，具有优异的抗蛋白吸附性能，能够较好地稳定胶束结构，且通过ARGET ATRP中加入的PEGMA结构单元不同可精确调控胶束亲水侧链的长度，进而增强聚合物胶束的稳定性。广谱抗癌药DOX负载于胶束内核，在pH7.4(正常生理环境)能被胶束稳定包载，当聚合物胶束被递送至肿瘤细胞内的微环境(pH5.0)后，酸敏的酰腙键断键导致胶束结构瓦解，实现药物快速释放和精准递送的目标。
本发明提供的一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物及其胶束，通过调控亲水侧链和交联策略相结合，同时增强胶束的胶体和结构稳定性，并在肿瘤酸性微环境下实现pH响应断键，促进药物的快速释放，是一种具有应用潜力的药物递送材料。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明制备工艺流程简单、条件温和，可精确调控三嵌段聚合物的嵌段组成和聚合度，且通过投入乙二醇结构单元数不同的PEGMA单体改变聚合物亲水侧链长度，准确调控形成胶束的稳定性。
(2)本发明同时采用调控亲水侧链长度和可逆交联策略，最大程度增强聚合物胶束的稳定性，改善胶束药物递送效率。
(3)本发明构建的交联键是对pH响应的酰腙键结构，当载药胶束到达肿瘤细胞后，可响应微环境中的酸性环境断裂，快速释放抗癌药物阿霉素，实现化疗药物的治疗效果。
附图说明
图1为实施例1中酮基官能化单体OPMA的核磁氢谱。
图2为实施例2中三嵌段聚合物PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA的核磁氢谱。
图3为实施例2中三嵌段聚合物PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA的GPC洗脱曲线。
图4为实施例5中pH响应交联聚合物胶束的DLS图。
图5为实施例6中交联聚合物胶束在生理环境下的稳定性测试图。
图6为实施例7中载药交联聚合物胶束的TEM图。
图7为实施例8中载药交联胶束的体外释放曲线。
图8为实施例9载药胶束和游离阿霉素的细胞毒性实验图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：酮基官能化单体(OPMA)
在50mL干燥茄形瓶中加入搅拌子、PCC(4.85g，22.50mmol)和硅胶4.85g，通氩气10min，然后密封茄形瓶，用注射器将50mL二氯甲烷注入茄形瓶，再将茄形瓶置于冰浴中，接着逐滴加入HPMA(2.16mL，15mmol)的二氯乙烷溶液(事先将HPMA溶于10mL二氯甲烷)，室温下反应12h。往反应液中加入50mL***，将硅藻土铺加在布氏漏斗上，然后减压过滤并留取滤液。旋蒸除去溶剂，得到的液体用硅胶柱层析洗脱(流动相：正己烷：乙酸乙酯15:1)，再次旋蒸，得到黄色油状液体。合成反应式见公式(1)。利用核磁共振氢谱(1H NMR)对产物结构进行表征及分析，结果如图1所示。
Figure BDA0003472577830000091
实施例2：三嵌段聚合物(PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA)的制备(x:y:z＝35:15:25，n＝20)
取50mL干燥茄形瓶，往其中加入搅拌子、催化剂CuBr2(5.01mg，0.022mmol)，密封反应瓶后抽真空-通氩气3次，用注射器依次加入溶剂无水苯甲醚(8mL)、单体POEMA(3mL，15.75mmol)、配体HMTETA(0.06mL，0.22mmol)，充分搅拌10min使催化剂配合物形成。然后，加入预先溶于2mL无水苯甲醚的还原剂Sn(Oct)2(0.07mL，0.22mmol)并搅拌10min，用微量注射器加入小分子引发剂EBriB(0.06mL，0.45mmol)后，转移至40℃油浴中反应。待POEMA反应完全后，加入单体OPMA(0.96g，6.75mmol)继续反应15h，再加入预先溶于1mL无水苯甲醚的单体PEGMA(Mn＝950g/mol，10.66g，11.25mmol)，将温度调至60℃继续反应72h。反应完全后，将茄形瓶冷却至室温并加入THF终止反应，然后过中性氧化铝柱(THF作洗脱剂)，旋蒸浓缩后缓慢滴加至十倍量正己烷中沉淀，45℃、35mbar下真空干燥24h，得到产物。合成反应式见公式(2)。利用1H NMR、GPC对产物组成和结构进行分析，结果见图2和图3，Mn＝17.0kDa，
Figure BDA0003472577830000092
Figure BDA0003472577830000093
Figure BDA0003472577830000101
实施例3：三嵌段聚合物(PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA)的制备(x:y:z＝35:15:25，n＝9)
取50mL干燥茄形瓶，往其中加入搅拌子、催化剂CuBr2(5.01mg，0.022mmol)，密封反应瓶后抽真空-通氩气3次，用注射器依次加入溶剂无水苯甲醚(8mL)、单体POEMA(3mL，15.75mmol)、配体HMTETA(0.06mL，0.22mmol)，充分搅拌10min使催化剂配合物形成。然后，加入预先溶于2mL无水苯甲醚的还原剂Sn(Oct)2(0.07mL，0.22mmol)并搅拌10min，用微量注射器加入小分子引发剂EBriB(0.06mL，0.45mmol)后，转移至40℃油浴中反应。待POEMA反应完全后，加入单体OPMA(0.96g，6.75mmol)继续反应15h，再加入单体PEGMA(Mn＝475g/mol，5.33g，11.25mmol)，将温度调至60℃继续反应48h。反应完全后，将茄形瓶冷却至室温并加入THF终止反应，然后过中性氧化铝柱(THF作洗脱剂)，旋蒸浓缩后缓慢滴加至十倍量正己烷中沉淀，45℃、35mbar下真空干燥24h，得到产物。合成反应式见公式(2)。Mn＝12.7kDa，
Figure BDA0003472577830000102
实施例4：三嵌段聚合物(PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA)的制备(x:y:z＝35:15:25，n＝5)
取50mL干燥茄形瓶，往其中加入搅拌子、催化剂CuBr2(5.01mg，0.022mmol)，密封反应瓶后抽真空-通氩气3次，用注射器依次加入溶剂无水苯甲醚(8mL)、单体POEMA(3mL，15.75mmol)、配体HMTETA(0.06mL，0.22mmol)，充分搅拌10min使催化剂配合物形成。然后，加入预先溶于2mL无水苯甲醚的还原剂Sn(Oct)2(0.07mL，0.22mmol)并搅拌5min，用微量注射器加入小分子引发剂EBriB(0.06mL，0.45mmol)后，转移至40℃油浴中反应。待POEMA反应完全后，加入单体OPMA(0.96g，6.75mmol)继续反应15h，再加入单体PEGMA(Mn＝300g/mol，3.37g，11.25mmol)，将温度调至55℃继续反应48h。反应完全后，将茄形瓶冷却至室温并加入THF终止反应，然后过中性氧化铝柱(THF作洗脱剂)，旋蒸浓缩后缓慢滴加至十倍量正己烷中沉淀，45℃、35mbar下真空干燥24h，得到产物。合成反应式见公式(2)。Mn＝11.1kDa，
Figure BDA0003472577830000111
实施例5：pH响应交联聚合物胶束的制备
pH响应交联聚合物胶束采用透析法制备：取实施例2的聚合物(120mg)溶于30mLDMSO并转移到透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，用PBS溶液(50mmol/L，pH 6.5)透析24h。前面12h每两小时更换一次透析液，然后每6h更换透析液。随后将胶束溶液转移至烧瓶中，加入催化剂2-氨基-5-甲氧基苯甲酸(在胶束溶液中的浓度为10mmol/L)，将交联剂己二酸二酰肼(ADH)配成浓度为50mg/mL的溶液，滴入烧瓶中直至聚合物和ADH摩尔比为2/1。搅拌反应一天后，用去离子水再透析胶束溶液12h，每两小时更换透析液。最终，用0.45μm水相微孔滤膜过滤交联胶束溶液并冷干，得到交联聚合物胶束。
采用动态光散射(DLS)法表征交联胶束的粒径及多分散性(PDI)。交联胶束的水力动力学直径(Dh)为43.71nm，PDI为0.12(图4)。
实施例6：交联聚合物胶束在生理环境下的稳定性测试
取实施例2的聚合物(120mg)、荧光染料DiO(150μg)和DiI(150μg)共同溶于30mLDMSO并搅拌4h，再转移到透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，用PBS溶液(50mmol/L，pH 6.5)透析24h。前面12h每两小时更换一次透析液，然后每6h更换透析液。随后将胶束溶液转移至烧瓶中，加入催化剂2-氨基-5-甲氧基苯甲酸(在胶束溶液中的浓度为10mmol/L)，将交联剂ADH配成浓度为50mg/mL的溶液，滴入烧瓶中直至聚合物和ADH摩尔比为2/1。搅拌反应一天后，用去离子水再透析胶束溶液12h，每两小时更换透析液。最终，用0.45μm水相微孔滤膜过滤交联胶束溶液，得到负载两种荧光染料的交联聚合物胶束。然后取过滤后的胶束溶液配成1mL含10％胎牛血清(FBS)的胶束溶液，在37℃下摇匀孵育。用分子荧光仪测定不同时间下含10％胎牛血清(FBS)的胶束溶液在490～600nm处的荧光发射强度，计算505nm和505nm与572nm处强度值之和的比值，得到FRET效率。
如图5所示，在与胎牛血清孵育72h内，交联聚合物胶束的FRET效率没有明显变化，表明该胶束在与蛋白质等生理物质作用下，仍可长期保持良好的结构稳定性，从而稳定地包载荧光染料。
实施例7：负载抗癌药物DOX的交联聚合物胶束的制备
载药交联胶束采用透析法制备：取100mg DOX·HCl溶于10mL硼砂缓冲盐溶液(pH9.0)中，室温搅拌12h，用13000rpm转速离心15min，取沉淀冷干后，得到脱酸的DOX。然后将脱酸的DOX(36mg)与实施例2中聚合物(120mg)共同溶于30mL DMSO并搅拌4h，再转移到透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，用PBS溶液(50mmol/L，pH 6.5)透析24h。前面12h每两小时更换一次透析液，然后每6h更换透析液。随后将胶束溶液转移至烧瓶中，加入催化剂2-氨基-5-甲氧基苯甲酸(在胶束溶液中的浓度为10mmol/L)，将交联剂ADH配成浓度为50mg/mL的溶液，滴入烧瓶中直至聚合物和ADH摩尔比为2/1。搅拌反应一天后，用去离子水再透析胶束溶液12h，每两小时更换透析液。最终，用0.45μm水相微孔滤膜过滤交联胶束溶液并冷干，得到负载DOX的交联聚合物胶束。
取1mg载药胶束溶于10mL DMSO，用紫外可见分光光度计测定胶束溶液在波长480nm处的吸收值，计算载药量(LC)和包封率(EE)，LC≈11.32％，EE≈37.73％。
采用透射电镜(TEM)表征载药交联胶束的形貌与粒径。载药交联胶束呈现较均一的球状形貌，粒径为61.11nm(图6)。
实施例8：载药交联胶束的体外释放
取实施例7中载药交联胶束(3mg)分别分散于3mL PBS溶液(pH 7.4)和醋酸缓冲液(pH 5.0)中，然后转移到透析袋(MWCO＝3.5kDa)，浸没在对应的缓冲溶液(47mL)中，在37℃、100rpm条件下透析。选择特定时间点取透析外液(4mL)并补充等量的新鲜相应缓冲液(4mL)。用紫外可见分光光度计测定不同时间的透析外液在480nm处的吸收值，绘制体外释放曲线，如图7所示。
实施例9：细胞毒性实验
将HepG2细胞在37℃、5％CO2浓度下，使用加入10％FBS、1％青霉素和链霉素(原料为青霉素-链霉素溶液(100X)，碧云天C0222)的DMEM培养基传代培养。然后，以每孔5000个细胞的密度将细胞铺在96孔板中孵育24h。吸走旧培养基并洗涤后，分别将含有10μL载药胶束或游离DOX的150μL培养基加入孔板，继续孵育24h。然后再吸走并洗涤，加入含有10μLCCK-8试剂的150μL培养基作用3h，测试孔板在450nm波长处的紫外吸收值，计算不同材料浓度下的细胞存活率，如图8所示。
对比例1：
以甲苯为溶剂制备三嵌段聚合物(PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA)(x：y：z＝35：15：25，n＝9)
取50mL干燥茄形瓶，往其中加入搅拌子、催化剂CuBr2(4.01mg，0.018mmol)，密封反应瓶后抽真空-通氩气3次，用注射器依次加入溶剂无水甲苯(8mL)、单体POEMA(3mL，15.75mmol)、配体HMTETA(0.05mL，0.18mmol)，充分搅拌10min使催化剂配合物形成。然后，加入预先溶于2mL无水甲苯的还原剂Sn(Oct)2(0.06mL，0.18mmol)并搅拌10min，用微量注射器加入小分子引发剂EBriB(0.06mL，0.45mmol)后，转移至80℃油浴中反应6h。然后加入预先溶于1mL无水甲苯的单体OPMA(0.96g，6.75mmol)，将温度调至70℃继续反应12h，再加入溶于1mL无水甲苯的单体PEGMA(Mn＝475g/mol，5.33g，11.25mmol)继续反应48h。反应完全后，将茄形瓶冷却至室温并加入THF终止反应，然后过中性氧化铝柱(THF作洗脱剂)，旋蒸浓缩后缓慢滴加至十倍量正己烷中沉淀，45℃、35mbar下真空干燥24h，得到产物。利用GPC对产物组成和结构进行分析，Mn＝1.77kDa，
Figure BDA0003472577830000131
且洗脱曲线出现拖尾峰，表明聚合物的均一性不佳。
对比例2：负载DOX的交联聚合物胶束的制备
取45mg DOX·HCl溶于15mL DMSO中，加入三乙胺(TEA，1.08mL)避光搅拌24h。然后取实施例2中聚合物(120mg)溶于15mL DMSO，与上述的DOX溶液混合搅拌4h，再转移到透析袋(MWCO＝3.5kDa)中，用PBS溶液(50mmol/L，pH 6.5)透析24h。前面12h每两小时更换一次透析液，然后每6h更换透析液。随后将胶束溶液转移至烧瓶中，加入催化剂2-氨基-5-甲氧基苯甲酸(在胶束溶液中的浓度为10mmol/L)，将交联剂ADH配成浓度为50mg/mL的溶液，滴入烧瓶中直至聚合物和ADH摩尔比为2/1。搅拌反应一天后，用去离子水再透析胶束溶液12h，每两小时更换透析液。最终，用0.45μm水相微孔滤膜过滤交联胶束溶液并冷干，得到负载DOX的交联聚合物胶束。
取1mg载药胶束溶于10mL DMSO，用紫外可见分光光度计测定胶束溶液在波长480nm处的吸收值，计算载药量(LC)和包封率(EE)。LC≈3.87％，EE≈10.34％。
对比例3：
以甲苯为溶剂制备三嵌段聚合物(PPOEMA-b-POPMA-b-PPEGMA)(x：y：z＝35：15：25，n＝9)
取50mL干燥茄形瓶，往其中加入搅拌子、催化剂CuBr2(5.01mg，0.022mmol)，密封反应瓶后抽真空-通氩气3次，用注射器依次加入溶剂无水甲苯(8mL)、单体POEMA(3mL，15.75mmol)、配体HMTETA(0.06mL，0.22mmol)，充分搅拌10min使催化剂配合物形成。然后，加入预先溶于2mL无水甲苯的还原剂Sn(Oct)2(0.07mL，0.22mmol)并搅拌10min，用微量注射器加入小分子引发剂EBriB(0.06mL，0.45mmol)后，转移至40℃油浴中反应。待POEMA反应完全后加入单体OPMA(0.96g，6.75mmol)继续反应15h，再加入单体PEGMA(Mn＝475g/mol，5.33g，11.25mmol)继续反应48h。反应完全后，将茄形瓶冷却至室温并加入THF终止反应，然后过中性氧化铝柱(THF作洗脱剂)，旋蒸浓缩后缓慢滴加至十倍量正己烷中沉淀。
反应过程中表观粘度并未发生明显变化，且滴加至正己烷后无沉淀产生，表明并未生成聚合物。利用1H NMR表征产物结构，在化学位移5～6ppm处出峰，说明仍然有大量含碳碳双键的单体，聚合反应没有发生或聚合程度很低。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物，其特征在于，结构式如下所示：
Figure FDA0003963456650000011
其中，x＝15～35，y＝5～20，z＝15～35，n为5～20。
2.权利要求1所述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氯铬酸吡啶和硅胶粉溶于溶剂中，冰浴条件下加入甲基丙烯酸-2-羟丙酯，转至室温继续反应，得到酮基官能化单体甲基丙烯酸-2-氧代丙酯；
(2)将催化剂、单体甲基丙烯酸-2-苯氧乙酯、配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺溶于溶剂中，充分搅拌后加入还原剂，搅拌均匀，加入小分子引发剂并加热反应，待单体转化完全后加入步骤(1)制备的酮基官能化单体甲基丙烯酸-2-氧代丙酯继续反应，待单体转化完全后，再加入单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯继续反应，得到两亲性三嵌段聚合物。
3.根据权利要求2所述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述溶剂为苯甲醚和N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种；所述单体甲基丙烯酸-2-苯氧乙酯和溶剂的摩尔体积比为0.52～2.09mmol/mL。
4.根据权利要求2所述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述甲基丙烯酸-2-羟丙酯和氯铬酸吡啶的摩尔比为1：1.2～2；
步骤(2)所述催化剂、甲基丙烯酸-2-苯氧乙酯、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、还原剂、小分子引发剂、甲基丙烯酸-2-氧代丙酯和甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯的摩尔比为0.04～0.06：15～35：0.4～0.6：0.4～0.6：1：5～20：15～35。
5.根据权利要求2所述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述室温继续反应的时间为12～18h；
步骤(2)所述单体甲基丙烯酸-2-苯氧乙酯加热反应的温度为40～50℃，时间为4～10h；甲基丙烯酸-2-氧代丙酯反应的温度为40～50℃，时间为12～18h；所述甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯反应的温度为60～70℃，时间为36～72h。
6.根据权利要求2所述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述溶剂为二氯甲烷；所述氯铬酸吡啶与溶剂的摩尔体积比为0.3～0.5mmol/mL；
步骤(1)所述硅胶粉与氯铬酸吡啶的质量比为1：1；
步骤(2)所述催化剂为溴化铜和氯化铜中的至少一种；所述还原剂为辛酸亚锡和抗坏血酸中的至少一种；所述小分子引发剂为溴代异丁酸乙酯；
步骤(1)～(2)所述反应均在惰性气体保护和无水条件下进行。
7.权利要求1所述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物在负载水难溶性药物中的应用，其特征在于，将权利要求1所述基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物和水难溶性药物溶于溶剂中，混合均匀后，在磷酸缓冲盐溶液中透析，再加入催化剂和交联剂，室温搅拌反应，用去离子水透析，得到负载水难溶性药物的pH响应交联胶束体系。
8.根据权利要求7所述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物在负载水难溶性药物中的应用，其特征在于，所述基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物和水难溶性药物的质量比为2～10：1；
所述水难溶性药物为水难溶性抗癌药物。
9.根据权利要求7所述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物在负载水难溶性药物中的应用，其特征在于，所述催化剂为2-氨基-5-甲氧基苯甲酸；所述交联剂为己二酸二酰肼；所述基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物和交联剂的摩尔比为2：1；所述催化剂在磷酸缓冲盐溶液中透析后所得的胶束溶液中的浓度为8～12mmol/L；
所述室温搅拌反应的时间为20～30h；
所述水难溶性药物为脱酸的阿霉素和紫杉醇中的至少一种。
10.根据权利要求7所述一种基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物在负载水难溶性药物中的应用，其特征在于，所述磷酸缓冲盐溶液的pH＝6.5；所述在磷酸缓冲盐溶液中透析的时间为18～30h，每隔2～6h更换透析液一次；
所述用去离子水透析的时间为10～24h，每隔2h更换透析液一次；
所述溶剂为二甲基亚砜；所述基于pH响应交联键的亲水侧链可调的三嵌段聚合物与溶剂的质量体积比为4mg/mL。
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