CN114507270B

CN114507270B - 一种靶向pd-l1多肽、制备方法，组装形成的纳米管及应用

Info

Publication number: CN114507270B
Application number: CN202210011286.8A
Authority: CN
Inventors: 张黎民; 王蔚芝
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2022-01-06
Filing date: 2022-01-06
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2042-01-06
Also published as: CN114507270A

Abstract

本发明公开了一种靶向PD‑L1多肽、制备方法，组装形成的纳米管及应用，多肽通式如下：X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10；其中X1、X2、X8、X9、X10为亲水性氨基酸，X3为碱性或酸性氨基酸，X4、X5、X6、X7为疏水性氨基酸；多肽自组装形成纳米管，所述纳米管可以作为肿瘤治疗药物或成像试剂载体，用于肿瘤的免疫联合治疗和成像；本发明得到的多肽自组装形成纳米管，可以将具有识别功能的残基展示在纳米管表面，显示出特异性结合PD‑L1。

Description

一种靶向PD-L1多肽、制备方法，组装形成的纳米管及应用

技术领域

本发明涉及生物材料和医药技术领域，具体涉及一种靶向PD-L1多肽、制备方法，组装形成的纳米管及应用。

背景技术

恶性肿瘤严重危害人类健康，2020年全球新发癌症1929万例，死亡近1000万例。近年来，随着生物材料和免疫学等领域的快速发展，肿瘤免疫诊疗已获得了极大的突破。与传统的化疗、放疗以及手术疗法不同，肿瘤免疫疗法通过激活人体自身的免疫***来杀死肿瘤细胞，具有持久性、全身性、针对性和安全性等诸多优点，被誉为癌症治疗的第三次革命，也被认为是攻克肿瘤的新希望。

肿瘤免疫疗法主要包括肿瘤疫苗、过继性免疫细胞疗法以及免疫检查点疗法；其中免疫检查点疗法是人们关注的热点。免疫检查点是一类免疫抑制性的分子可以降低免疫反应的强度，避免过度免疫防止对正常组织造成损伤和破坏。然而癌症发展过程中也巧妙的利用了这一机制，在肿瘤细胞表面表达免疫检查点分子，从而造成免疫逃逸。免疫检查点疗法是通过使用抑制剂分子与免疫检查点结合从而阻断肿瘤细胞与免疫细胞结合从而激活免疫来杀死肿瘤细胞的过程。目前已经发现了多个免疫检查点，如细胞毒性T细胞相关蛋白-4(CTLA-4)、程序性死亡受体(PD-1)及其配体1(PD-L1)、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(TIGIT)等。该疗法发展至今已有多种抑制剂药物上市或进入临床阶段并取得了令人满意的效果。如针对CTLA-4检查点的ipilimumab和tremelimumab，以及作为PD-1抑制剂的pembrolizumab和nivolumab等。

目前免疫检查点抑制剂绝大多数以抗体为主，抗体具有抑制效率高，能够显著延长肿瘤患者生存期等优点，但其固有的免疫原性，穿透力弱、副作用大，热稳定性低，以及制备复杂，价格昂贵等缺陷限制了其发展。

由于PD-L1参与了肿瘤的发生、发展过程，并协助肿瘤细胞逃避机体免疫***的杀伤。与常规的靶蛋白不同，PD-L1由于其结合位点特殊，一直是抑制剂开发的难点。多肽凭借其生物相容性好、免疫原性低、易***清除、可化学合成等优势，在基于分子识别的免疫抑制剂研发中具有举足轻重的作用。此外，不同的氨基酸具有独特的理化性质，如带电性、亲疏水性以及手性等。这些不同性质的氨基酸分子之间通过脱水缩合形成多肽过程中按照排列顺序以及残基个数的不同，可产生蕴含丰富结构信息和识别信息的多肽链，这是其他分子所无法匹及的。并且多肽凭借其优势在肿瘤免疫、诊断等方面彰显出很强的优越性。小分子靶向多肽在体内动态环境中存在与靶点单价结合，不稳定，易被酶降解的困境，而多肽经过设计可通过自组装形成超分子纳米结构，如纳米管，纳米纤维和纳米球等。这些纳米组装体的形成一方面大大增加了其抗酶解性能，另一方面可作为载体高效运载抗肿瘤药物及成像试剂到达肿瘤位点实现多种方法联合诊疗。然而，在基于β-折叠二级结构的多肽自组装过程中，为了形成稳定的自组装结构，多肽分子都会以垂直于组装体表面的方式进行排布，导致侧链活性位点完全掩埋在组装体中，无法建立结构-功能上的联系。为使组装体具有靶向功能，目前常用的方法是将具有识别功能的多肽单元和具有组装功能的单元拼接，这种方式一定程度上实现了组装和识别，但存在单元间无法协调的问题；另一种方式是采用共组装的方式，将识别序列设计的比组装序列更长，使得共组装后识别序列暴露在组装体外部，但该方法需严格调控两种多肽的组装密度。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题提供一种对PD-L1具有高亲和力、自组装形成的纳米管将具有识别功能的残基展示在纳米管表面的靶向PD-L1多肽、制备方法，组装形成的纳米管及应用。

本发明采用的技术方案是：

一种靶向PD-L1多肽，多肽通式如下：

X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10

其中X1、X2、X8、X9、X10为亲水性氨基酸，X3为碱性或酸性氨基酸，X4、X5、X6、X7为疏水性氨基酸。

进一步的，所述X1为苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸中的一种；X2为丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、天冬氨酸中的一种；X3为赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、组氨酸、天冬氨酸中的一种；X4为苯并氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种；X5为苯并氨酸、酪氨酸、甘氨酸中的一种；X6为亮氨酸、缬氨酸、色氨酸和苯并氨酸中的一种；X7为亮氨酸、缬氨酸、色氨酸和苯丙氨酸中的一种；X8为丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸中的一种；X9为天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种；X10为赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸和精氨酸中的一种。

进一步的，所述多肽的氨基酸序列为：TSRFAAFSQK。

进一步的，所述多肽的氨基酸序列为：TSRFVFFSQK。

一种多肽纳米管，采用上述多肽自组装形成。

进一步的，所述多肽纳米管管壁厚度为2.4nm，自组装过程中多肽通过形成β-折叠二级结构以反平行的方式进行组装；多肽链两侧的活性残基暴露在纳米管的表面。

一种多肽的制备方法，包括以下步骤：

以树脂作为固相载体，通过混合裂分的方法逐个将每个位置上的氨基酸偶联到载体上；

通过裂解液将多肽在树脂上切除，分离纯化，即可得到所需多肽。

多肽纳米管的应用，多肽纳米管作为肿瘤治疗药物或成像试剂载体的用途。

进一步的，所述肿瘤为PD-L1表达阳性的肿瘤。

进一步的，所述肿瘤为黑色素瘤、非小细胞肺肿瘤、***肿瘤、结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肝肿瘤、胃肿瘤、食道肿瘤、乳腺肿瘤和胆管肿瘤中的一种。

本发明的有益效果是：

(1)本发明得到的多肽对PD-L1具有高亲和力；

(2)本发明得到的多肽自组装形成纳米管，可以将具有识别功能的残基展示在纳米管表面，显示出特异性结合PD-L1，阻断PD-L1/PD-1的能力；

(3)本发明得到的多肽在自组装形成纳米管时，多肽分子发生了大约40°的倾斜；

(4)本发明得到的多肽自组装形成的纳米管具有优秀的负载抗肿瘤药物和成像试剂的能力，可以用于肿瘤的免疫联合治疗和成像。

附图说明

图1为本发明多肽的制备方法示意图。

图2为本发明得到的多肽LY的质谱图和高效液相HPLC的纯度示意图。

图3为本发明得到的多肽LY及纳米管与PD-L1的亲和力示意图。

图4为本发明得到的多肽在PD-L1上的结合示意图。

图5为本发明得到的多肽在MC38和293T细胞上的结合示意图。

图6为本发明得到的多肽组装形成的纳米管的示意图。

图7为本发明实施例中超声2小时处理后得到的纳米管示意图。

图8为本发明得到的多肽自组装形成的纳米管的圆二色光谱示意图。

图9为本发明得到的多肽自组装形成的纳米管在PD-L1阳性和PD-L1阴性细胞表面的结合缠绕的SEM图。

图10为采用本发明多肽纳米管载药治疗不同时间后模型小鼠的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

一种靶向PD-L1多肽，多肽通式如下：

X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10

X1为苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸中的一种；X2为丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、天冬氨酸中的一种；X3为赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、组氨酸、天冬氨酸中的一种；X4为苯并氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种；X5为苯并氨酸、酪氨酸、甘氨酸中的一种；X6为亮氨酸、缬氨酸、色氨酸和苯并氨酸中的一种；X7为亮氨酸、缬氨酸、色氨酸和苯丙氨酸中的一种；X8为丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸中的一种；X9为天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种；X10为赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸和精氨酸中的一种。

上述多肽以Bola型结构的多肽为基础进行“从头设计”，多肽的通式如上所示。其中X4、X5、X6、X7四个残基为疏水残基，构成了多肽的疏水核心。X1、X2、X3、X8、X9、X10为极性残基，整个分子呈对称状态。

合成多肽和测试用到的实验仪器和材料如下：

异硫氰酸荧光素(FITC)，硫黄素T，1×PBS，10×PBS，脱脂牛奶，吐温-20，N-甲基***啉，哌啶，三氟乙酸(TFA)，二氯甲烷(DCM)，茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，N,N二甲基甲酰胺(DMF)，无水***，Tentagel树脂，王树脂，溴化氰，20种Fmoc-氨基酸，甲醇，多肽合成管，摇床，细胞培养箱，表面等离子体共振成像仪(SPRi)，真空水泵，旋转蒸发仪，激光共聚焦显微镜(ZEISSLSM 710)，扫描电镜，透射电子显微镜，原子力显微镜，上述试剂和材料均从商业途径获得。

溶剂的配制：

脱保护试剂——20％六氢吡啶；反应液——N-甲基***啉、N，N二甲基甲酰胺＝1:24。裂解液——三氟乙酸(92.5％)、三异丙基硅烷(2.5％)、乙二硫醇(2.5％)、超纯水(2.5％)；

三酮测试液——/>

三酮：维生素C：苯酚＝1:1:1。

采用Fmoc固相合成的方法进行肽库的合成，以Tentagel树脂为固相载体，采用混合裂分的方法逐个将每个位置上的氨基酸偶联到载体上，最后用强酸从树脂上切下肽链并脱去保护基团，合成过程如图1所示。

称取0.2g的tentagel树脂，按照上述固相多肽合成程序循环，按照氨基酸：树脂＝5:1的质量比逐个进行反应，并加入与氨基酸等量的HBTU进行偶联反应，反应前后用茚三酮显色试剂进行检测。最后，经过甲醇置换和收缩步骤，真空抽干，得到干燥树脂备用。用含有95％的TFA裂解液将多肽将树脂上切除，用冰***沉淀，得到的初步多肽用HPLC分离纯化，经质谱鉴定合成是否准确。

筛选具有PD-L1靶向性的多肽

肽库合成完毕后收集树脂，用1×PBS清洗两次，用5％的脱脂牛奶封闭2小时，用PBS清洗三次。加入生物素标记的PD-L1蛋白，在37℃孵育2小时，然后使用磁分选的方法将阳性树脂挑选出来。用溴化氰将阳性树脂上的多肽裂解下来，经Maldi-TOF-MS进行二级质谱鉴定阳性序列。经过HPLC分离纯化的多肽用质谱鉴定，得到的多肽序列为TSRFAAFSQK(如SEQ ID NO：1所示)，命名为LY，用Fmoc固相合成该序列，鉴定纯度结果如图2所示。鉴定LY多肽与PD-L1亲和力

将1mg/mL的多肽溶液打印在芯片上，在4℃条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗3次，1×PBS清洗3次，超纯水清洗2次。用5％的脱脂牛奶封闭过夜，在用10×，1×PBS清洗3次，最后用氮气吹干，装配在芯片机上进行检测。流动相为PBST配制的PD-L1溶液，浓度依次为192nM，96nM，48nM，24nM，12nM。如图3所示，最终得到多肽对PD-蛋白的亲和力为2.6×10^- ⁸M，表明具有很高的亲和力。

多肽LY在PD-L1蛋白上的结合位点

多肽LY的结构使用PEP-FOLD生成，PD-L1的晶体结构从PDB数据库中获得，使用软件ZDOCK 3.0.2进行分子对接和分析，结果如图4所示。从图中可以看出多肽能够稳定结合在PD-L1与PD-1接触的平面结构上，与PD-L1结合的力主要有氢键，静电作用以及π-π堆积。

多肽LY在细胞水平上对PD-L1阳性细胞的选择性

PD-L1高表达的结肠癌细胞系MC38使用含10％的1640培养基，以密度为1×10⁵/mL的密度接种在共聚焦皿中。正常细胞293T用含10％的DMEM培养基以1×10⁵/mL的密度接种在共聚焦皿中。

在37℃，5％二氧化碳的条件下培养24小时。弃掉培养基，加入100μL用无血清培养基配制的FITC-LY溶液，避光孵育1小时。然后用1×PBS清洗三次，1μM的Hoechst 3342染色试剂，孵育15分钟，再用1×PBS清洗三次，用激光共聚焦观察多肽在两种细胞上的分布情况。

结果如图5所示，在PD-L1阳性细胞MC38的细胞膜上有明亮的荧光，在PD-L1阴性的293T细胞上，没有观察到荧光。说明筛选到的多肽LY对PD-L1阳性希伯胺具有很好的靶向性以及选择性。

采用以下方法将多肽LY进行自组装形成纳米管

将合成纯化后的LY多肽用六氟异丙醇溶解，在室温下孵育6小时，然后用氮气缓慢使六氟异丙醇挥发干净。在水中充分溶解，用NaOH调节pH至7.0。在4℃冰箱中静置一周使多肽完全自组装。

将组装后的多肽溶液吸取10μL滴加到干净的云母片上，吸附20分钟后，吸掉多余液体，使用氮气吹干。再原子力显微镜下观察组装体形貌，扫描参数为，分辨率：512×512，扫描速度：1.0HZ，扫描角：0°，模式：Tapping。测试得到图6，从图中可以看出形成了直径均匀的纳米管，管壁厚度为2.4nm；经机理证明，该多肽发生了分子倾斜的组装过程，可以将对PD-L1具有亲和力的残基暴露在纳米管的表面。

多肽组装结束后，然后在不同功率下超声2小时，通过超声的方法可以控制纳米管的长度，使其能够符合所需长度需要。如图7所示，超声2小时后，纳米管的长度发生了改变，可以通过该方法对纳米管的长度进行调控。

多肽LY在组装时，多肽分子发生了大约40°的倾斜并将对PD-L1有亲和力的活性位点暴露在组装体的表面。

在多肽LY的基础上，选择疏水性更强的残基V、F替换掉多肽LY的中心两个A残基。使得多肽疏水性增加，从而利用溶剂化效应对β-折叠的倾斜角度进行调控。形成的多肽序列为：TSRFVFFSQK(如SEQ ID NO 2)。

多肽LY纳米管的二级结构表征

采用圆二色光谱仪检测组装体二级结构的方法，具体过程如下：选用MOS450圆二色光谱仪，选择CD模式，扫描范围为190～260nm，间隔时间设为0.5s，实验中用的比色皿光程是0.1mm。结果如图8所示。

多肽LY组装体在细胞表面靶向性和选择性

按照以下步骤进行操作：

MC38和293T细胞先在载玻片上生长24小时，然后加入100μL组装好的肽溶液在37℃条件下孵育1h，用PBS洗涤三次。

4％戊二醛固定细胞过夜。

临界点干燥(采用二氧化碳置换出无水乙醇)

喷金30s

扫描电镜成像。扫描结果如图9所示。

从图9中可以看出，PD-L1阴性细胞293T表面光滑，无多肽组装体出现。在PD-L1阳性的MC38细胞表面，附着着大量组装体。说明多肽组装体具有很好的靶向能力和选择性。

多肽LY组装体原位治疗结果

在7周龄的C57BL/6N小鼠皮下注射MC38细胞，待肿瘤长至100mm³，作为模型小鼠。将小鼠分为实验组和对照组。

实验组：小鼠隔天尾静脉注射100μL药物(其中LY组装体(如图6所示得到的纳米管)：4mg/kg，ce6(二氢卟吩):3mg/kg)。

对照组：小鼠隔天尾静脉注射100μL的PBS，在注射6小时后，用808nm激光照射10分钟。

结果如图10所示，从图中可以看出实验组小鼠的肿瘤明显减小，而对照组肿瘤大小逐渐变大。说明本发明得到的纳米管携带抗癌药物具有良好的治疗效果。

本发明通过使用“从头设计”和组合化学肽库筛选的方法得到的多肽LY，可以通过操纵多肽分子发生倾斜而自组装成具有靶向识别PD-L1功能的纳米管。其优秀的负载抗肿瘤药物和成像试剂能力可用于肿瘤的免疫联合治疗和成像。

Claims

1.一种靶向PD-L1多肽，其特征在于，多肽的序列为TSRFAAFSQK或TSRFVFFSQK。

2.一种多肽纳米管，其特征在于，多肽纳米管由权利要求1任一多肽自组装形成。

3.根据权利要求2所述多肽纳米管，其特征在于，所述多肽纳米管管壁厚度为2.4nm，自组装过程中多肽通过形成β-折叠二级结构以反平行的方式进行组装；多肽链两侧的活性残基暴露在纳米管的表面。

4.如权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.如权利要求2所述多肽纳米管作为载体的应用，其特征在于，所述载体为肿瘤治疗药物载体或成像试剂载体。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述肿瘤为PD-L1表达阳性的肿瘤。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤、非小细胞肺肿瘤、***肿瘤、结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肝肿瘤、胃肿瘤、食道肿瘤、乳腺肿瘤和胆管肿瘤中的一种。