CN114487446A - 一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白b测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，包括试剂一和试剂二；试剂一包括：20～100mmol/L缓冲液、30～50g/L聚乙二醇6000、0.5～2g/L防腐剂、7～9g/L氯化钠和0.5～2g/L表面活性剂；试剂二包括：20～100mmol/L缓冲液、7～9g/L氯化钠、0.5～2g/L防腐剂、0.5～2g/L表面活性剂和5～10g/LApoB抗体；通过加入表面活性剂和聚乙二醇6000，可使ApoB发生了脱酰氨基作用、氧化作用，改变了LDL颗粒结构和组成，也改变了颗粒间的空间位阻和立体的掩蔽作用，更多更充分地暴露了ApoB抗原位点，增强了其免疫反应，还可以减轻血清空白的浊度，提高了试剂盒的抗干扰能力，具有稳定、抗干扰能力强的优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒。
背景技术
载脂蛋白B(ApoB)是低密度和极低密度脂蛋白中的主要载脂蛋白，其重要功能是参与脂蛋白受体的识别和调节。目前监测ApoB的方法主要有ELISA、放射免疫分析法和免疫比浊法等，ELISA法费时且很难自动化，放射免疫分析法使用放射性物质，操作存在较大的风险，设备昂贵，不易推广；免疫比浊法是国内最为普遍通用的检测办法，主要优点是容易操作，温育时间短和快速易自动化，但由于试剂盒中所使用到的ApoB抗体为蛋白质，存在失活、变性、降解和聚集等特性，故ApoB试剂盒普遍存在稳定性差、抗干扰性能差等缺点，需要改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，能够对载脂蛋白B进行测定，具有稳定、抗干扰能力强的优点。
为实现上述目的，本发明提供了一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，所述试剂一包括：20～100mmol/L缓冲液、30～50g/L聚乙二醇6000、0.5～2g/L防腐剂、7～9g/L氯化钠和0.5～2g/L表面活性剂；
所述试剂二包括：20～100mmol/L缓冲液、7～9g/L氯化钠、0.5～2g/L防腐剂、0.5～2g/L表面活性剂和5～10g/LApoB抗体。
其中，所述试剂一的制备方法包括：
将所述缓冲液、所述聚乙二醇6000、所述防腐剂、所述氯化钠和所述表面活性剂混合进纯化水中，再加入盐酸溶液将pH调节至6.95～7.05，得到第一混合液；
将所述第一混合液静置后过滤掉不溶物，制得所述试剂一。
其中，所述试剂二的制备方法包括：
将所述缓冲液、所述氯化钠、所述防腐剂和所述表面活性剂混合进纯化水中，再加入盐酸溶液将pH调节至6.95～7.05，得到第二混合液；
将所述ApoB抗体加入所述第二混合液中，搅拌至完全溶解后加入纯化水，混合均匀后静置，静置后过滤掉不溶物，制得所述试剂二。
其中，所述试剂一和所述试剂二中的所述缓冲液PH值均在7.0～7.5范围内。
其中，所述试剂一和所述试剂二中的所述缓冲液均为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种。
其中，所述试剂一和所述试剂二中的所述防腐剂均为叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸和生物防腐剂ProClin300中的一种或多种。
其中，所述试剂一和所述试剂二中的所述表面活性剂均为聚氧乙烯烷基醚EMULGEN 220、EMULGEN LS-110、EMULGENA-90和EMULGEN LS-114中的一种或多种。
其中，所述ApoB抗体为羊抗人、兔抗人、鼠抗人或其它动物抗人抗体，且效价大于或等于1：128。
本发明的一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，通过加入表面活性剂和聚乙二醇6000，可使ApoB发生了脱酰氨基作用、氧化作用，改变了LDL颗粒结构和组成，也改变了颗粒间的空间位阻和立体的掩蔽作用，更多更充分地暴露了ApoB抗原位点，增强了其免疫反应，还可以减轻血清空白的浊度，提高了试剂盒的抗干扰能力；本发明所使用的抗体效价和纯度高，可增加试剂盒的灵敏度和准确度，通过在R2加入防腐剂和氯化钠，可使抗体稳定保存，不会出现絮凝或沉淀现象，增加了试剂盒的稳定性，有利于试剂的长期保存；本试剂盒配方简单，技术难度低，成本低廉，但准确度、抗干扰性能、分析灵敏度等性能优异，可大规模应用，进一步在市场推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的试剂一的制备方法的流程图。
图2是本发明的试剂二的制备方法的流程图。
图3是本发明的试剂临床测试相关性分析结果表。
图4是本发明的试剂临床测试配对样本检验结果表。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
请参阅图1～图4，本发明提供一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒：包括试剂一和试剂二；
所述试剂一包括：20～100mmol/L缓冲液、30～50g/L聚乙二醇6000、0.5～2g/L防腐剂、7～9g/L氯化钠和0.5～2g/L表面活性剂；
所述试剂二包括：20～100mmol/L缓冲液、7～9g/L氯化钠、0.5～2g/L防腐剂、0.5～2g/L表面活性剂和5～10g/LApoB抗体。
进一步的，所述试剂一和所述试剂二中的所述缓冲液PH值均在7.0～7.5范围内。
进一步的，所述试剂一和所述试剂二中的所述缓冲液均为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种。
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进一步的，所述ApoB抗体为羊抗人、兔抗人、鼠抗人或其它动物抗人抗体，且效价大于或等于1：128。
在本实施方式中，原理为：血清中的载脂蛋白B，可与所述试剂一和所述试剂二的中特异性抗体结合形成不溶性复合物而产生浊度，浊度的高低与样本中载脂蛋白B的浓度成正比，因此，可在波长340nm处，通过浊度变化来测得样本中载脂蛋白B的浓度；通过加入表面活性剂和聚乙二醇6000，可使ApoB发生了脱酰氨基作用、氧化作用，改变了LDL颗粒结构和组成，也改变了颗粒间的空间位阻和立体的掩蔽作用，更多更充分地暴露了ApoB抗原位点，增强了其免疫反应，还可以减轻血清空白的浊度，提高了试剂盒的抗干扰能力；本发明所使用的抗体效价和纯度高，可增加试剂盒的灵敏度和准确度，通过在R2加入防腐剂和氯化钠，可使抗体稳定保存，不会出现絮凝或沉淀现象，增加了试剂盒的稳定性，有利于试剂的长期保存；本试剂盒配方简单，技术难度低，成本低廉，但准确度、抗干扰性能、分析灵敏度等性能优异，可大规模应用，进一步在市场推广。
本发明可采用手工测试方法，也可以通过全自动生化分析仪等分析仪器对样本进行检测，具体采用以下计算方法：
ΔA样本＝A样本-A空白
将纯化水的ΔA值作为零点，依次测定不同浓度的校准品，计算相应ΔA值，以校准品浓度为X轴，ΔA值为Y轴，采用logit-log(4p)或spline模式建立标准曲线，将样本的ΔA值代入标准曲线中即可计算出样本的浓度。
表1ApoB测定试剂使用参数表
进一步的，所述试剂一的制备方法包括：
S101将所述缓冲液、所述聚乙二醇6000、所述防腐剂、所述氯化钠和所述表面活性剂混合进纯化水中，再加入盐酸溶液将pH调节至6.95～7.05，得到第一混合液；
混合容器中加入占所述试剂一配制所需总量约80％的纯化水，分别准确称取并依次搅拌溶解全批量的所述缓冲液、所述聚乙二醇6000、所述防腐剂、所述氯化钠和所述表面活性剂到混合容器中，完全溶解后继续搅拌5分钟，再用6mol/L盐酸溶液将pH调节至7.0±0.05范围内，制得第一混合液。
S102将所述第一混合液静置后过滤掉不溶物，制得所述试剂一；
所述第一混合液中加入纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡15分钟,用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可制得所述试剂一。
进一步的，所述试剂二的制备方法包括：
S201将所述缓冲液、所述氯化钠、所述防腐剂和所述表面活性剂混合进纯化水中，再加入盐酸溶液将pH调节至6.95～7.05，得到第二混合液；
混合容器中加入占所述试剂二配制所需总量约80％的纯化水，分别准确称取并依次搅拌溶解全批量的所述缓冲液、所述氯化钠、所述防腐剂和所述表面活性剂到混合容器中，再用6mol/L盐酸溶液将pH调节至7.0±0.05范围内，制得第二混合液。
S202将所述ApoB抗体加入所述第二混合液中，搅拌至完全溶解后加入纯化水，混合均匀后静置，静置后过滤掉不溶物，制得所述试剂二。
准确称取全批量的所述ApoB抗体加入至所述第二混合液内，搅拌至完全溶解后继续搅拌5分钟，此过程避免剧烈搅拌，而后加入纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡15分钟，用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可制得所述试剂二。
为更好地理解本发明，下面采用几种具体的制造过程进行说明。
实施例1：所述试剂一各组分采用100mol/LPH值为7.0的Tris-HCL缓冲液、30g/L聚乙二醇6000、1g/L叠氮钠、8g/L氯化钠、1g/LEMULGEN LS-110；制备方法为：混合容器中加入占试剂一配制所需总量约80％的纯化水，分别准确称取并依次搅拌溶解全批量的Tris-HCL缓冲液、聚乙二醇6000、叠氮钠、氯化钠、EMULGEN LS-110到混合容器中，完全溶解后继续搅拌5分钟，再用6mol/L盐酸溶液将pH调节至7.0±0.05范围内，而后加入纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡15分钟,用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可制得所述试剂一。
所述试剂二各组分采用100mol/LPH值为7.0的Tris-HCL缓冲液、8g/L氯化钠、1g/L叠氮钠、1g/LEMULGEN LS-110、5g/LApoB抗体；制备方法为：混合容器中加入占所述试剂二配制所需总量约80％的纯化水，分别准确称取并依次搅拌溶解全批量的Tris-HCL缓冲液、氯化钠、叠氮钠、EMULGEN LS-110到混合容器中，再用6mol/L盐酸溶液将pH调节至7.0±0.05范围内，而后加入全批量的ApoB抗体，搅拌至完全溶解后继续搅拌5分钟，此过程避免剧烈搅拌，而后加入纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡15分钟，用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可制得所述试剂二。
实施例2：所述试剂一各组分采用100mol/LPH值为7.0的Tris-HCL缓冲液、30g/L聚乙二醇6000、1g/L叠氮钠、8g/L氯化钠、1g/LEMULGEN LS-110，制备方法与实施例1相同；
所述试剂二各组分采用100mol/LPH值为7.0的Tris-HCL缓冲液、1g/LEMULGEN LS-110、5g/LApoB抗体，制备方法与实施例1相同。
实施例3：所述试剂一各组分采用100mol/LPH值为7.0的Tris-HCL缓冲液、30g/L聚乙二醇6000、1g/L叠氮钠、8g/L氯化钠、1g/L吐温-80；制备方法与实施例1相同；
所述试剂二各组分采用100mol/LPH值为7.0的Tris-HCL缓冲液、8g/L氯化钠、1g/L叠氮钠、1g/L吐温-80、5g/LApoB抗体；制备方法与实施例1相同。
实施例4：所述试剂一各组分采用100mol/LPH值为7.0的Tris-HCL缓冲液、30g/L聚乙二醇6000、1g/L叠氮钠、8g/L氯化钠，制备方法与实施例1相同；
所述试剂二各组分采用100mol/LPH值为7.0的Tris-HCL缓冲液、8g/L氯化钠、1g/L叠氮钠、5g/LApoB抗体；制备方法与实施例1相同。
性能验证：
试验一：实施实施例1和实施实施例2，同时一起进行37℃放置7天的稳定性负荷实验以及在4至8℃贮存温度下保存12个月的贮存稳定性实验，在0、3、5、7天和1、3、5、7、9、11、12月时对试剂的精密度和准确度进行监测。
具体试验方法:在每个时间节点检测靶值为1.10±0.20g/L的质控品，分别检测5次，监测变异系数和相对偏差的变化，结果见下表2。
表2试剂稳定性验证数据
由表2可知，实施实施例1的检测结果更好，当试剂二加入氯化钠和叠氮钠后，试剂的准确度高，精密度好。本发明通过加入氯化钠和叠氮钠，提高了试剂的精密度和准确度，保证了临床测试结果的可靠性。
氯化钠具有维持溶液渗透压的作用，离子强度可以通过中和蛋白质表面电荷直接影响蛋白质稳定性，R2中加入适宜浓度的氯化钠可替代复杂的镁盐、钙盐、糖类等维稳物质，防止抗体蛋白出现沉淀现象，影响试剂的准确度和精密度。而叠氮钠作为抗菌剂加入抗体工作液中可增加抗体的贮存时间。
试验二:
干扰试验：使用添加法测试试剂的抗干扰性，干扰物及干扰浓度根据市场在售获国家药品监督局认可的某公司的ApoB测定试剂盒的说明书确定，分别为：胆红素30mg/dL、血红蛋白500mg/dL、甘油三酯800mg/dL、抗坏血酸50mg/dL。用实施实施例1、实施实施例3、实施实施例4以及市场在售获国家药品监督局认可的某公司的ApoB测定试剂盒对干扰样本进行测试，各组的测试结果见表3。
其中干扰样本的配制：按干扰浓度标示量的10倍配制干扰物质浓缩液，从中吸取1份浓缩液，并加入9份样本血清混合均匀，对照样本以相同体积的生理盐水代替干扰物浓缩液，每个样本测试3遍，计算平均值的相对偏差。
表3试剂抗干扰性能验证结果
从上表3可以看出，实施例4的抗干扰能力非常差，而加入吐温-80后，实施例3的抗干扰性能有所改善，但抗脂血能力较弱，说明常规的表面活性剂并不能完全消除脂血样本对测试的干扰，而使用本发明采用的所述表面活性剂，相对偏差数值与已上市的比对试剂相差无几，说明本发明采用的所述表面活性剂可显著提高载脂蛋白B测定试剂盒的抗干扰性能。
吐温-80和本发明采用的所述表面活性剂都属于非离子型表面活性剂，该类表面活性剂低毒性且对电解质不敏感，有利于单克隆抗体的稳定。由于单克隆抗体表面带有电荷，因此单克隆抗体药物可能吸附到带电荷的包材内表面，这种吸附一方面会降低药物浓度，另一方面吸附在包材内表面的单克隆抗体会形成聚集体。表面活性剂能够改变单克隆抗体与包材内表面的相互作用从而活化抗体。除此之外，适当的表面活性剂还可以对不同种类的脂蛋白有隐蔽作用，更多更充分地暴露了ApoB抗原位点，增强了其免疫反应，还可以减轻血清空白的浊度，故少量、特殊的表面活性剂可替代复杂的盐酸胍等多种有机成分，提高了试剂的抗干扰能力。而经过实验筛选，发现四种表面活性剂有以上作用，虽然其表面活性剂价格较高，但大量购买时与其他表面活性剂价格相差不大，且表面活性剂用量少，对试剂价格影响小，且该配方简单，化学物质少，相对比其他配成本低廉。
试验三：
临床相关性试验：实施例1与市场在售获国家药品监督局认可的某公司的ApoB测定试剂盒同时检测40个临床血清样本，以比对试剂检测结果作为对照组，对两组检测结果进行相关性分析和配对样本检验，结果如图3所示
从图3的试剂临床测试相关性分析结果表和图4的试剂临床测试配对样本检验结果表可以得出，实施例1与比对试剂相关性分析系数R2＝0.9849，大于0.975，且配对样本检验结果P＝0.813，大于0.05，说明实施例1与已上市试剂在临床测试结果上具有良好相关性且结果无明显差异性。
本发明的一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，通过加入表面活性剂和聚乙二醇6000，可使ApoB发生了脱酰氨基作用、氧化作用，改变了LDL颗粒结构和组成，也改变了颗粒间的空间位阻和立体的掩蔽作用，更多更充分地暴露了ApoB抗原位点，增强了其免疫反应，还可以减轻血清空白的浊度，提高了试剂盒的抗干扰能力；本发明所使用的抗体效价和纯度高，可增加试剂盒的灵敏度和准确度，通过在R2加入防腐剂和氯化钠，可使抗体稳定保存，不会出现絮凝或沉淀现象，增加了试剂盒的稳定性，有利于试剂的长期保存；本试剂盒配方简单，技术难度低，成本低廉，但准确度、抗干扰性能、分析灵敏度等性能优异，可大规模应用，进一步在市场推广。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (8)
1.一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，
包括试剂一和试剂二；
所述试剂一包括：20～100mmol/L缓冲液、30～50g/L聚乙二醇6000、0.5～2g/L防腐剂、7～9g/L氯化钠和0.5～2g/L表面活性剂；
所述试剂二包括：20～100mmol/L缓冲液、7～9g/L氯化钠、0.5～2g/L防腐剂、0.5～2g/L表面活性剂和5～10g/LApoB抗体。
2.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，所述试剂一的制备方法包括：
将所述缓冲液、所述聚乙二醇6000、所述防腐剂、所述氯化钠和所述表面活性剂混合进纯化水中，再加入盐酸溶液将pH调节至6.95～7.05，得到第一混合液；
将所述第一混合液静置后过滤掉不溶物，制得所述试剂一。
3.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，所述试剂二的制备方法包括：
将所述缓冲液、所述氯化钠、所述防腐剂和所述表面活性剂混合进纯化水中，再加入盐酸溶液将pH调节至6.95～7.05，得到第二混合液；
将所述ApoB抗体加入所述第二混合液中，搅拌至完全溶解后加入纯化水，混合均匀后静置，静置后过滤掉不溶物，制得所述试剂二。
4.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，
所述试剂一和所述试剂二中的所述缓冲液PH值均在7.0～7.5范围内。
5.如权利要求4所述的一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，
所述试剂一和所述试剂二中的所述缓冲液均为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，
所述试剂一和所述试剂二中的所述防腐剂均为叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸和生物防腐剂ProClin300中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，
所述试剂一和所述试剂二中的所述表面活性剂均为聚氧乙烯烷基醚EMULGEN 220、EMULGEN LS-110、EMULGENA-90和EMULGEN LS-114中的一种或多种。
8.如权利要求1所述的一种稳定、抗干扰能力强的载脂蛋白B测定试剂盒，其特征在于，
所述ApoB抗体为羊抗人、兔抗人、鼠抗人或其它动物抗人抗体，且效价大于或等于1：128。
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