CN114480571A - 一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，属于检测技术领域，该检测方法基于果糖激酶FK活性，通过三步法酶动力学法测定的原理，该方法具体通过以下步骤，步骤一，果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化；步骤二，酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法；步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量，实现对果糖的高特异性检测，检测范围较广，因此具有良好的应用前景。

Description

一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，更具体地说，涉及一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法。
背景技术
果糖是一种广泛存在于自然界中最为常见的己酮糖。果糖中含6个碳原子，也是一种单糖，是葡萄糖的同分异构体，是蔗糖的组成成份。
当人体摄入果糖后，通过肠道吸收后不依赖胰岛素直接进入细胞内代谢，是引起人体器官内脂肪沉积的重要因素之一。当饮食中果糖太多时，对肝脏、动脉和心脏都会有潜在危险。糖尿病人也存在血液循环中果糖水平的升高，果糖激酶失去功能突变引起的先天性果糖尿，患者在进食含果糖丰富是食物后，血中果糖含量升高，并从尿液中排出。
但是现有的果糖检测手段特异性不高，检测范围受限，因此提出一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法。
发明内容
1．要解决的技术问题
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，该检测方法基于果糖激酶FK活性，通过三步法酶动力学法测定的原理，第一步：通过FK以ATP作为辅助因子将果糖磷酸化为6-磷酸果糖；第二步：反应过程中形成的ADP被丙酮酸激酶使用，将磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸；第三步：乳酸脱氢酶使用NADH作为辅因子将丙酮酸转化为乳酸，通过跟踪NADH在340nm处吸光度的降低来测量FK活性，实现对果糖检测的特异性高，检测范围较广。
2．技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
本发明的一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，该检测方法基于果糖激酶FK活性，通过三步法酶动力学法测定的原理，该方法具体通过以下步骤，步骤一，果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化；步骤二，酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法；步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量，实现对果糖的高特异性检测。
进一步地，该检测方法中：
步骤一，果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化包含：
S1、FK蛋白原核表达：
S11、原核表达体系的构建：目的基因按照标准程序合成，使用大肠杆菌表达载体质粒pET-28a，在酶切位点XhoⅠ/NcoⅠ处***FK蛋白基因构建重组表达载体pET-28a-FK，卡那霉素（kan）抗性基因筛选，HIS标签蛋白纯化；
S12、原核重组蛋白的表达与纯化；
步骤二酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法包含：
S2、建立FK酶动力学检测方法：
待评估化学物：D-(-)-果糖、D- (+)-葡萄糖、蔗糖；
S22、检测设备：CLARIOstar 多功能酶标仪；
S23、设置程序：反应混合物包括100 mM Tris-HCl（pH 7.5），1 mM Fructose，1 mMATP，100 mM KCl，1.5 mM MgCl2，1 mM PEP，0.5 mM NADH，0.2 µl PK / LDH，以及10 μl的纯化重组酶，最终反应容量为100 µl；
S24、FK活性检测实验：首先选取两种不同浓度的FK对果糖进行检测，在体系中浓度范围为0至10 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度250 mM（反应体系中的终浓度为10 mM）开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照，在CLARIOstar多功能酶标仪中，通过加入不同浓度底物开始连续测定反应，并通过追踪340 nm处吸光度的变化来测定活性，这对应于NADH向NAD +的转化，该测定在25℃下进行30分钟，得到不同浓度果糖检测结果的对应数值输入Graphpad Prism 软件中进行分析，使用线性方程的回归线拟合进行分析，确定平均值±标准误差（n=4）；
步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量：
S3、以血液、尿液和饮料的替代物作为果糖溶剂的实验前处理方法以及酶学检测。
进一步地，所述步骤S12中原核重组蛋白包括以下步骤：
一、转化到表达菌：
pET-28a-FK质粒加入BL21 （DE 3）感受态中混合，之后按照常规流程转化；
二、批量诱导表达：
挑选单菌落扩增批量表达，抗菌素为卡那霉素，使用IPTG诱导。
进一步地，用His-tag Purification Resin的标准方法纯化，用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度。
进一步地，所述步骤S3中血液的血清中果糖含量的检测包括以下步骤：
一、样本预处理：为检测血液中果糖含量，使用FBS（胎牛血清）和血浆类似物（r-SBFA）作为溶剂溶解不同浓度果糖，血浆类似物（r-SBFA）取45μl加入1.5 ml EP管中，再加入5 μl不同浓度以血浆类似物（r-SBFA）为溶剂的果糖，每个管中加入 150 μl 在4℃预冷过的甲醇溶液，涡旋混匀5min，-20℃放置60分钟之后离心13000g（4℃，15min），取上清加入FK的反应体系，检测果糖浓度；
二、标准曲线建立：预处理的样本上清中，果糖最高浓度设置为100 mM，稀释后反应体系中后终浓度为5 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照；
三、样品检测：选取三个不同浓度的样品（n=3）对本实验方案的精确度进行检测。
进一步地，所述步骤S3中尿液中果糖含量的检测包括以下步骤：
一、配制人工尿液(MP-AU)：按下表中提供的顺序将相关试剂添加至100ml超纯水中；
表1
试剂 Molarity (mM) Quantity (g/100ml)
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 11.965 0.17
C<sub>5</sub>H<sub>4</sub>N<sub>4</sub>O<sub>3</sub> 1.487 0.025
Na<sub>3</sub>C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>O<sub>7</sub>·2H<sub>2</sub>O 2.45 0.072
C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>N<sub>3</sub>O 7.791 0.0881
CH<sub>4</sub>N<sub>2</sub>O 249.75 1.5
KCl 30.953 0.2308
NaCl 30.053 0.1756
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 1.663 0.0244
NH<sub>4</sub>Cl 23.667 0.1266
K<sub>2</sub>C<sub>2</sub>O<sub>4</sub> 0.19 0.0035
MgSO<sub>4</sub> 4.389 0.0449
NaH2PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 18.667 0.224
Na2HPO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 4.667 0.1653
二、标准曲线建立：称取适量果糖溶于人工尿液(MP-AU)，果糖最高浓度设置为100mM，稀释后反应体系中后终浓度为5 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照；
三、样品检测：选取三个不同浓度的样品（n=3）对本实验方案的精确度进行检测。
进一步地，所述步骤S3中饮料中果糖含量的检测包括以下步骤：
一、标准曲线建立：称取适量果糖溶于Ultra-pure water中，果糖最高浓度设置为100 mM，稀释后反应体系中后终浓度为5 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照；
二、样品检测：选取三个不同浓度的样品对本实验方案的精确度进行检测。
3．有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
本方案基于果糖激酶（FK）活性是通过三步法酶动力学法测定原理，第一步：通过FK以ATP作为辅助因子将果糖磷酸化为6-磷酸果糖；第二步：反应过程中形成的ADP被丙酮酸激酶使用，其将磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸；第三步：乳酸脱氢酶使用NADH作为辅因子将丙酮酸转化为乳酸，通过跟踪NADH在340nm处吸光度的降低来测量FK活性，并通过以下步骤，步骤一，果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化；步骤二，酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法，基于标准品检测绘制标准曲线及计算样品果糖浓度的计算方法；步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量，实现对果糖的高特异性检测，检测范围较广，因此具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明用于测定果糖激酶 (FK) 活性的酶偶联反应的示意图；
图2为本发明pET-28a-FK质粒图谱的示意图；
图3为本发明不同批次蛋白洗脱液的SDS-PAGE凝胶电泳结果的示意图；
图4为本发明蛋白标准曲线；
图5为本发明果糖存在下FK反应对NADH的消耗量的折线图；
图6为本发明FK的特异性检测的折线图；
图7为本发明果糖以FBS为溶剂下FK反应标准曲线；
图8为本发明果糖以为r-SBFA溶剂下FK反应标准曲线；
图9为本发明果糖以MP-AU（5 μl）为溶剂下FK反应标准曲线；
图10为本发明果糖以MP-AU（10 μl）为溶剂下FK反应标准曲线；
图11为本发明果糖以Ultra-pure water为溶剂下FK反应标准曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本方案基于果糖激酶（FK）活性是通过三步法酶动力学法测定原理，第一步：通过FK以ATP作为辅助因子将果糖磷酸化为6-磷酸果糖；第二步：反应过程中形成的ADP被丙酮酸激酶使用，其将磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸；第三步：乳酸脱氢酶使用NADH作为辅因子将丙酮酸转化为乳酸，通过跟踪NADH在340nm处吸光度的降低来测量FK活性，并通过以下步骤，步骤一，果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化；步骤二，酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法，基于标准品检测绘制标准曲线及计算样品果糖浓度的计算方法；步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量，实现对果糖的高特异性检测。
实施例：
一、FK蛋白原核表达
1.原核表达体系的构建
目的基因按照标准程序合成，使用大肠杆菌表达载体质粒pET-28a，在酶切位点XhoⅠ/NcoⅠ处***FK蛋白基因构建重组表达载体pET-28a-FK，卡那霉素抗性基因筛选，HIS标签蛋白纯化，如图2所示。
2、原核重组蛋白的表达与纯化
2.1蛋白的表达
（1）常规方法转化到表达菌
1.在超净工作台将2 µL pET-28a-FK质粒加入50 µL BL21 （DE 3）感受态中混合，冰浴30 min。
2.热激：将混合物放入水浴锅，42℃水浴热激90s后迅速拿出。
3.冰浴3 min后，在超净工作台向混合物加入900 µL 无抗生素的液体LB培养基并放到37℃摇床，220 转/分钟转速摇45 min。
4.2000 转/分钟转速离心2 min。
5.在超净工作台弃大部分上清，留大约50 µL培养液重悬菌体，吸出加入有Kan抗生素（50 μg/mL）的固体LB培养板上，滚珠涂布法降菌液涂布均匀，倒置放入37℃培养箱中过夜培养。
（2）诱导表达
1.在超净工作台中操作，从培养板中挑选单菌落到加入5 mL 含有Kan抗生素（50μg/mL）的液体LB培养基，37℃，220 转/分钟转速过夜培养。
2.在超净工作台中操作，将过夜培养的菌液转接到含有200 mL液体LB培养基的锥形瓶中，加入Kan抗生素，37℃，220 转/分钟转速培养。
3.培养3-4h左右时，从中吸取1 mL菌液检测OD600值，直到OD600在0.6-0.8之间，加入诱导剂IPTG（100 mM）按照1:1000的比例加入锥形瓶中进行诱导表达，37℃，220 转/分钟转速培养12h左右。
4.收集菌液：4℃，12000 转/分钟，离心20 min，弃上清，PBS洗涤一遍，44℃，12000转/分钟，离心20 min，弃上清。
2.2蛋白的纯化
重组蛋白FK携带HIS标签，使用HIS标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。
a.离心收集细菌沉淀，按照每克细菌沉淀湿重加入4 ml (2-5 ml均可)非变性裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如碧云天的P1030/P1031 蛋白酶抑制剂混合物(His-Tag蛋白纯化用, 100X)。
注：后续试剂用量均按照1克菌重和4 ml裂解液用量进行。
b.加入溶菌酶至终浓度为1 mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30 min。
注：溶菌酶可以用裂解液配制成100 mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20℃保存。
c.冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。
注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
d.(可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以加入RNase A至10 µg/ml及DNase I至5 µg/ml，冰上放置10-15 min。或者也可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等。
e.4℃，10000g离心20-30 min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20 µl上清留作后续检测用。
注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化，上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
f.取1 ml混合均匀的用50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)做表达蛋白的纯化。
4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入0.5 ml非变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复平衡1-2次，弃去液体。将约4 ml细菌裂解液上清加入其中，4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60 min。
注：BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)也可以不平衡直接使用，但蛋白的得率有可能会有5-20%的下降。
g.将裂解液和BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)的混合物装入试剂盒提供的亲和层析柱空柱管中。
注：也可先取1 ml混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin(耐变性剂型)装柱，然后用0.5 ml非变性裂解液平衡2-3次后加入约4 ml细菌裂解液上清，后续可以把穿流液收集后重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白。先混合后装柱的方式操作起来相对麻烦一些，但更有利于带有His标签重组蛋白与镍柱的充分结合，特别是当His标签被蛋白本身部分遮挡或His标签重组蛋白浓度很低时与镍柱的结合效率会高一些。
h.将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20 µl穿流液作后续分析用。
i.洗柱5次，每次加入0.5-1 ml非变性洗涤液，每次均收集约20 µl穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用，洗柱及下一步洗脱过程中可以用Bradford法(P0006)简单快速地检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。
注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗柱次数2-3次。
j.洗脱目的蛋白6-10次，每次用0.5 ml非变性洗脱液洗脱。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中，收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。
3、SDS-PAGE凝胶电泳
3.1灌胶与上样
玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
（1）配胶
分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置12％的分离胶和5％的浓缩胶。
表2.分离胶的配制方法
试剂 12%分离胶（10 mL）
30％Acr-Bis（mL） 4
1.5M Tirl-HCI pH8.8（mL） 2.5
ddH<sub>2</sub>O（mL） 3.3
10%SDS（μL） 100
10%APS（μL） 100
TEMED（μL） 6
表3.浓缩胶的配制方法
试剂 5%分离胶（10 mL）
30％Acr-Bis（mL） 0.66
1.5M Tirl-HCI pH6.8（mL） 0.5
ddH<sub>2</sub>O（mL） 2.75
10%SDS（μL） 40
10%APS（μL） 40
TEMED（μL） 4
（2）配胶步骤
配 12％分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶，灌胶时，可用 3 ml的吸管或10 ml 枪吸取适量的胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可，然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，再等 3 min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
按前面方法配 5%的浓缩胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子***浓缩胶中，灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平，由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶，待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
（3）上样
用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。取出上样样品至 0.5 ml 离心管中，加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×，上样前要将样品于沸水中煮 5 min 使蛋白变性。
加足够的电泳液后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡，将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
3.2电泳
加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电压控制在100～200V，大约15～20 min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电压升到200V，电泳过程保持电压稳定，当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约0.5-1小时，如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。
3.3染色、脱色
电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心***铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。
弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。
请参阅图3，FK蛋白约35 Kd，His蛋白约0.6 Kd。
4、蛋白浓度测定
4.1制作蛋白标准曲线
1.从-20℃取出冻存的5 mg/ml 蛋白标准（碧云天，P0007），室温完全融化并混匀后备用；
2.按照下表配制0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5 mg/ml蛋白标准品，蛋白标准品和样品均溶于0.9% NaCl，每次稀释时注意充分混匀，得到蛋白标准曲线（见图4）。
表4.蛋白标曲建立
编号 稀释液体积 标准品体积 最终浓度
1 70μl 5 mg/ml BSA 30μl 1.5 mg/ml
2 30μl 从1管取60μl 1 mg/ml
3 20μl 从2管取60μl 0.75 mg/ml
4 30μl 从3管取60μl 0.5 mg/ml
5 60μl 从4管取60μl 0.25 mg/ml
6 60μl 从5管取60μl 0.125 mg/ml
7 60μl 0μl 0 mg/ml
4.2.蛋白浓度测定
1.取5 μl不同浓度蛋白标准加到96孔板的蛋白标准孔中；
2.取5 μl样品到96孔板的样品孔中；
3.各孔加入250 μl G250染色液；
4.用酶标仪测定A595波长的吸光度，在2小时内完成测定；
5.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。
表5.洗脱液中蛋白浓度测定结果
洗脱液批次 浓度（mg/ml）
E1 1.051
E2 2.500
E3 3.000
E4 0.285
E5 0.180
二、建立FK酶动力学检测方法
1.材料和试剂
96孔板
纯化的重组His标签的FK
PK/LDH（PK/LDH enzymes from rabbit muscle）
100 mM PEP (Phospho(enol)pyruvic acid tri(cyclohexylammonium) salt)
1 M KCl；
100 mM ATP；
1 M Tris-HCl（pH 7.5）；
10 mM β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salthydrate (NADH)；
100 mM MgCl2；
1 M KCl；
1、待评估化学物：
a. D-(-)-果糖；
b. D- (+)-葡萄糖；
c. 蔗糖。
2、设备
CLARIOstar 多功能酶标仪
3、程序
1.反应混合物包括100 mM Tris-HCl（pH 7.5），1 mM 果糖，1 mM ATP(现配现用)，100 mM KCl，1.5 mM MgCl2，1 mM PEP，0.5 mM NADH(现配现用)，0.2 µl PK / LDH（使用前储存在-20℃），以及10μl的纯化重组酶，最终反应容量为100 µl。
表6.用于测定 FK 活性的反应混合物的组成
Stock solutions Added in reaction mix (μl)
Tris-HCl (pH 7.5) (1 M) 10
Fructose (20 mM) 4
ATP (100 mM) 1
MgCl<sub>2</sub>(100 mM) 1.5
KCl (1 M) 10
PEP (100 mM) 1
NADH (10 mM) 2
PK/LDH (600-1,500 units/ml) 0.2
FK 10
Ultra-pure water 60.3
4.FK活性检测实验
如图1所示，为了计算所选底物的酶动力学参数，至少在五种不同浓度的底物和固定浓度的ATP存在下进行单独的酶反应。其中，果糖为FK的特异性底物，首先选取两种不同浓度的FK 对果糖进行检测，在体系中浓度范围为0至10 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度250 mM（体系中10mM）开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照。
在CLARIOstar 多功能酶标仪中，通过加入不同浓度底物开始连续测定反应，并通过追踪340 nm处吸光度的变化来测定活性，这对应于NADH向NAD +的转化，该测定在25℃下进行30分钟，得到反应曲线如图5所示。
得到不同浓度果糖检测结果的对应数值输入Graphpad Prism 软件中进行分析，使用line方程的回归线拟合进行分析，确定平均值±标准误差（n=4）（见图5）。
了确定底物特异性，在“材料和试剂”部分中列出的每种底物存在下评估FK活性，根据图6所示实验结果可知纯化的FK只对果糖具有特异性。
三、其它检测领域拓展
为将本发明的检测方法应用于其他样本检测服务，选取目前在医学和健康领域关注度较高的检测项目，如血液、尿液和饮料中果糖含量。
1．血清中果糖含量的检测
为检测血液中果糖含量，使用FBS（胎牛血清）和血浆类似物（r-SBFA）作为溶剂溶解不同浓度果糖，进行样本预处理后，加入已建立的FK检测方法的反应体系中，制作检测标准曲线。
表7.血浆类似物（r-SBFA）配制方法
Reagent Quantity (g/1L) Quantity (g/100ml)
NaCl 5.403 0.540
NaHCO<sub>3</sub> 0.740 0.074
Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 2.046 0.205
KCl 0.225 0.023
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.138 0.014
MgCl<sub>2</sub> 0.143 0.0143
HEPES 11.928 1.193
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>0 0.388 0.039
NaSO<sub>4</sub> 0.072 0.007
BSA 40.000 4.000
(1)样本预处理
血浆类似物（r-SBFA）取45 μl加入1.5 ml EP管中，再加入5 μl不同浓度以血浆类似物（r-SBFA）为溶剂的果糖，每个管中加入 150 μl 在4℃预冷过的甲醇溶液，涡旋混匀5min，-20℃放置60分钟之后离心13000g（4℃，15 min），取上清加入FK的反应体系，检测果糖浓度。
（2）标准曲线建立
预处理的样本上清中，果糖最高浓度设置为100 mM，每孔加入量改为10μl，Ultra-pure water相应改为54.3 μl，加入反应体系中后终浓度为5 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照。
（3）样品检测
选取三个不同浓度的样品（n=3）对本实验方案的精确度进行检测，变异系数（coefficient of variation）较小，实验结果可靠（见图7、8）。
C.v = sd/mean ×100%；
C.V = 变异系数；
SD = 标准差；
Mean = 平均值。
表8.样品检测结果统计分析
样品 Mean SD CV
样品1 274.2553 5.8758 2.1424
样品2 269.6460 10.1771 3.7743
样品3 315.6157 15.7200 4.9807
2.尿液中果糖含量的检测
为检测尿液中果糖含量，使用人工尿液(MP-AU)作为溶剂溶解不同浓度果糖，进行样本处理后，加入已建立的FK检测方法的反应体系中，制作检测标准曲线。
表9.人工尿液(MP-AU)配制方法
试剂 Molarity (mM) Quantity (g/100ml)
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 11.965 0.17
C<sub>5</sub>H<sub>4</sub>N<sub>4</sub>O<sub>3</sub> 1.487 0.025
Na<sub>3</sub>C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>O<sub>7</sub>·2H<sub>2</sub>O 2.45 0.072
C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>N<sub>3</sub>O 7.791 0.0881
CH<sub>4</sub>N<sub>2</sub>O 249.75 1.5
KCl 30.953 0.2308
NaCl 30.053 0.1756
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 1.663 0.0244
NH<sub>4</sub>Cl 23.667 0.1266
K<sub>2</sub>C<sub>2</sub>O<sub>4</sub> 0.19 0.0035
MgSO<sub>4</sub> 4.389 0.0449
NaH2PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 18.667 0.224
Na2HPO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 4.667 0.1653
(1) 人工尿液(MP-AU)配制要点
按上表中提供的顺序将相关试剂添加至100 ml超纯水中，将磁力搅拌器转速设置为500 rpm进行搅拌混匀，在此期间使用搅拌器的加热功能将溶液的温度保持在37.5 ℃。
MP-AU溶液的pH值为在 37℃下24h后将稳定在6.00±0.08左右，因本实验对pH要求严格，所以在实验前24h完成配制。
(1) 标准曲线建立
称取适量果糖溶于人工尿液(MP-AU)，果糖最高浓度设置为100和200 mM，为减少人工尿液(MP-AU)的PH对反应的影响，每孔加入量改为5 μl/10 μl，体系中Ultra-purewater相应改为59.3 μl/54.3 μl，加入反应体系中后终浓度为5 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照。
(2) 样品检测
选取三个不同浓度的样品（n=3）对本实验方案的精确度进行检测，变异系数较小，实验结果可靠，如图9-10所示。
C.v = sd/mean ×100%；
C.V = 变异系数（coefficient of variation）；
SD = 标准差；
Mean = 平均值。
表10.样品检测结果统计分析
样品 Mean SD CV
样品1 123.2997 4.3116 3.4969
样品2 174.0023 3.2593 1.8731
样品3 191.2873 4.3116 2.2540
3.饮料中果糖含量的检测
为检测日常饮料中果糖含量，使用Ultra-pure water作为溶剂溶解不同浓度果糖制作成糖水，作为饮料替代物，进行样本处理后，加入已建立的FK检测方法的反应体系中，制作检测标准曲线。
（1）标准曲线建立
称取适量果糖溶于Ultra-pure water中，果糖最高浓度设置为100 mM，每孔加入量改为10 μl，体系中Ultra-pure water相应改为54.3 μl。加入反应体系中后终浓度为5mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照。
（2）样品检测
选取三个不同浓度的样品对本实验方案的精确度进行检测，变异系数较小，实验结果可靠，如图11所示。
C.V = sd/mean ×100%；
C.V = 变异系数（coefficient of variation）；
SD = 标准差；
Mean = 平均值。
表11.样品检测结果统计分析
样品 Mean SD CV
样品1 244.1710 5.9984 2.4566
样品2 275.4077 1.6296 0.5917
样品3 323.8057 1.6296 0.5033
本方案基于果糖激酶（FK）活性是通过三步法酶动力学法测定原理，并通过以下步骤，步骤一，果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化；步骤二，酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法，基于标准品检测绘制标准曲线及计算样品果糖浓度的计算方法；步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量，实现对果糖的高特异性检测，检测范围较广。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，其特征在于：该检测方法基于果糖激酶FK活性，通过三步法酶动力学法测定的原理，该方法具体通过以下步骤，步骤一，果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化；步骤二，酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法；步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量，实现对果糖的高特异性检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，其特征在于：该检测方法中：
步骤一、果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化包含：
S1、FK蛋白原核表达：
S11、原核表达体系的构建：目的基因按照标准程序合成，使用大肠杆菌表达载体质粒pET-28a，在酶切位点XhoⅠ/NcoⅠ处***FK蛋白基因构建重组表达载体pET-28a-FK，卡那霉素（kan）抗性基因筛选，HIS标签蛋白纯化；
S12、原核重组蛋白的表达与纯化；
步骤二、酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法包含：
S2、建立FK酶动力学检测方法：
待评估化学物：D-(-)-果糖、D- (+)-葡萄糖、蔗糖；
S22、检测设备：CLARIOstar 多功能酶标仪；
S23、设置程序：反应混合物包括100 mM Tris-HCl（pH 7.5），1 mM Fructose，1 mMATP，100 mM KCl，1.5 mM MgCl2，1 mM PEP，0.5 mM NADH，0.2 µl PK / LDH，以及10 μl的纯化重组酶，最终反应容量为100 µl；
S24、FK活性检测实验：首先选取两种不同浓度的FK对果糖进行检测，在体系中果糖浓度范围为0至10 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度250 mM（反应体系中的终浓度为10 mM）开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照，在CLARIOstar 多功能酶标仪中，通过加入不同浓度底物开始连续测定反应，并通过追踪340 nm处吸光度的变化来测定活性，这对应于NADH向NAD +的转化，该测定在25℃下进行30分钟，得到不同浓度果糖检测结果的对应数值输入Graphpad Prism 软件中进行分析，使用线性方程的回归线拟合进行分析，确定平均值±标准误差（n=4）；
步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量：
S3、以血液、尿液和饮料的替代物作为果糖溶剂的实验前处理方法以及酶学检测。
3.根据权利要求2所述的一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，其特征在于：所述步骤S12中原核重组蛋白包括以下步骤：
一、转化到表达菌：
pET-28a-FK质粒加入BL21 （DE 3）感受态中混合，之后按照常规流程转化；
二、批量诱导表达：
挑选单菌落扩增批量表达，抗菌素为卡那霉素，使用IPTG诱导。
4.根据权利要求2所述的一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，其特征在于：用His-tag Purification Resin的标准方法纯化，用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度。
5.根据权利要求2所述的一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，其特征在于：所述步骤S3中血液的血清中果糖含量的检测包括以下步骤：
一、样本预处理：为检测血液中果糖含量，使用FBS（胎牛血清）和血浆类似物（r-SBFA）作为溶剂溶解不同浓度果糖，血浆类似物（r-SBFA）取45μl加入1.5 ml EP管中，再加入5 μl不同浓度以血浆类似物（r-SBFA）为溶剂的果糖,每个管中加入 150 μl 在4℃预冷过的甲醇溶液，涡旋混匀5 min，-20℃放置60分钟之后离心13000g（4℃，15min），取上清加入FK的反应体系，检测果糖浓度；
二、标准曲线建立：预处理的样本上清中，果糖最高浓度设置为100 mM，稀释后反应体系中后终浓度为5 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0mM作为空白对照；
三、样品检测：选取三个不同浓度的样品（n=3）对本实验方案的精确度进行检测。
6.根据权利要求2所述的一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，其特征在于：所述步骤S3中尿液中果糖含量的检测包括以下步骤：
一、配制人工尿液(MP-AU)：按下述顺序将相关试剂添加至100ml超纯水中；
Na2SO4 11.965 mM 0.17 g/100ml
C5H4N4O3 1.487 mM 0.025 g/100ml
Na3C6H5O7·2H2O 2.45 mM 0.072 g/100ml
C4H7N3O 7.791 mM 0.0881 g/100ml
CH4N2O 249.75 mM 1.5 g/100ml
KCl 30.953 mM 0.2308 g/100ml
NaCl 30.053 mM 0.1756 g/100ml
CaCl2·2H2O 1.663 mM 0.0244 g/100ml
NH4Cl 23.667 mM 0.1266 g/100ml
K2C2O4 0.19 mM 0.0035 g/100ml
MgSO4 4.389 mM 0.0449 g/100ml
NaH2PO4·2H2O 18.667 mM 0.224 g/100ml
Na2HPO4·2H2O 4.667 mM 0.1653 g/100ml
二、标准曲线建立：称取适量果糖溶于人工尿液(MP-AU)，果糖最高浓度设置为100 mM，稀释后反应体系中后终浓度为5 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照；
三、样品检测：选取三个不同浓度的样品（n=3）对本实验方案的精确度进行检测。
7.根据权利要求2所述的一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，其特征在于：所述步骤S3中饮料中果糖含量的检测包括以下步骤：
一、标准曲线建立：称取适量果糖溶于Ultra-pure water中，果糖最高浓度设置为100mM，稀释后反应体系中后终浓度为5 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照；
二、样品检测：选取三个不同浓度的样品对本实验方案的精确度进行检测。
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