CN114451511B - 一种抗菌纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明的抗菌纳米颗粒的组成包括玉米醇溶蛋白纳米颗粒和包裹的多酚‑金属配位化合物，多酚‑金属配位化合物由多酚和铁盐进行配位反应得到。本发明的抗菌纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：1)将玉米醇溶蛋白通过反溶剂法制成玉米醇溶蛋白纳米颗粒；2)将玉米醇溶蛋白纳米颗粒加入多酚水溶液中，进行反应，得到多酚修饰的纳米颗粒；3)将多酚修饰的纳米颗粒加入铁盐溶液中，进行配位反应。本发明的抗菌纳米颗粒在近红外光照射下可以通过光热效应快速产生高温，达到短时广谱抗菌效果，生物相容性好，且其制备原料绿色天然、无毒害，在食品抗菌、医疗抗菌等领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及食品抗菌技术领域，具体涉及一种抗菌纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
近几十年来，由于广谱抗生素的大量使用，出现了多重耐药细菌和高毒致病菌，而新型抗生素的开发速度远落后于细菌耐药性的演变速度，导致目前临床使用的抗生素已经难以完全满足要求，开发新的杀菌产品迫在眉睫。
光热抗菌是利用光热剂在适当的光照射下产生的局部热量，通过细胞膜破裂、蛋白质/酶变性、细胞空化和细胞内液体蒸发等多种热效应，有效杀灭细菌的一种物理杀菌方法。贵金属(例如：金、银、钌等)纳米材料具有卓越的光热转化效率，成为了备受关注的光热剂。Ding等人利用带正电的Au-Ag核壳纳米颗粒实现了双光子热效应和银离子的释放，在波长808nm、2W/cm2的近红外激光(NIR)下照射4min，便可以达到杀灭92％的金黄色葡萄球菌的效果。然而，贵金属纳米材料的形状、尺寸等对其光热性能的影响很大，而调控贵金属纳米材料的形状、尺寸和纳米结构往往需要复杂的操作，成本相对较高，且贵金属纳米材料普遍存在长期细胞毒性，以上因素都会严重限制贵金属纳米材料的实际应用。
因此，开发一种杀菌效果好、无毒害、生物相容性好的光热剂具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗菌纳米颗粒及其制备方法和应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种抗菌纳米颗粒，其组成包括玉米醇溶蛋白纳米颗粒和包裹的多酚-金属配位化合物，多酚-金属配位化合物由多酚和铁盐进行配位反应得到。
优选的，所述多酚为单宁酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、原花青素中的一种。
优选的，所述铁盐为硝酸铁、氯化铁、硫酸铁中的至少一种。
优选的，所述抗菌纳米颗粒的粒径为122nm～396nm。
优选的，所述玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为106nm～220nm。
上述抗菌纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
1)将玉米醇溶蛋白通过反溶剂法制成玉米醇溶蛋白纳米颗粒；
2)将玉米醇溶蛋白纳米颗粒加入多酚水溶液中，进行反应，得到多酚修饰的纳米颗粒；
3)将多酚修饰的纳米颗粒加入铁盐溶液中，进行配位反应，即得抗菌纳米颗粒。
优选的，上述抗菌纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
1)将玉米醇溶蛋白通过反溶剂法制成玉米醇溶蛋白纳米颗粒；
2)将玉米醇溶蛋白纳米颗粒加入多酚水溶液中，进行反应，再在水中进行透析，得到多酚修饰的纳米颗粒；
3)将多酚修饰的纳米颗粒加入铁盐溶液中，进行配位反应，再在水中进行透析，即得抗菌纳米颗粒。
优选的，步骤1)中通过反溶剂法制备玉米醇溶蛋白纳米颗粒的具体操作为：将玉米醇溶蛋白溶于乙醇水溶液中，再加入水中并除去乙醇，即可得到玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
进一步优选的，步骤1)中通过反溶剂法制备玉米醇溶蛋白纳米颗粒的具体操作为：将玉米醇溶蛋白溶于乙醇水溶液中，再加入搅拌状态的水中，再进行旋转蒸发除去乙醇，即可得到玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
优选的，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为70％～90％。
进一步优选的，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为80％～90％。
优选的，所述玉米醇溶蛋、乙醇水溶液的添加量比为30mg～50mg:1mL。
优选的，所述旋转蒸发在温度42℃～48℃、旋转速度150r/min～180r/min的条件下进行。
优选的，所述玉米醇溶蛋白、多酚的质量比为1:0.04～0.12。
优选的，步骤2)所述反应的时间为15h～40h。
进一步优选的，步骤2)所述反应的时间为20h～30h。
优选的，所述多酚、铁盐的摩尔比为0.2～2:1。
优选的，步骤3)所述配位反应在避光条件下进行。
优选的，步骤3)所述配位反应的时间为2h～10h。
进一步优选的，步骤3)所述配位反应的时间为2h～6h。
本发明的有益效果是：本发明的抗菌纳米颗粒在近红外光(NIR)照射下可以通过光热效应快速产生高温，达到短时广谱抗菌效果，生物相容性好，且其制备原料绿色天然、无毒害，在食品抗菌、医疗抗菌等领域具有广阔的应用前景。
具体来说：
1)本发明先通过多酚修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒，再进行多酚与铁离子的螯合，形成多酚-金属配位化合物，并用其对玉米醇溶蛋白纳米颗粒进行紧密包裹，得到具有短时广谱抗菌效果的抗菌纳米颗粒；
2)本发明的抗菌纳米颗粒是由绿色天然、可食用的多酚制成，无毒害，生物相容性好，且多酚还可以提高抗菌纳米颗粒的稳定性和活性；
3)本发明的抗菌纳米颗粒是利用吸收红外线自发产生高热量的原理使菌体破裂，从而达到高效广谱杀菌的效果，其对于耐药菌同样具有较强的抗菌性，可以有效抑制耐药菌的生长；
4)本发明的抗菌纳米颗粒的制备方法简单，制备条件温和，适合进行大规模生产应用。
附图说明
图1为实施例1的抗菌纳米颗粒的粒径分布图和FE-SEM图。
图2为实施例1～5的抗菌纳米颗粒和对比例的多酚修饰的纳米颗粒的光热响应效果图。
图3为实施例1～5的抗菌纳米颗粒和对比例的多酚修饰的纳米颗粒对大肠杆菌的光热杀菌效果图。
图4为实施例1～5的抗菌纳米颗粒和对比例的多酚修饰的纳米颗粒对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的光热杀菌效果图。
图5为实施例1～3的抗菌纳米颗粒和对比例的多酚修饰的纳米颗粒的食品介质抗菌效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1：
一种抗菌纳米颗粒，其制备方法包括以下步骤：
1)将1g的玉米醇溶蛋白溶于20mL的乙醇水溶液(乙醇的体积分数为80％)中，再加入到搅拌状态的50mL的去离子水中，再在温度45℃、旋转速度150r/min的条件下进行旋转蒸发除去乙醇，得到玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液(浓度为40mg/mL，玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为106nm～220nm)；
2)将玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液加入10mL浓度为4mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)水溶液中，常温反应24h，再在4℃下用去离子水透析48h，得到多酚修饰的纳米颗粒；
3)将多酚修饰的纳米颗粒加入10mL浓度为2.4mg/mL的氯化铁溶液中，室温下避光搅拌2h，再在4℃下用去离子水透析24h，即得抗菌纳米颗粒(粒径为122nm～255nm)。
本实施例的抗菌纳米颗粒的粒径分布图和场发射扫描电镜(FE-SEM)图如图1(左上角的小图为FE-SEM图)所示。
粒径分布测试：将抗菌纳米颗粒用去离子配制成浓度1mg/mL的分散液，取适量体积置于比色皿中采用动态光散射纳米粒度仪(Nano-ZS，Malvern)测定颗粒的粒径，测定结果取三次测量的平均值。
场发射扫描电镜测试：将导电胶粘贴在不锈钢导电台上，并以此固定云母片，取10μL浓度为0.1mg/mL的抗菌纳米颗粒分散液均匀滴加在云母片上，自然风干，再进行喷金处理后在扫描电镜下观察，加速电压为5.0kV。
由图1可知：本实施例的抗菌纳米颗粒呈表面光滑、大小均一的圆球形，平均粒径为179.57nm±0.33nm，颗粒粒径集中分布在122nm～255nm之间。
实施例2：
一种抗菌纳米颗粒，其制备方法包括以下步骤：
1)将1g的玉米醇溶蛋白溶于20mL的乙醇水溶液(乙醇的体积分数为80％)中，再加入到搅拌状态的50mL的去离子水中，再在温度45℃、旋转速度150r/min的条件下进行旋转蒸发除去乙醇，得到玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液(浓度为40mg/mL，玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为106nm～220nm)；
2)将玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液加入10mL浓度为8mg/mL的EGCG水溶液中，常温反应24h，再在4℃下用去离子水透析48h，得到多酚修饰的纳米颗粒；
3)将多酚修饰的纳米颗粒加入10mL浓度为4.8mg/mL的氯化铁溶液中，室温下避光搅拌2h，再在4℃下用去离子水透析24h，即得抗菌纳米颗粒(粒径为142nm～295nm)。
实施例3：
一种抗菌纳米颗粒，其制备方法包括以下步骤：
1)将1g玉米醇溶蛋白溶于20mL的乙醇水溶液(乙醇的体积分数为80％)中，再边搅拌边加入去离子水至玉米醇溶蛋白沉淀出来，再在温度45℃、旋转速度150r/min的条件下进行旋转蒸发除去乙醇，得到玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液(浓度为40mg/mL，玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为106nm～220nm)；
2)将玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液加入10mL浓度为12mg/mL的EGCG水溶液中，常温反应24h，再在4℃下用去离子水透析48h，得到多酚修饰的纳米颗粒；
3)将多酚修饰的纳米颗粒加入10mL浓度为7mg/mL的氯化铁溶液中，室温下避光搅拌2h，再在4℃下用去离子水透析24h，即得抗菌纳米颗粒(粒径为190nm～396nm)。
实施例4：
一种抗菌纳米颗粒，其制备方法包括以下步骤：
1)将1g玉米醇溶蛋白溶于20mL的乙醇水溶液(乙醇的体积分数为80％)中，再加入到搅拌状态的50mL的去离子水中，再在温度45℃、旋转速度150r/min的条件下进行旋转蒸发除去乙醇，得到玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液(浓度为40mg/mL，玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为106nm～220nm)；
2)将玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液加入10mL浓度为8mg/mL的EGCG水溶液中，常温反应24h，再在4℃下用去离子水透析48h，得到多酚修饰的纳米颗粒；
3)将多酚修饰的纳米颗粒加入10mL浓度为2.4mg/mL的氯化铁溶液中，室温下避光搅拌2h，再在4℃下用去离子水透析24h，即得抗菌纳米颗粒(粒径为142nm～295nm)。
实施例5：
一种抗菌纳米颗粒，其制备方法包括以下步骤：
1)将1g玉米醇溶蛋白溶于20mL的乙醇水溶液(乙醇的体积分数为80％)中，再加入到搅拌状态的50mL的去离子水中，再在温度45℃、旋转速度150r/min的条件下进行旋转蒸发除去乙醇，得到玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液(浓度为40mg/mL，玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为106nm～220nm)；
2)将玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液加入10mL浓度为8mg/mL的EGCG水溶液中，常温反应24h，再在4℃下用去离子水透析48h，得到多酚修饰的纳米颗粒；
3)将多酚修饰的纳米颗粒加入10mL浓度为9.5mg/mL的氯化铁溶液中，室温下避光搅拌2h，再在4℃下用去离子水透析24h，即得抗菌纳米颗粒(粒径为142nm～295nm)。
对比例：
一种多酚修饰的纳米颗粒，其制备方法包括以下步骤：
1)将1g玉米醇溶蛋白溶于20mL的乙醇水溶液(乙醇的体积分数为80％)中，再加入到搅拌状态的50mL的去离子水中，再在温度45℃、旋转速度150r/min的条件下进行旋转蒸发除去乙醇，得到玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液(浓度为40mg/mL，玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为106nm～220nm)；
2)将玉米醇溶蛋白纳米颗粒水分散液加入10mL浓度为8mg/mL的EGCG水溶液中，常温反应24h，再在4℃下用去离子水透析48h，得到多酚修饰的纳米颗粒。
性能测试：
1)光热响应测试：将实施例1～5的抗菌纳米颗粒和对比例的多酚修饰的纳米颗粒分别加水配制成浓度4mg/mL(zein浓度)的分散液，再取500μL分散液置于容积为5mL的离心管中，再用近红外光(波长为808nm，功率密度为1.5W/cm2)垂直照射离心管10min，以60s的间隔通过红外热像仪记录溶液的温度变化，得到的光热响应测试结果如图2所示。
由图2可知：
a)对比例的多酚修饰的纳米颗粒用近红外光垂直照射10min后温度无明显升高，而实施例1～5的抗菌纳米颗粒均有显著的升温现象，说明单纯多酚修饰的纳米颗粒无法在近红外光照射下产生热量使温度升高，实施例1～5的抗菌纳米颗粒所具备的优良光热性能是引入铁离子后形成的配位物所赋予的；
b)实施例1～3的抗菌纳米颗粒用近红外光垂直照射10min后温度分别达到了42.9℃、59.1℃和64.8℃，说明在多酚、铁离子摩尔比一致的前提下，同步提高配位物整体(即多酚和氯化铁)的添加量，体系的光热响应性能得到显著提升，且其光热效果在一定范围内与配位物整体的添加量成正比；
c)实施例4和实施例5的抗菌纳米颗粒用近红外光垂直照射10min后温度分别达到了52.9℃和62.0℃，说明在多酚添加量一致的条件下，降低多酚、铁离子的摩尔比后，颗粒的光热性能和杀菌效果表现出一定程度上的增强，能够在控制成本的基础上获得更好的抗菌效果。
2)光热杀菌效果测试(平板菌落计数实验)：
a)取5mL培养至对数期的大肠杆菌(EC)培养液，4000r/min离心10min，分离出菌泥，水洗两次，用无菌水重悬制成浓度为107CFU/mL的菌悬液，再取150μL的菌悬液加入等体积的实施例1的抗菌纳米颗粒水分散液(浓度为4mg/mL)，混合均匀，先在近红外光(波长为808nm，功率密度为1.5W/cm2)中静置孵育10min，再在黑暗环境中静置孵育10min，作为光照组(标记为NIR+)，同时取150μL的菌悬液加入等体积的实施例1的抗菌纳米颗粒水分散液(浓度为4mg/mL)，混合均匀，在黑暗环境中静置孵育20min，作为无光照组(标记为NIR-)，空白对照采用无菌水代替抗菌纳米颗粒水分散液；
b)用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)培养液进行同样的操作，再将菌悬液稀释至浓度为104CFU/mL，取100μL均匀涂布于LB平板上，置于恒温培养箱中37℃培养24h，观察记录并进行平板菌落计数，通过log10(CFU/mL)计算不同条件处理后细菌的存活量，每个待试样品重复三次，对实施例2～5的抗菌纳米颗粒和对比例的多酚修饰的纳米颗粒进行同样的测试，得到的实施例1～5的抗菌纳米颗粒和对比例的多酚修饰的纳米颗粒对大肠杆菌的光热杀菌效果图如图3所示，实施例1～5的抗菌纳米颗粒和对比例的多酚修饰的纳米颗粒对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的光热杀菌效果图如图4所示。
由图3和图4可知：
对比例的多酚修饰的纳米颗粒作用的细菌在NIR+处理后，菌落数量与NIR-处理、空白对照处理的结果无显著差别，说明单纯多酚修饰的纳米颗粒的抗菌效果不明显，而实施例1的抗菌纳米颗粒作用的细菌在NIR+处理后EC和MRSA的log10(CFU/mL)值分别相较空白对照约下降了0.12和0.67，实施例2的抗菌纳米颗粒作用的细菌在NIR+处理的MRSA未生长，EC略有菌落生长，其log10(CFU/mL)值下降至3.56±0.36，实施例3的抗菌纳米颗粒作用的细菌在NIR+处理的EC和MRSA均完全没有出现菌落生长，实施例4的抗菌纳米颗粒作用的细菌在NIR+处理后EC和MRSA的log10(CFU/mL)值分别相较空白对照约下降了0.52和2.41，实施例5的抗菌纳米颗粒作用的细菌在NIR+处理后的EC和MRSA则完全没有出现菌落生长。由此可见，实施例1～5的抗菌纳米颗粒对于MRSA的杀菌效果普遍优于EC，展现出对于耐药菌优异的杀菌性能。此外，相同NIR处理时间下，抗菌纳米颗粒的杀菌效果与其光热响应温度呈正相关性，充分说明抗菌纳米颗粒优良的抗菌效果源于其光热响应性能。
3)食品基质抗菌效果测试：取5mL培养至对数期的MRSA培养液，4000r/min离心10min，分离出菌泥，水洗两次，用无菌水重悬制成浓度为107CFU/mL的菌悬液，再取大小规格为2cm×2cm×1cm的新鲜牛肉，在其表面上分别加入15μL的菌悬液和等体积的实施例1的抗菌纳米颗粒水分散液(浓度为4mg/mL)，混合均匀，先在近红外光(波长为808nm，功率密度为1.5W/cm2)中静置孵育10min，再在黑暗环境中静置孵育10min，作为光照组(标记为NIR+)，再取大小规格为2cm×2cm×1cm的新鲜牛肉，在其表面上加入15μL的菌悬液和等体积的实施例1的抗菌纳米颗粒水分散液(浓度为4mg/mL)，混合均匀，再在黑暗环境中静置孵育20min，作为无光照组(标记为NIR-)，空白对照采用无菌水代替抗菌纳米颗粒水分散液，再将牛肉分别装入盛有15mL的LB肉汤培养基的锥形瓶中，置于恒温气浴摇床中37℃下振荡培养7h，再取100μL稀释1000倍的培养液，均匀涂布于LB肉汤琼脂培养基上，并将平板置于恒温培养箱中37℃培养24h，观察记录并进行平板菌落计数，测定细菌存活率，每个待试样品重复三次，对实施例2～3的抗菌纳米颗粒和对比例的多酚修饰的纳米颗粒进行同样的测试，得到的实施例1～3的抗菌纳米颗粒和对比例的多酚修饰的纳米颗粒的食品介质抗菌效果图如图5所示。
细菌存活率计算公式如下：细菌存活率(％)＝样品处理组平板菌落数/空白对照组平板菌落数×100％。
由图5可知：对比例的多酚修饰的纳米颗粒作用的MRSA，处理后的细菌存活率没有降低的迹象，而实施例1～3的抗菌纳米颗粒经NIR+处理后，其作用的MRSA细菌存活率分别降低至31.31％±0.64％、0.57％±0.20％和0.08％±0.06％，说明抗菌纳米颗粒在食品介质中仍然保有良好的抗菌效果，在食品生产、包装过程中具备作为绿色天然、效果优质的短时广谱抗菌剂的发展潜力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种抗菌纳米颗粒，其特征在于，其组成包括玉米醇溶蛋白纳米颗粒和包裹的多酚-金属配位化合物；所述多酚-金属配位化合物由多酚和铁盐进行配位反应得到；所述多酚为单宁酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、原花青素中的一种；所述抗菌纳米颗粒的粒径为122nm～396nm；所述玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径为106nm～220nm；所述抗菌纳米颗粒是由包括以下步骤的制备方法制成：1）将玉米醇溶蛋白通过反溶剂法制成玉米醇溶蛋白纳米颗粒；2）将玉米醇溶蛋白纳米颗粒加入多酚水溶液中，常温下进行反应，再用去离子水透析，得到多酚修饰的纳米颗粒；3）将多酚修饰的纳米颗粒加入铁盐溶液中，室温下避光进行配位反应，再用去离子水透析，即得抗菌纳米颗粒；所述玉米醇溶蛋白、多酚的质量比为1:0.04～0.12；所述多酚、铁盐的摩尔比为0.2～2:1。
2.根据权利要求1所述的抗菌纳米颗粒，其特征在于：所述铁盐为硝酸铁、氯化铁、硫酸铁中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的抗菌纳米颗粒，其特征在于：步骤1）中通过反溶剂法制备玉米醇溶蛋白纳米颗粒的具体操作为：将玉米醇溶蛋白溶于乙醇水溶液中，再加入水中并除去乙醇，即可得到玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
4.权利要求1～3中任意一项所述的抗菌纳米颗粒在制备光热剂中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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