CN114423857A - 由视网膜组织制成的空心三维单元及其在治疗视网膜病变中的用途 - Google Patents

由视网膜组织制成的空心三维单元及其在治疗视网膜病变中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及空心的三维组织单元，当绕内部开口组织时，其包括至少一层分化的活人视网膜色素上皮细胞，每个细胞的基面朝外，而顶面朝向所述内部开口。本发明还涉及用于治疗视网膜病变的这些组织单元，以及一种用于制备这些组织单元的方法和植入试剂盒。

Description

由视网膜组织制成的空心三维单元及其在治疗视网膜病变中 的用途
技术领域
本发明涉及视网膜疾病的治疗，特别是通过使用包括至少一种视网膜色素上皮的特定组织单元。本发明还涉及一种用于制备这些组织单元的方法和用于将这些组织单元植入到眼睛中以进行全部或部分视网膜移植的试剂盒。
背景技术
视网膜疾病或视网膜病变是世界上视力障碍的主要原因之一。位于眼睛后部的视网膜特别由色素上皮细胞和接收光的神经细胞构成。这些神经细胞将光转化为经由视神经传到大脑的电信号。当视网膜细胞，特别是视网膜色素上皮细胞退化或停止运作时，会出现视野盲区。
视网膜病变可能有多种来源：特别地，它们可能与衰老有关，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)；可能是遗传性的，例如视网膜色素变性或视网膜营养不良；可能与外伤有关，例如日光性视网膜病变；或可能源自另一种病理，例如糖尿病性视网膜病变或高血压性视网膜病变。
AMD是老年人视力障碍的主要原因。这种病理是由于黄斑损伤所致，黄斑是视网膜的中心区域，它将大部分视觉信息传输到大脑。它导致在视野中心出现盲点。AMD可以以两种形式呈现：
-干性或萎缩性形式：其特征是黄斑细胞逐渐消失。因此，它发展缓慢，是最常见的AMD形式；
-湿性或渗出性形式：其特征是在视网膜下形成异常血管，这特别导致视网膜脱离。
目前没有针对干性形式AMD的治疗方案。唯一的方法是通过服用食品补充剂(维生素C和E以及抗氧化矿物质)来延缓。几年来，对于湿性AMD，如果疾病不是处于太晚期，向眼睛中注射一种阻断血管增殖的药物可以改善疾病，但这种治疗需要每月注射，并且不能获得完全令人满意的结果。
视网膜色素变性是一种可以遗传的遗传性疾病。其特征是与一个或多个基因的突变相关的视网膜细胞的退化。疾病的发展很缓慢，直到导致失明；目前没有治疗方案。
糖尿病性视网膜病变是在糖尿病背景下发生的视网膜损伤。这与视网膜的小血管中的糖分浓度过高有关，这会导致小血管的退化。氧气供应的缺乏会诱导新的、更脆弱的血管的形成。这些血管的破裂和随后的微出血可能导致视网膜脱离。至于湿性形式AMD，可以进行抗血管生成药物的注射，但这种治疗效果不佳。也可以进行激光治疗以烧毁异常血管，但效果有限。
最近，已经描述了以治疗视网膜疾病为目的的新的治疗方法。
最近的治疗试验探索了放置视网膜植入物(人工视网膜)的可能性，但这种植入物的分辨率仍然很低。
还已经进行了以用能够分化成视网膜上皮细胞、神经细胞或血管细胞(hRPC或人视网膜祖细胞)的干细胞替代退化的视网膜细胞为目的的细胞疗法试验。然而，迄今为止，还没有任何试验得出结论，特别是植入之后的细胞分化不受控制，并且作为所测试的施用途径的玻璃体内注射不符合生理机制，这已经导致了不期望的副作用(https:// clinicaltrials.gov/ct2/show/results/NCT02320182)。此外，这些祖细胞存在于人类体内，不允许成体视网膜的再生(Tang等人，“针对视网膜变性的基于干细胞/祖细胞的疗法的进展(Progress of stem/progenitor cell-based therapy for retinaldegeneration)”,《转化医学杂志(Journal of Translational Medicine)》,2017年5月10日)。
此外，已经描述了用作植入物的视网膜细胞膜或膜片。申请US20160310637或申请EP2570139就是这种情况，其公开了从取自人类的和培养的视网膜细胞获得的视网膜细胞膜或膜片，所述膜或膜片旨在植入眼睛中。然而，这项技术并不令人满意，因为它需要产生涉及移植细胞的数量的极大量的细胞(生产8批以进行质量控制，并且每批中的大多数细胞都没有定位在植入物上)，此外，植入需要漫长而复杂的手术，这需要医生具备特定的移植专业知识；并且植入对患者的侵入性很大。
申请EP3211071还描述了获自多能干细胞的聚集体悬浮液形式的视网膜组织。然后，将悬浮液注射到眼睛中。本解决方案也不令人满意，因为注射不能维持功能结构化(尤其是功能极化)：i)在色素上皮的情况下，即细胞的顶面必须面向移植物的光感受器的外节，移植物的存活和功能受到限制；ii)在光感受器的情况下，外节必须朝向眼睛的外侧定位，与色素上皮细胞相反，并且突触终端终止必须面向眼睛的中心以连接神经视网膜的其余部分。此外，本技术需要将大量液体注射到眼睛中，并且与现有技术的所有其它解决方案一样，会导致视网膜在比待治疗区域更大的区域上明显脱离，并伴有在切开或注射期间引起局部出血的风险。当前的解决方案还需要作出三个或四个切口，如Zarbin等人(“简明综述：针对年龄相关性黄斑变性的视网膜色素上皮移植的最新进展(Concise Review:Updateon Retinal Pigment Epithelium Transplantation for Age-Related MacularDegeneration)”,《干细胞转化医学(Stem Cells Translational Medicine)》,2019；8:466-477)中所述。
本发明的目的是克服现有技术的这些各种问题，并且提出一种简单、快速和微创植入正确极化的视网膜细胞并将它们整合到宿主器官中以以持久且可靠的方式替代患有视网膜退行性病变的患者中的退化视网膜细胞的解决方案。
发明内容
根据本发明，视网膜组织移植的有效性在很大程度上取决于移植物经由布鲁赫膜处的色素上皮细胞的基面的粘附的适当原位结合(特别是正确的顶面-基面极化)。因此，为了满足本发明的目的，发明人开发了特定的空心三维细胞阵列，其包括围绕腔组织的至少一层视网膜色素上皮细胞，所述视网膜色素上皮细胞的基面朝外。本组织单元优选还包括视网膜色素上皮细胞的基面上的细胞外基质外层，一旦注射到眼睛中，其促进细胞的整合和存活。根据本发明的组织单元还可以含有其它视网膜细胞，其在视网膜色素上皮细胞层内以一层或多层的形式组织在内腔中，即在视网膜色素上皮细胞的顶面上。这些其它细胞优选形成全部或部分视网膜神经组织。
因此，本发明涉及一种空心三维组织单元，其包括围绕内腔组织的至少一层视网膜色素上皮细胞，每个视网膜色素上皮细胞的基面朝外，而顶面朝向内腔。根据本发明的组织单元优选为空心卵形体、空心圆柱体、空心椭球体或空心球体或这些元件沿某一平面的截面的形式。
本发明还涉及此空心三维组织在治疗视网膜疾病中的用途，特别是通过在布鲁赫膜处植入到眼睛中。
有利地，由于移植是用根据本发明的、经组织的和亚毫米大小的视网膜组织单元进行的，所以所述程序不需要像现有技术中那样精确定位单个移植物。这限制了(可能是外伤性的)视网膜脱离的需要，并且因此也限制了从眼睛排出玻璃体液的强度。此外，与当今的三个或四个切口相比，本发明具有能够将外科手术限制为单个眼睛切口的优点。
此外，视网膜色素上皮层的极化(基面朝外，而顶面朝向内腔)使视网膜组织单元在他们被移植到眼睛中时能够正确定位并确保移植成功。实际上，由于它们的基面定位在外侧上，因此根据本发明的视网膜组织单元通过发射粘附到基底的细胞而附着到眼睛后部的细胞外基质(布鲁赫膜)，所述细胞迁移并形成单层。
本发明还涉及一种用于制备空心三维视网膜组织单元的方法，其包括以下步骤：
-产生细胞微区室，所述细胞微区室在水凝胶包膜内包括：
*视网膜色素上皮细胞和任选的其它视网膜细胞，或
*能够分化成视网膜色素上皮细胞并可能分化成其它视网膜细胞的细胞，
-如果微区室含有能够分化成视网膜色素上皮细胞并可能分化成其它视网膜细胞的细胞：诱导细胞微区室内的细胞分化，以获得视网膜色素上皮细胞和可能的其它视网膜细胞，
-去除水凝胶包膜，以以组织单元的形式恢复视网膜色素上皮细胞和任何其它视网膜细胞。
最后，本发明还涉及一种用于将空心三维组织单元植入到眼睛中的试剂盒，所述试剂盒至少包括：
-1至10,000个组织单元，其任选地包封在水凝胶包膜中，和
-能够将所述组织单元植入到人眼中的外科植入装置。
附图说明
-图1：图1是根据本发明的组织单元10的横截面视图的示意图，其具有视网膜色素上皮层12和内腔14，其中A对应于视网膜色素上皮细胞的顶面，而B对应于视网膜色素上皮细胞的基面。
-图2：图2是根据本发明的组织单元10的横截面视图的示意图，其具有视网膜色素上皮层12、腔14和细胞外基质层16，其中A对应于视网膜色素上皮细胞的顶面，而B对应于视网膜色素上皮细胞的基面。
-图3：图3是根据本发明的包括水凝胶包膜22和组织单元10的微区室20的横截面视图的示意图，组织单元10由色素上皮层12、腔14和细胞外基质层16形成，其中A对应于视网膜色素上皮细胞的顶面，而B对应于视网膜色素上皮细胞的基面。
-图4：图4是根据本发明的包括水凝胶包膜22和组织单元10的微区室20的横截面视图的示意图，组织单元10由细胞外基质层16、视网膜色素上皮层12、一层视网膜色素上皮细胞18以外的视网膜细胞和空腔14形成，其中A对应于视网膜色素上皮细胞的顶面，而B对应于视网膜色素上皮细胞的基面。
-图5：图5示出了包封根据本发明的组织单元的水凝胶(藻酸盐)微区室的显微图像。
-图6：图6示出了包封根据本发明的小组织单元(A)和根据本发明的大组织单元(B)的水凝胶(藻酸盐)微区室的显微图像。
-图7：图7示出了包封具有不同细胞密度的一个或多个根据本发明的组织单元的水凝胶(藻酸盐)微区室的显微图像。
-图8：图8示出了在形成视网膜色素上皮单层之前的不同时间处的基底上的没有水凝胶包膜的根据本发明的视网膜组织单元，所述基底模拟眼底的细胞外基质(此处为基底胶模拟布鲁赫膜)。
-图9：图9示出了显微图像和示出了可以通过在藻酸盐包膜的内面上沉积基质层而获得的细胞极化的图。
具体实施方式
定义
在本发明的意义上，术语“藻酸盐”是指由β-D-甘露糖醛酸盐和α-L-古洛糖醛酸盐、其盐和衍生物形成的直链多糖。
在本发明的意义上，术语“水凝胶包膜”是指由聚合物链的基质形成的三维结构，用液体，优选水溶胀。
在本发明的意义上，术语“人细胞”是指人细胞或免疫人源化的非人类哺乳动物细胞。即使没有指定，根据本发明的细胞、干细胞、祖细胞和组织是由人细胞或免疫人源化的非人类哺乳动物细胞形成的或从其获得的。
在本发明意义上，术语“祖细胞”是指已经参与细胞分化成视网膜细胞但尚未分化的干细胞。
在本发明的意义上，术语“胚胎干细胞”是指来源于胚泡的内细胞团的多能干细胞。胚胎干细胞的多能性可以通过转录因子OCT4和NANOG等标志物以及SSEA3/4、Tra-1-60和Tra-1-81等表面标志物的存在来评估。根据本发明的胚胎干细胞是在不破坏它们所来源于的胚胎的情况下获得的，例如使用Chang等人(《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》,2008,2(2)):113-117)中描述的技术。来自人类的胚胎干细胞可能被排除在外。
在本发明的意义上，术语“多能干细胞”或“多能细胞”是指具有形成整个原始生物体中存在的所有组织的能力但不能形成整个生物体本身的细胞。特别地，它们可以是诱导多能干细胞、胚胎干细胞或MUSE(多系分化持续应激)细胞。
在本发明的意义上，术语“诱导多能干细胞”是指通过对分化体细胞进行遗传重编程而被诱导成多能性的多能干细胞。这些细胞特别是多能性标志物阳性，例如碱性磷酸酶染色和蛋白质NANOG、SOX2、OCT4和SSEA3/4的表达。用于获得诱导多能干细胞的方法的实例描述于Yu等人(《科学(Science)》,2007,318(5858):1917-1920)、Takahashi等人(《细胞(Cell)》,207,131(5):861-872)和Nakagawa等人(《自然生物技术(Nat Biotechnol)》,2008,26(1):101-106)中。
在本发明的意义上，术语“分化”细胞是指表现出与未分化的多能干细胞相反的特定表型的细胞。
组织单元的术语“费雷特直径”是指所述组织单元的两条切线之间的距离“d”，这两条切线平行，使得组织单元的整个投影包含在这两条平行切线之间。
在本发明的意义上，术语“植入”或“移植”到眼睛中是指在特定位置处将至少一个根据本发明的组织单元沉积在眼睛中的动作。植入可以通过任何手段执行，特别是通过注射。
在本发明的意义上，组织单元的术语“最大尺寸”是指所述组织单元的最大费雷特直径的值。
在本发明的意义上，组织单元的术语“最小尺寸”是指所述组织单元的最小费雷特直径的值。
根据本发明的术语“组织单元”或“视网膜组织单元”是指包括至少一种视网膜组织的单元。视网膜组织单元可以包括通过功能结构化组装在一起的多种视网膜组织。根据本发明的组织单元包括至少一种视网膜色素上皮组织，并且还可以含有另一种视网膜组织，特别是视网膜神经组织或视网膜血管组织，和/或至少一种其它成分，例如细胞外基质。
组织单元
本发明此后涉及一种三维视网膜组织单元。
根据本发明的组织单元是空心的。它总是包括构成组织单元的空心部分的内腔或腔体。本腔是在通过视网膜细胞增殖和生长而形成组织单元时产生的。所述腔含有液体，特别是培养基(例如，基于DMEM或DMEM-F12和/或神经基础(Neurobasal)并补充有B27或N-2或NS21的培养基)和/或由组织单元的细胞分泌的液体。有利地，本空心部分在视网膜组织单元中的存在允许在植入到眼睛中时更好地整合到视网膜中。
根据本发明的组织单元包括至少一层视网膜色素上皮细胞。这些细胞是分化成视网膜色素上皮细胞的人活细胞。所述一层视网膜上皮细胞围绕内腔组织。形成本层的细胞共同形成视网膜色素上皮，它们的基面都朝向细胞单元的外侧，而它们的顶面都朝向内侧，即朝向内腔。并列的单元优选在它们的侧面上通过紧密联接连接在一起。
根据一个特别合适的实施例，根据本发明的组织单元还包括细胞外基质外层。本细胞外基质外层位于视网膜色素上皮细胞的基面上。细胞基质层可以由视网膜色素上皮细胞分泌的细胞基质和/或在制备细胞单元时加入的细胞外基质形成。
细胞外基质层可以形成凝胶。它包括培养视网膜色素上皮细胞所必需的蛋白质和细胞外化合物的混合物。优选地，细胞外基质包括结构蛋白，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、玻连蛋白和生长因子，例如TGF-β和/或EGF。细胞外基质层可以包括
Figure BDA0003551128850000071
和/或
Figure BDA0003551128850000072
和/或植物来源的水凝胶型基质，例如改性藻酸盐，或合成来源的水凝胶型基质或聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚(乙二醇)共聚物(PNIPAAm-PEG)型
Figure BDA0003551128850000073
或由其组成。
在与视网膜色素上皮层接触的细胞外基质层的表面处，细胞外基质可以任选地含有一种或多种视网膜色素上皮细胞。
当存在细胞外基质时，围绕内腔三维组织的视网膜细胞有利地已经与细胞外基质相互作用，这有助于它们在视网膜处的植入。
根据本发明的组织单元可以包括一层或多层视网膜色素上皮细胞以外的其它视网膜细胞。这些细胞是人细胞，它们是活的并且分化成视网膜色素上皮细胞以外的视网膜细胞。所述一层或多层视网膜色素上皮细胞以外的视网膜细胞层布置在视网膜上皮细胞层内，即在视网膜色素上皮细胞的顶面上，围绕腔体组织。
在一个实施例中，视网膜色素上皮细胞以外的视网膜细胞选自视杆细胞、视锥细胞、神经节细胞、无长突细胞、双极细胞和水平细胞。
当细胞单元包括至少两层视网膜色素上皮细胞以外的视网膜细胞时，不同的层围绕内腔依次组织。
优选地，根据本发明的组织单元含有10至100,000个视网膜细胞。
根据本发明的一个特定实施例，如图1中所示，空心三维视网膜组织单元10仅由以下组成：
-内腔14，和
-围绕内腔组织的视网膜色素上皮层12，其中视网膜色素上皮细胞的基面B朝向组织单元的外侧，而视网膜色素上皮细胞的顶面A朝向内腔。
根据本发明的另一个特定实施例，如图2中所示，空心三维视网膜组织10仅由以下形成：
-内腔14，
-围绕内腔组织的视网膜色素上皮层12，其中视网膜色素上皮细胞的基面B朝向组织单元的外侧，而视网膜色素上皮细胞的顶面A朝向内腔，和
-在所述视网膜色素上皮细胞的基面上围绕所述一层视网膜色素上皮细胞设置的细胞外基质层16。
构成根据本发明的组织单元的各种分化细胞，无论在哪个实施例中，都可以任选地获自多能干细胞，特别是人多能干细胞，或者可以任选地从诸如例如成纤维细胞或外周血单核细胞的成体细胞直接重编程。
根据本发明的组织单元可以为任何三维形式，即它可以具有空间中任何物体的形状。优选地，根据本发明的组织单元为空心卵形体、空心圆柱体、空心椭球体或空心球体的形式。它是组织单元的外层，即视网膜色素上皮层或细胞外基质层(当存在时)，其为根据本发明的组织单元赋予了其大小和形状。
优选地，根据本发明的组织单元的最大尺寸小于1cm，甚至更优选小于0.5cm。根据一个合适且优选的实施例，根据本发明的组织单元的最大尺寸介于100和1,000μm之间。它也可以介于200和1,000μm之间或300和1,000μm之间。这种尺寸确保容易植入到眼睛中，特别是通过注射，因为最大尺寸不应太大而不能通过非常小的先前切口进行植入。尺寸越大，在眼睛中作出的切口就越大，并且重要的是，尽可能限制切口的大小，以便限制风险和对治疗患者的影响。优选地，组织单元的最小尺寸小于1,000μm。根据一个实施例，它介于10和1,000μm之间，优选介于100和400μm之间，甚至更优选介于200和300μm之间。这种较小的尺寸对于移植物在体外的存活很重要，对促进视网膜组织单元内的视网膜细胞的存活并优化组织单元在植入到眼睛中之后的重组和血管化尤为重要。
组织单元中视网膜色素上皮细胞层的厚度优选地介于5μm和200μm之间。当根据本发明的组织单元包括一层或多层不是视网膜色素上皮细胞的其它视网膜细胞时，如果存在多于一层，则这一层或这些层一起优选地具有介于20μm和500μm之间的厚度。当根据本发明的组织单元中存在细胞外基质外层时，本细胞外基质外层的厚度优选地介于30mm和500mm之间。
腔优选地占根据本发明的组织单元的体积的10％至90％。
根据本发明的视网膜组织单元特别可用作人类眼睛中的可植入移植物，特别是用于治疗视网膜疾病。根据本发明的视网膜细胞单元的形状、大小和构造允许组织单元内的细胞在植入之前存活，并且允许移植物在植入到眼睛中时的成功植入、重组和血管化。
在植入之前，组织单元可以任选地包封在水凝胶包膜中，组织单元优先在水凝胶包膜中制备。在这种情况下，水凝胶包膜优选地在植入到眼睛中之前去除。
根据本发明的组织单元可以在植入之前冷冻储存。
植入试剂盒
本发明还涉及一种用于植入至少一个组织单元的试剂盒。
根据本发明的植入试剂盒至少包括：
-1至10,000个根据本发明的组织单元，所述组织单元任选地包封在水凝胶包膜中，
-任选的水凝胶包膜去除手段，在包膜单元包封在水凝胶包膜中的情况下，
-能够将所述组织单元植入到人眼中的外科植入装置。
水凝胶包膜去除手段必须允许包膜通过以任何生物相容手段(即对细胞无毒)水解、溶解、刺穿和/或破裂来去除。去除手段优选地选自缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水，也被称为PBS)、含有二价离子螯合剂的缓冲液(例如，EDTA)，这些是能够裂解水凝胶的酶(根据水凝胶的性质进行选择)。
外科植入装置可以是针或插管，其内径允许待移植的根据本发明的组织单元通过，优选介于100μm和1mm之间；并且其外径对于治疗眼睛的结构不会造成太大的外伤，优选小于2mm。
装置中存在的根据本发明的组织单元的数量介于1和10,000之间，优选介于10和1,000之间。这个数字取决于待治疗的视网膜疾病和不再运作的视网膜区域的大小而有所不同。
在植入试剂盒中，组织单元可以在植入装置之外和/或已经全部或部分地引入到外科植入装置中。
试剂盒中存在的根据本发明的组织单元可以在装置外冷冻和/或在外科植入装置内冷冻。在这种情况下，根据本发明的组织单元必须在使用之前通过允许保留组织单元的所有性质的任何合适手段解冻。这可能特别包含使用DMSO作为防冻剂的标准细胞生物学方案，或使用蔗糖等糖和乙二醇等醇冷冻体外受精胚胎的那些。
如果组织单元已被冷冻，包封在水凝胶包膜中，则应首先对包封的组织单元进行解冻，然后再去除水凝胶包膜。
制备方法
本发明还涉及一种用于制备根据本发明的组织单元的方法。特别地，所述方法由以下组成：通过制造包括水凝胶包膜的细胞微区室来制造至少一个根据本发明的组织单元，所述水凝胶包膜包围：
-分化视网膜色素上皮细胞和任选的其它分化视网膜细胞，或
-能够分化成视网膜细胞，至少分化成视网膜色素上皮细胞的干细胞或祖细胞，或
-旨在在包膜中经历以下的分化细胞：
*或转分化成视网膜细胞，至少转分化成视网膜色素上皮细胞，
*或在包膜中重编程，使得它们成为能够分化成视网膜细胞，至少分化成视网膜色素上皮细胞的诱导多能干细胞。
然后，优选地去除包膜，以允许组织单元的细胞在移植到眼睛中之后植入到视网膜中。
用于制备根据本发明的组织单元的方法包括至少以下步骤的实施：
-产生细胞微区室，所述细胞微区室在水凝胶包膜内包括：
*优选至少细胞外基质元件，其是由细胞分泌的或由操作者提供的，优选除了细胞天然分泌的细胞外基质外，至少部分细胞外基质是提供的，
*能够分化成至少视网膜色素上皮细胞或至少分化视网膜色素上皮细胞的细胞，
-如果引入所述微区室的所述细胞是能够分化成至少视网膜色素上皮细胞的细胞：在所述细胞微区室内诱导细胞分化，以获得至少视网膜色素上皮细胞和可能的其它视网膜细胞，
-去除水凝胶包膜，以以空心三维视网膜组织的形式恢复视网膜色素上皮细胞和可能的其它视网膜细胞，所述空心三维视网膜组织包括围绕内腔组织的至少一个视网膜色素上皮层，其中每个视网膜色素上皮细胞的基面朝外，而顶面朝向腔。
有利地，水凝胶中的全部或部分包封和细胞外基质的提供的组合是一种能够使视网膜色素上皮细胞极化的手段。实际上，可以通过在定位细胞的基面的水凝胶包膜的内面上沉积基质层来获得所述细胞的极化，所述组织在这种极性指示之后围绕所述腔组织自身(如图9中所示，其示出了锚定到藻酸盐壳的细胞外基质层诱导细胞的极化，如通过由于决定组织形状的凝胶的高拉伸强度而使组织对藻酸盐的压扁所证明)。使用的水凝胶优选是生物相容的，即对细胞无毒。水凝胶包膜必须允许氧气和营养物质的扩散以喂养在微区室中含有的细胞并使它们存活。根据一个实施例，包膜包括藻酸盐。它可以仅由藻酸盐形成。特别地，藻酸盐可以是藻酸钠，由80％α-L-古洛糖醛酸盐和20％β-D-甘露糖醛酸盐构成，平均分子量为100-400kDa，总浓度为0.5-5重量％。
水凝胶包膜可以保护细胞免受外部环境的影响以限制细胞的不受控增殖，并使细胞受控分化成视网膜细胞，至少分化成视网膜色素上皮细胞。包膜非常优选地包围单个根据本发明的组织单元，并且每个组织单元由单个水凝胶包膜包围。
一旦获得根据本发明的视网膜组织单元，即当细胞分化成包含至少一层视网膜色素上皮细胞的视网膜细胞并且形状和大小都符合期望时，去除包膜。可以在方法结束时或稍后在植入到眼睛中之前的某个时间进行包膜的去除。尤其可以通过以任何生物相容(即对细胞无毒)手段水解、溶解、刺穿和/或破裂来实现包膜的去除。例如，可以使用磷酸盐缓冲盐水、二价离子螯合剂、诸如藻酸盐裂解酶(如果水凝胶包括藻酸盐)的酶和/或激光显微切割来实现去除。
由于水凝胶的去除是完全的，因此根据本发明的组织单元在植入到眼睛中时是不含水凝胶的。
可以使用用于产生在水凝胶包膜内含有至少视网膜色素上皮细胞或能够产生至少视网膜色素上皮细胞的细胞和任选的细胞外基质和/或视网膜色素上皮细胞以外的视网膜细胞或能够产生至少视网膜色素上皮细胞以外的视网膜细胞的细胞的细胞微区室的任何方法。一种合适的方法特别描述于申请WO2018/096277中。
在一个具体实施例中，产生根据本发明的制备方法的细胞微区室的步骤包括以下步骤：
-在培养基中培育多能干细胞，优选基于DMEM或DMEM-F12、FGF-2或复制其对细胞作用的分子、TGF-β或复制其对细胞作用的分子的培养基，
-将多能干细胞与细胞外基质混合，
-将混合物包封在水凝胶层中。
用于制备根据本发明的组织单元的包封细胞优选选自：
-能够分化成至少视网膜色素上皮细胞的细胞，这些细胞是：
*能够分化成视网膜细胞，至少视网膜色素上皮细胞的干细胞，优选胚胎干细胞或诱导多能干细胞，非常优选诱导多能干细胞，和/或
*能够分化成视网膜细胞，至少分化成视网膜色素上皮细胞的祖细胞，
-和/或分化视网膜色素上皮细胞和可能的视网膜色素上皮细胞以外的分化视网膜细胞，
-和/或能够经历转分化成视网膜细胞，至少转分化成视网膜色素上皮细胞的分化细胞，
-和/或能够经历重编程以成为能够分化成视网膜细胞，至少分化成视网膜色素上皮细胞的诱导多能干细胞的分化细胞。
包封细胞可以与旨在接受组织单元的人免疫相容，以避免任何排斥风险。在一个实施例中，包封细胞先前已经从待植入一个或多个组织单元的人身上收获。
可以通过任何合适的方法实现向视网膜色素上皮细胞的分化。这可以包含已知的方法，例如描述于Leach等人(“简明回顾：使干细胞成为视网膜细胞：用于获得视网膜色素上皮的方法及其对眼部疾病患者的影响(Concise Review:Making Stem Cells Retinal:Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for PatientsWith Ocular Disease)”,《干细胞(Stem Cells)》,2015；33:2363-2373)中的方法中的一个。基础培养基可以是DMEM(“达尔伯克改良伊格尔培养基”)或DMEMF12，其可以补充KSR-XF(“KnockOut DMEM培养基”)或N-2和/或B27、1％GlutaMax和1％非必需氨基酸溶液。也可以使用发表于Choudhary等人(“引导多能干细胞向视网膜色素上皮谱系的分化(DirectingDifferentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment EpitheliumLineage)”,《干细胞转化医学(STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE)》,2016；5:1-12)中的序列来实现诱导。
可以通过任何合适的方法实现向视网膜色素上皮细胞以外的视网膜细胞的分化。这可以包含一种方法，例如描述于Barnea-Cramer等人(“人多能干细胞源光感受器祖细胞在眼盲小鼠中的功能(Function of human pluripotent stem cell-derivedphotoreceptor progenitors in blind mice)”《自然——科学报告(Nature,ScientificReports)》,2016年7月13日出版)中的方法。因此，可以使用可以补充有KSR-XF(KnockOutDMEM培养基)或N-2和/或B27、1％GlutaMax和1％非必需氨基酸溶液的DMEMF12进行分化。
在一个具体实施例中，根据本发明的制备方法的细胞分化诱导步骤包括以下步骤：
-使微区室在多能细胞培养基中生长，直到获得至少10个细胞，优选100个细胞，
-使微区室在补充有N-2和B27、1％GlutaMax和1％非必需氨基酸溶液以及LDN193189和SB431542和20μg/ml人胰岛素的DMEMF12培养基中生长，
-使微区室在补充有N-2和B27、1％GlutaMax和1％非必需氨基酸溶液以及LDN193189和SB431542的DMEMF12培养基中生长，
-使微区室在补充有N-2和B27 1％GlutaMax和1％非必需氨基酸溶液以及10ng/ml人BDNF、10ng/ml人CNTF、2μM视黄酸和10μM DAPT的DMEMF12培养基中生长。
微区室优选生长至少18天，优选18至50天。
在包括视网膜色素上皮层和至少一层其它视网膜细胞的组织单元的一个实施例中，所述方法由以下组成：共同包封视网膜色素上皮细胞和其它细胞。从每次分化的数天获得的细胞优选被共同包封以形成含有视网膜色素上皮和神经视网膜的结构。然后，细胞在包膜中成熟5到50天，更优选10到25天，然后获得根据本发明的组织单元。
腔是在三维组织单元形成时通过细胞繁殖和生长而产生的。腔可以含有液体，特别是用于执行所述方法的培养基。
根据本发明的方法可以包含以下步骤：在微区室中扩增视网膜色素上皮细胞。
在图3中示出了根据本发明的包括空心三维组织单元10的微区室20的一个实施例。在本实施例中，微区室仅由以下形成：
-水凝胶层22，和
-组织单元10，其由以下形成：
*内腔14，
*围绕内腔组织的视网膜色素上皮层12，其中视网膜色素上皮细胞的基面B朝向组织单元的外侧，而视网膜色素上皮细胞的顶面A朝向内腔。
*在所述视网膜色素上皮细胞的基面上围绕所述一层视网膜色素上皮细胞布置的细胞外基质层16。
在图4中示出了根据本发明的包括空心三维视网膜组织单元10的微区室20的另一个实施例。在本实施例中，微区室仅由以下组成：
-水凝胶层22，和
-组织单元10，其由以下形成：
*内腔14，
*一层18视网膜色素上皮细胞以外的视网膜细胞，优选一层神经视网膜，
*围绕内腔组织的视网膜色素上皮层12，视网膜色素上皮细胞的基面B朝向组织单元的外侧，而视网膜色素上皮细胞的顶面A朝向内腔，
*在所述视网膜色素上皮细胞的基面上围绕所述一层视网膜色素上皮细胞布置的细胞外基质层16。
在分化步骤之后，在将组织单元植入到眼睛中之前的任何时间，根据本发明的方法可以包含以下步骤：验证包膜中含有的细胞的表型。在某个实施例中，特别是对于在腔体可以含有玻璃体蛋白和视蛋白(opticin)的某个实施例中，组织元件在组织单元的内部位置中含有在所述腔处由视杆细胞的所有光感受器和视紫红质/PDE6β表达的恢复蛋白的神经视网膜元件的情况，这种验证可以通过在组织单元的外部位置中标识色素上皮对RPE65的表达来进行。
根据本发明的方法可以包括以下步骤：在去除水凝胶层之前冷冻含有根据本发明的组织单元的微区室，或在水凝胶包膜去除步骤之后冷冻组织单元。冷冻优选地在-190℃和-80℃之间的温度下进行。
去除水凝胶层之前的含有根据本发明的组织单元的微区室或水凝胶包膜去除步骤之后的组织单元可以在+4℃和室温之间的以下条件下储存。根据本发明的组织单元也可以在执行根据本发明的方法之后直接使用而无需储存。
在对去除水凝胶层之前的含有组织单元的微区室或对组织单元进行可能的解冻之前或之后，根据本发明的制备方法还可以包括以下附加步骤：用至少一个根据本发明的组织单元装载外科植入装置，优选10至1,000个组织单元，甚至更优选10至100个组织单元。
在眼睛中植入组织单元
本发明还涉及一种空心三维组织单元，其包括围绕内腔组织的至少一层视网膜色素上皮细胞，其中每个视网膜色素上皮细胞的基面朝外，而顶面朝向内腔；其用于治疗视网膜疾病，特别是治疗有需要的患者的视网膜疾病。术语“治疗”是指预防性、治愈性性或对症治疗，即旨在暂时或永久改善人的视力，优选根除疾病和/或中止或延缓疾病的进展和/或促进疾病的消退的任何行为。
实际上，根据本发明的组织单元可以用于治疗人类的视网膜疾病，特别是退行性视网膜疾病，优选选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、眼外伤相关性视网膜病变和遗传性视网膜病变。
所述治疗由植入组成，也就是说，在视网膜处，特别是在布鲁赫膜处，即在布鲁赫膜和神经视网膜之间，将根据本发明的组织单元移植到眼睛中。非常优选地使用适合植入到眼睛中的外科植入装置。这尤其可以包含用于沉积组织单元的针、插管或其它装置，例如用于在动脉中植入支架或植入外科微型植入物的那些。植入可以特别通过执行由以下组成的步骤来进行：
-在治疗区域使用外科植入装置在视网膜中穿透或作出切口，
-将组织单元注射到视网膜下，优选布鲁赫膜处，即布鲁赫膜和神经视网膜之间，
-去除外科植入装置，从而防止细胞被推回到玻璃体液中。
在一个实施例中，在单次植入期间，植入1至10,000个根据本发明的组织单元。
如有必要，可以在视网膜的不同区域中，优选在布鲁赫膜处执行数次同时或连续的植入，特别是在数个单独的区域受到疾病影响的情况下，或在待进行移植的区域的范围太广而无法仅在一个地方进行移植的情况下。
类似地，如果在一个区域中进行单次移植不够，可以在更短或更长的时间内在同一区域中重复进行多次移植。
根据本发明的组织单元的植入允许患有视网膜疾病，特别是退化性视网膜疾病的患者重获至少部分视力。
现在将通过图5到8中示出的结果来说明本发明。
这些各个图中示出的视网膜上皮组织是通过实施包括以下步骤的方法获得的：
-产生细胞微区室，所述细胞微区室在水凝胶包膜内包括：
*由操作者提供的细胞外基质元件，
*视网膜色素上皮细胞，
这些视网膜色素上皮细胞可以通过以下方式获得：
-i)使诱导多能干细胞在培养皿内生长，直到获得含有数十个细胞的菌落；ii)使微区室在多能细胞培养基中生长，直到在微区室中获得至少10个细胞，优选100个细胞，
-i)使菌落生长；ii)使微区室在补充有N-2和B27、1％GlutaMax和1％非必需氨基酸溶液以及LDN193189和SB431542和20μg/ml人胰岛素的DMEMF12培养基中生长，
-i)使菌落生长；ii)使微区室在补充有N-2和B27、1％GlutaMax和1％非必需氨基酸溶液以及LDN193189和SB431542的DMEMF12培养基中生长，
-i)使菌落生长；ii)使微区室在补充有N-2和B27、1％GlutaMax和1％非必需氨基酸溶液和10ng/ml人BDNF、10ng/ml人CNTF、2μM视黄酸和10μM DAPT的DMEMF12培养基中生长。
在图5中，包膜通过对视网膜色素上皮细胞的包封而获得，所述视网膜色素上皮细胞来源于微区室内增殖的诱导细胞的分化以以极化组织单元的形式组织自身。图5清楚地示出了成熟的鳞状色素单层上皮(黑色箭头)的形成(通常通过形成紧密联接(白色箭头)的形成来实现)，这是体内视网膜色素上皮细胞的组织结构的典型特征。
在图6中，通过对来源于诱导多能细胞的分化的视网膜色素上皮细胞的包封而获得的包膜表现出色素上皮膜片结构化，无论组织中的细胞数量如何(左侧大约100个细胞，大小：50μm，***图A；右侧大约1,000个细胞，大小：250μm，***图B)，这是体内视网膜色素上皮细胞的组织结构的典型特征。更具体地，在图6中可以看出，细胞根据顶面-基面极化组织在空心椭球体(***图B)和空心卵形体(***图E)中，顶面-基面极化的特征在于顶面朝向组织单元的内侧，而基面朝向组织单元的外侧，其位于此处与藻酸盐层接触。特别地，细胞外色素位于细胞的顶面上(***图D，透射光，白色箭头)，其中核的基础组织(***图B，DAPI，白色箭头)对应于体内遇到的拓扑。
在图7中，将通过对来源于诱导多能细胞的分化的视网膜色素上皮细胞的包封而获得的包膜在4周内扩增10倍(图7a和7b)和在4周内扩增4倍(图7c和7d)。这些图说明根据本发明的视网膜组织单元可以具有可变的细胞密度。
最后，在图8的连续图像中，数个根据本发明的视网膜组织单元(没有水凝胶包膜)已分布在模拟眼底的细胞外基质的基底上(此处为基底胶模拟布鲁赫膜)。可以看出，视网膜组织单元(黑色箭头)由于其基面定位在外侧上而能够通过发射粘附到基底的细胞(白色箭头)而附着到模拟眼底的细胞外基质的基底，所述细胞迁移(灰色箭头)以覆盖基底并形成单层(对应于122小时培养的右下角的***图)。

Claims (21)

1.一种空心三维视网膜组织单元，其包括围绕内腔组织的至少一层分化活人视网膜色素上皮细胞，其中每个视网膜色素上皮细胞的基面朝外，而顶面朝向所述内腔。
2.根据权利要求1所述的视网膜组织单元，其特征在于，其包括位于所述视网膜色素上皮细胞的所述基面上的细胞外基质外层。
3.根据前述权利要求中一项所述的视网膜组织单元，其特征在于，它为空心卵形体、空心圆柱体、空心椭球体或空心球体的形式。
4.根据前述权利要求所述的视网膜组织单元，其特征在于，其最大尺寸介于100和1,000μm之间。
5.根据前述权利要求所述的视网膜组织单元，其特征在于，其最小尺寸介于10和1,000μm之间。
6.根据前述权利要求中一项所述的视网膜组织单元，其特征在于，所述并列的视网膜色素上皮细胞在它们的侧面上通过紧密联接彼此连接。
7.根据前述权利要求中一项所述的视网膜组织单元，其特征在于，其还在所述视网膜色素上皮细胞的顶面上包括围绕所述内腔组织的至少一层视网膜色素上皮细胞以外的分化活人视网膜细胞。
8.根据前述权利要求所述的视网膜组织单元，其特征在于，视网膜色素上皮细胞以外的所述分化活人视网膜细胞选自视杆细胞、视锥细胞、神经节细胞、无长突细胞、双极细胞和水平细胞。
9.根据前述权利要求中一项所述的视网膜组织单元，其特征在于，其含有10到100,000个视网膜细胞。
10.根据前述权利要求中一项所述的视网膜组织单元，其特征在于，所述视网膜色素上皮细胞和/或任何其它视网膜细胞获自诱导多能干细胞(IPS)。
11.根据前述权利要求中一项所述的视网膜组织单元，其特征在于，其被包封在水凝胶包膜中。
12.根据前述权利要求中一项所述的视网膜组织，其用于治疗视网膜疾病。
13.一种根据前述权利要求用于治疗退行性视网膜疾病的视网膜组织单元。
14.一种根据前述权利要求用于治疗视网膜疾病的视网膜组织单元，所述视网膜疾病选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、眼外伤相关性视网膜病变和遗传性视网膜病变。
15.一种用于制备根据权利要求1到11中一项所述的视网膜组织单元的方法，其包括以下步骤：
-产生细胞微区室，所述细胞微区室在水凝胶包膜内包括：
*任选的至少细胞外基质元件，其是由所述细胞分泌的或加入的，
*能够分化成至少视网膜色素上皮细胞或至少分化视网膜色素上皮细胞的细胞，
-如果引入所述微区室的所述细胞是能够分化成至少视网膜色素上皮细胞的细胞：
在所述细胞微区室内诱导细胞分化，以获得至少视网膜色素上皮细胞和可能的其它视网膜细胞，
-去除所述水凝胶包膜，以便以空心三维视网膜组织单元的形式恢复所述视网膜色素上皮细胞和任何其它视网膜细胞。
16.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，其包括以下步骤：包括扩增所述视网膜色素上皮细胞。
17.根据权利要求15或16中一项所述的方法，其特征在于，能够分化成至少视网膜色素上皮细胞的所述细胞是多能干细胞。
18.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞是诱导多能干细胞(IPS)。
19.根据权利要求15到18中一项所述的用于制备视网膜组织单元的方法，其特征在于，其包括以下进一步的步骤：将所述组织单元装载到适合注射到眼睛中的外科植入装置中。
20.一种用于将根据权利要求1到11中一项所述的组织单元植入到眼睛中的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
-1至10,000个根据权利要求1到11中一项所述的组织单元，
-能够将所述组织单元植入到人眼中的外科植入装置。
21.一种用于将根据权利要求11所述的组织单元植入到眼睛中的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
-1至10,000个根据权利要求11所述的组织单元，
-水凝胶包膜去除手段，
-能够将所述组织单元植入到人眼中的外科植入装置。
CN202080065333.6A 2019-08-12 2020-08-12 由视网膜组织制成的空心三维单元及其在治疗视网膜病变中的用途 Pending CN114423857A (zh)

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