CN114410538A - 一种用于小型养殖户的微生态菌剂固态发酵方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于小型养殖户的微生态菌剂固态发酵方法，包括如下步骤：S1：固态发酵基质的处理；S2：枯草芽孢杆菌初发酵；S3：植物乳杆菌复合发酵，即得用于小型养殖户的微生态菌剂。本发明采用枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌按照特定顺序以及特定接种量的复合菌种进行固态发酵，制备得到微生态菌剂的活力稳定性高，高达19923 IU/g，抗菌效果好，且能改善畜禽的肠道；将其混料至小型养殖户的饲料中，其固态发酵成本低且易操作，且混料后的饲料添加剂中的菌剂活力稳定性仍然能保持10958 IU/g，适宜于小型养殖户的一次混料固态发酵的连续使用，且能提高饲料残料利用率。
Description
技术领域
本发明涉及小型养殖户饲料添加剂技术领域，特别涉及一种用于小型养殖户的微生态菌剂固态发酵方法及其应用。
背景技术
随着我国畜禽养殖业由传统养殖向现代化养殖转变，给疾病防控、食品安全、环境保护等方面带来诸多挑战，特别是疫病防控和食品安全，面临的问题越来越严峻。微生物菌剂在仔猪、蛋种禽、反刍动物和鱼虾养殖上等的养殖上使用越来越广泛，能够起到降低饲料成本，减少胃肠道疾病的发生，提高动物免疫力，并将可能取代抗生素的使用，提高禽畜养殖业和水产养殖业的经济效益。我国禽畜养殖业在不断的城市化进程中集约化、规模化、产业化程度越来越高，对居民生活、经济发展做出了重要贡献，但在广大农村地区依然存在大量养殖规模小的小型养殖户，其饲料成本接受度低，专业技术操作落后，因此对低成本、易操作的微生态养殖方法需求非常迫切。
目前大量养殖规模小的小型养殖户对微生态菌剂的接受度越来越高，但在使用过程中对“活的、足够量的微生物”没有足够重视，直接将微生态制剂与饲料粗糙混合使用，并不能充分发挥微生态菌剂的使用效果。微生态菌剂经发酵达到足够高的活菌水平才能通过肠胃的极性环境，发挥竞争性抑制的效用；同时菌剂中微生物的存活周期受环境中湿度及温度影响，在高温及高湿度环境下微生物萌发速度加快，活菌数快速减少，菌剂活力效果逐渐下降。
到目前为止，关于如何将枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行固态发酵制备得到微生态菌剂，将其混料至小型养殖户的饲料中，其成本低且易操作，且混料后的饲料中菌剂的发酵活力仍然能保持10958 IU/g，具有较高的实际应用价值的微生态菌剂固态发酵方法还未见相关报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的是提供一种用于小型养殖户的微生态菌剂固态发酵方法。
本发明的另一目的是提供上述微生态菌剂固态发酵方法制备得到的微生态菌剂在小型养殖户的饲料中的应用。
本发明上述目的通过如下技术方案予以实现：
一种用于小型养殖户的微生态菌剂固态发酵方法，包括如下步骤：
S1：固态发酵基质的处理：配制增菌液，配制后的增菌液与豆粕混合均匀，煮熟灭菌后室温冷却；
S2：枯草芽孢杆菌初发酵：在固态发酵基质中，接种枯草芽孢杆菌，混料均匀后于37℃环境中培养6-10h；
S3：植物乳杆菌复合发酵：在枯草芽孢杆菌初发酵固态发酵基质中，接种植物乳杆菌，混合均匀后堆积于于37℃环境中发酵1-4天；发酵结束后在通风阴凉处翻料晾干，于阴凉通风处保藏，即得用于小型养殖户的微生态菌剂。
优选地，步骤S1中，所述增菌液的配制组成包括：0.5-1.5%葡萄糖、1-3%蔗糖、1-3%玉米浆干粉、0.5-1.5%硫酸铵、0.05-0.15%氯化钠、0.01-0.03%硫酸镁、0.07-0.09%磷酸二氢钾、0.05-0.15%碳酸钙。
优选地，步骤S1中，所述增菌液与豆粕的重量比为40-50：50-60。
优选地，步骤S2中，所述枯草芽孢杆菌的接种量为1×108cfu/g。
优选地，步骤S3中，所述植物乳杆菌的接种量为1×108-3×108cfu/g。
此外，本发明还公开了上述微生态菌剂固态发酵方法制备得到的微生态菌剂在小型养殖户的饲料中的应用。
优选地，所述微生态菌剂在小型养殖户的饲料中的添加量为8-12wt%。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明采用枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌按照特定顺序以及特定接种量的复合菌种进行固态发酵，制备得到微生态菌剂的活力稳定性高，高达19923 IU/g，抗菌效果好，且能改善畜禽的肠道；将其混料至小型养殖户的饲料中，其固态发酵成本低且易操作，且混料后的饲料添加剂中的菌剂活力稳定性仍然能保持10958 IU/g，适宜于小型养殖户的一次混料固态发酵的连续使用，且能提高饲料残料利用率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
各性能指标的测试标准或测试方法如下：
微生态菌剂的活力稳定性的测试方法：
①将大肠杆菌先接种斜面上，37℃培养16-20h，分光光度计测定其OD600nm：将上述大肠杆菌菌液用水做空白对照，测定其吸光值。将无菌固体检测培养基融化后置室温待其冷却至48-50℃时，将大肠杆菌菌悬液吸光值调4.00±0.01，摇匀。吸取含菌检测培养基10ml，使在90mm培养皿底内均匀摊布，放置在水平台面上使其凝固备用。
②称取待测样品1.0g，加水9ml生理盐水溶解，离心取上清。将上述①中制备好的检测培养基上用灭菌的打孔器（直径2.7mm）打孔，每孔中分别加入6 μl的测试样品溶液，重复3次，置于37℃培养箱中培养16-24小时后，用游标卡尺测定抑菌圈直径，取平均值。
③活力效价测定
计算公式：IU（单位/克）=2（X -2.7）/2.1×1000×稀释倍数
X：抑菌圈直径（mm）
2.7：孔穴直径（mm）
2.1：比值常数。
抗菌效果的测试方法：
将经斜面培养的大肠杆菌用4-5mL生理盐水洗脱，测其OD600nm值并调节OD600nm=4.00±0.01。将营养琼脂加热融化并冷却到48℃，按1μL•mL-的比例加入已调节好的大肠杆菌菌悬液，摇匀；用灭过菌的移液管移取10 mL调配好的各培养基到90mm培养皿中，待其凝固后用灭过菌的打孔器打孔；各个孔加入6 μL固态发酵样品洗脱液，置于37℃条件下培养24h，观察抑菌效果，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。
畜禽的肠道效果的测试方法：
①选取固态发酵样品喂养仔猪，连续喂养7天，第七天喂养结束后收集仔猪粪便0.5g。
②采用QIAamp粪便细菌基因组DNA分离试剂盒对粪便进行DNA提取，针对细菌16SrDNA V3-V4区进行特异性扩增，对扩增产物进行检测和纯化后，采用Illumina MisSeq测序平台对其进行高通量测序，并对测序结果进行生物信息学分析。
③将测序得到的原始数据经UCHIME软件进行拼接和质控得到高质量的Cleanreads，对高质量序列继续进行嵌合体过滤（Chimera-cheack），采用QIIME1.9.1软件进行OTU聚类，对菌群丰富度进行分析。
饲料中菌剂的活力稳定性的测试方法：
①将大肠杆菌先接种斜面上，37℃培养16-20h，分光光度计测定其OD600nm：将上述大肠杆菌菌液用水做空白对照，测定其吸光值。将无菌固体检测培养基融化后置室温待其冷却至48-50℃时，将大肠杆菌菌悬液吸光值调4.00±0.01，摇匀。吸取含菌检测培养基10ml，使在90mm培养皿底内均匀摊布，放置在水平台面上使其凝固备用。
② 称取待测样品1.0g，加水9ml生理盐水溶解，离心取上清。将上述①中制备好的检测培养基上用灭菌的打孔器（直径2.7mm）打孔，每孔中分别加入6 μl的测试样品溶液，重复3次，置于37℃培养箱中培养16-24小时后，用游标卡尺测定抑菌圈直径，取平均值。
③活力效价测定
计算公式：IU（单位/克）=2（X -2.7）/2.1×1000×稀释倍数
X：抑菌圈直径（mm）
2.7：孔穴直径（mm）
2.1：比值常数。
饲料残料利用率的测试方法：
称取待测样品1.0 g，加入9 mL生理盐水溶解，取1mL样品稀释液进行10倍递增连续稀释，选取合适梯度稀释液进行菌落计数，每个合适梯度稀释液吸取1mL稀释液于无菌平皿中，及时将冷却至48℃的MRS琼脂倾注平皿，待琼脂凝固后置于37℃培养箱中培养24小时后进行菌落计数。
饲料的耐放性的测试方法：
称取待测样品1.0 g，加入9 mL生理盐水溶解，取1mL样品稀释液进行10倍递增连续稀释，选取合适梯度稀释液进行菌落计数，每个合适梯度稀释液吸取1mL稀释液于无菌平皿中，及时将冷却至48℃的孟加拉红琼脂倾注平皿，待琼脂凝固后置于28℃培养箱中培养5d后进行菌落计数。
实施例1：
一种用于小型养殖户的微生态菌剂固态发酵方法，包括如下步骤：
S1：固态发酵基质的处理：配制增菌液，所述增菌液的配制组成包括：1%葡萄糖、2%蔗糖、2%玉米浆干粉、1%硫酸铵、0.1%氯化钠、0.02%硫酸镁、0.08%磷酸二氢钾、0.1%碳酸钙，配制后的增菌液与豆粕按照重量比为40：60混合均匀，煮熟灭菌后室温冷却；
S2：枯草芽孢杆菌初发酵：在固态发酵基质中，以接种量为1×108cfu/g接种枯草芽孢杆菌，混料均匀后于37℃环境中培养8h；
S3：植物乳杆菌复合发酵：在枯草芽孢杆菌初发酵固态发酵基质中，以接种量为2.5×108cfu/g接种植物乳杆菌，混合均匀后堆积于于37℃环境中发酵2天；发酵结束后在通风阴凉处翻料晾干，于阴凉通风处保藏，即得用于小型养殖户的微生态菌剂，制备得到的微生态菌剂的各性能指标的测试结果如表1所示。
将上述微生态菌剂以添加量为10wt%添加到小型养殖户的饲料中，制备得到的饲料的各性能指标的测试结果如表2所示。
实施例2：
一种用于小型养殖户的微生态菌剂固态发酵方法，包括如下步骤：
S1：固态发酵基质的处理：配制增菌液，所述增菌液的配制组成包括：0.5%葡萄糖、3%蔗糖、1%玉米浆干粉、1.5%硫酸铵、0.05%氯化钠、0.03%硫酸镁、0.07%磷酸二氢钾、0.15%碳酸钙，配制后的增菌液与豆粕按照重量比为50：50混合均匀，煮熟灭菌后室温冷却；
S2：枯草芽孢杆菌初发酵：在固态发酵基质中，以接种量为1×108cfu/g接种枯草芽孢杆菌，混料均匀后于37℃环境中培养8h；
S3：植物乳杆菌复合发酵：在枯草芽孢杆菌初发酵固态发酵基质中，以接种量为1×108cfu/g接种植物乳杆菌，混合均匀后堆积于于37℃环境中发酵2天；发酵结束后在通风阴凉处翻料晾干，于阴凉通风处保藏，即得用于小型养殖户的微生态菌剂，制备得到的微生态菌剂的各性能指标的测试结果如表1所示。
将上述微生态菌剂以添加量为10wt%添加到小型养殖户的饲料中，制备得到的饲料的各性能指标的测试结果如表2所示。
实施例3：
一种用于小型养殖户的微生态菌剂固态发酵方法，包括如下步骤：
S1：固态发酵基质的处理：配制增菌液，所述增菌液的配制组成包括：1.5%葡萄糖、1%蔗糖、3%玉米浆干粉、0.5%硫酸铵、0.15%氯化钠、0.01%硫酸镁、0.09%磷酸二氢钾、0.05%碳酸钙，配制后的增菌液与豆粕按照重量比为60：40混合均匀，煮熟灭菌后室温冷却；
S2：枯草芽孢杆菌初发酵：在固态发酵基质中，以接种量为1×108cfu/g接种枯草芽孢杆菌，混料均匀后于37℃环境中培养8h；
S3：植物乳杆菌复合发酵：在枯草芽孢杆菌初发酵固态发酵基质中，以接种量为3×108cfu/g接种植物乳杆菌，混合均匀后堆积于于37℃环境中发酵2天；发酵结束后在通风阴凉处翻料晾干，于阴凉通风处保藏，即得用于小型养殖户的微生态菌剂，制备得到的微生态菌剂的各性能指标的测试结果如表1所示。
将上述微生态菌剂以添加量为10wt%添加到小型养殖户的饲料中，制备得到的饲料的各性能指标的测试结果如表2所示。
对比例1：
一种用于小型养殖户的微生态菌剂固态发酵方法，包括如下步骤：
步骤S2与步骤S3对换顺序，其他步骤同实施例1，制备得到的微生态菌剂的各性能指标的测试结果如表1所示。
将上述微生态菌剂以添加量为10wt%添加到小型养殖户的饲料中，制备得到的饲料的各性能指标的测试结果如表2所示。
对比例2：
一种用于小型养殖户的微生态菌剂固态发酵方法，包括如下步骤：
步骤S3中植物乳杆菌的接种量为6×108cfu/g接种植物乳杆菌，其他步骤同实施例1，制备得到的微生态菌剂的各性能指标的测试结果如表1所示。
将上述微生态菌剂以添加量为10wt%添加到小型养殖户的饲料中，制备得到的饲料的各性能指标的测试结果如表2所示。
对比例3：
一种用于小型养殖户的微生态菌剂饲养方法，包括如下步骤：
S1：微生态菌剂的溶解：将500g微生态菌剂充分溶解于1.5L水中；
S2：饲料拌料：将S1中的溶解液置于5Kg饲料中，充分搅拌均匀。
制备得到的微生态菌剂的各性能指标的测试结果如表1所示。
将上述微生态菌剂以添加量为10wt%添加到小型养殖户的饲料中，制备得到的饲料的各性能指标的测试结果如表2所示。
Claims (7)
1.一种用于小型养殖户的微生态菌剂固态发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：固态发酵基质的处理：配制增菌液，配制后的增菌液与豆粕混合均匀，煮熟灭菌后室温冷却；
S2：枯草芽孢杆菌初发酵：在固态发酵基质中，接种枯草芽孢杆菌，混料均匀后于37℃环境中培养6-10h；
S3：植物乳杆菌复合发酵：在枯草芽孢杆菌初发酵固态发酵基质中，接种植物乳杆菌，混合均匀后堆积于于37℃环境中发酵1-4天；发酵结束后在通风阴凉处翻料晾干，于阴凉通风处保藏，即得用于小型养殖户的微生态菌剂。
2.根据权利要求1所述的微生态菌剂固态发酵方法，其特征在于，步骤S1中，所述增菌液的配制组成包括：0.5-1.5%葡萄糖、1-3%蔗糖、1-3%玉米浆干粉、0.5-1.5%硫酸铵、0.05-0.15%氯化钠、0.01-0.03%硫酸镁、0.07-0.09%磷酸二氢钾、0.05-0.15%碳酸钙。
3.根据权利要求1所述的微生态菌剂固态发酵方法，其特征在于，步骤S1中，所述增菌液与豆粕的重量比为40-50：50-60。
4.根据权利要求1所述的微生态菌剂固态发酵方法，其特征在于，步骤S2中，所述枯草芽孢杆菌的接种量为1×108cfu/g。
5.根据权利要求1所述的微生态菌剂固态发酵方法，其特征在于，步骤S3中，所述植物乳杆菌的接种量为1×108-3×108cfu/g。
6.如权利要求1-5任一项所述的微生态菌剂固态发酵方法制备得到的微生态菌剂在小型养殖户的饲料中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述微生态菌剂在小型养殖户的饲料中的添加量为8-12wt%。
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