CN103421713A - 用于饲料添加剂领域的益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌 - Google Patents

用于饲料添加剂领域的益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌 Download PDF

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一种污染小、易操作、有利于肠胃消化吸收的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis）HM-66和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum）HM-20均为益生菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCC No.6733和CGMCC No.6744。保藏日期为：2012年10月29日，本发明还公开了其应用方法。

Description

用于饲料添加剂领域的益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌
技术领域
本发明属于饲料添加剂益生菌固体发酵领域，尤其是一种污染小、易操作、有利于肠胃消化吸收的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，应用于动物饲料添加剂等方面。
背景技术
目前，益生菌制品多采用益生菌直接与液态牛乳和豆乳发酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其余则采用液态发酵，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者胶囊。采用液态发酵会产生大量的废水，对环境污染较大，
后处理比较困难，机器设备操作繁琐。
发明内容
本发明目的在于采用枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20进行混合固态发酵豆粕，提供一种污染小、易操作、有利于肠胃消化吸收的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌。
本发明是通过下述技术方案实现的。
用于饲料添加剂领益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HM-66和植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）HM-20均为益生菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.6733和CGMCC No.6744，保藏日期为：2012年10月29日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
用于饲料添加剂益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：将所述枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20的培养及其固态发酵培养，得到益生菌的固态发酵豆粕产品。
用于饲料添加剂益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的使用方法，其特征在于包括下列步骤：采用枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20进行混合固态发酵，所述枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20种子培养基为：棉籽糖2%，豆粕1%，加水至100%，pH7.0-7.2。固态发酵培养基：58%豆粕，2%的糖，水分含量40%。
所述的枯草芽孢杆菌HM-66种子培养条件，放置于摇床上，转速为150r/min，温度为37℃，培养20h。所述的植物乳杆菌HM-20的种子培养条件，置于恒温培养箱静置培养，培养温度37℃，培养时间为20h。
所述固态发酵培养条件为：枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20接种量分别为1.0%和4.0%。
在发酵初期，枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20混合发酵，pH均呈下降趋势，pH最小值为5.44，在发酵的后期，其pH均呈上升趋势，发酵48h后，其pH为6.60。
在枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20混合发酵48h后，其游离氨基态氮含量为：529.1umol/g。
枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20混合发酵，在发酵48h后，小肽（<1000Da）含量增加了81.3%，大肽（>10000Da）减少了77.2%。
本发明的优点和积极效果：
1.本发明中采用枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20进行混合固态发酵豆粕。
2.本发明采用固态发酵生产成本低，投资的资金较少，在下游处理方便，污染小，设备结构简单、易操作；
3.采用植物乳杆菌HM-20进行发酵，可以产生乳酸及乙酸等酸味小分子物质，这些小分子物质赋予产品特有的酸香味、色泽和口感等感官特征的改善和多样化，使豆粕发酵产品更容易为消费者所接受；
4.采用植物乳杆菌HM-20发酵豆粕，可以使豆粕中的蛋白质被分解成小肽和游离氨基酸，利于肠胃的消化吸收，可广泛应用于饲料添加剂领域的益生菌固体发酵技术。
附图说明
图1为植物乳杆菌HM-20接种量对活菌数的影响的示意图；
图2为枯草芽孢杆菌HM-66接种量对植物乳杆菌HM-20活菌数的影响的示意图；
图3为本发明在固态发酵时，时间对植物乳杆菌HM-20活菌数的影响的示意图；
图4为枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20进行混菌固态发酵时，pH随时间的变化的示意图；
图5为枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20进行混菌固态发酵时，氨基态氮含量随时间的变化的示意图；
图6为枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20进行混菌固态发酵36h后，不同多肽分子量的百分含量的示意图。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。
用于饲料添加剂领益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20分类名称分别为Bacillus subtilis HM-66和Lactobacillus plantarum HM-20，保藏编号分别为CGMCC No.6733和CGMCC No.6744，保藏日期2012年10月29日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
用于饲料添加剂益生菌固体发酵的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的应用，将所述枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20的培养及其固态发酵培养，得到益生菌的固态发酵豆粕产品。
用于饲料添加剂益生菌固体发酵的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的使用方法，包括下列步骤：
1.菌体的种子液制备
将枯草芽孢杆菌HM-66从冻藏的甘油管中接到装有液体种子的培养基中，放置于摇床上，转速为150r/min，温度为37℃，培养20h。植物乳杆菌HM-20种子培养条件，置于恒温培养箱静置培养，培养温度37℃，培养时间为20h。其中液体种子培养基（g/L）为：棉籽糖20，豆粕10，pH7.0-7.2。
2.固态发酵
将枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20分别以1.0%和4.0%接种量接菌到湿灭好的豆粕培养基，密封之后置于恒温培养箱静置培养。
固态发酵培养基为：58%豆粕，2%的糖，水分含量40%，115℃高压灭菌25min。
3.测定活菌数
一般采用平板计数法，操作步骤为：称取制备好的豆粕发酵制品10g，置于90ml的无菌生理盐水中，放置到摇床上震荡30min，摇匀后用移液枪取1ml的菌液加进另一个9ml的无菌生理盐水中，进行稀释，按照国标方法，依次做十倍梯度稀释。稀释完后，用移液枪分别取合适的稀释度1ml打进平板，倒入培养基混匀，依次做三个平行，置于培养箱中在37℃静置培养48h。
4.pH值的测定
称取10g发酵后的豆粕产品，放入三角瓶中，加入90ml的蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌30min，静置10min后用精密pH计测定其pH值。
5.氨基态氮含量的测定
取10g发酵后的豆粕，用匀浆器破碎，之后与90ml的蒸馏水混合，在4℃冰箱放置1天。样品离心7000r/min，离心15min。上清液0.8ml置于试管中，然后加3.2ml蒸馏水、2.0ml显色剂，混匀，放入沸水浴中加热15min，同时作空白对照。然后冷水冷却，加入5.0ml40%乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色杯，以空白管调零于570nm处测定A值。
6.豆粕多肽分子量测定
取10g发酵后的豆粕，匀浆器破碎后，将所得发酵物用5倍无菌生理盐水在4℃浸提4h，在4500r/min条件下离心取上清液，冷冻干燥取粉末，另有未接种固态发酵物作为空白对照。
色谱条件
色谱柱：GE SuperdexTM Peptide10/300GL（10×300nm）；
流动相：50mM磷酸盐缓冲溶液（pH为7.2，并含有0.15MNacl）；
柱压：小于18bar；
流速：0.5ml/min；
检测波长：214nm
柱温：室温
进样量：10ul。
7.发酵制品的包装
豆粕发酵制品存在大量的活菌，因此豆粕发酵产品必须进行封口包装，并于低温保藏，保质期大约为6个月。
以下是对以豆粕为基质的益生菌发酵产品的生产方法的一些参数的确定，以及一些培养条件的优化。
一、接种量对活菌数的影响
固态发酵培养基为：58%豆粕，2%的糖，水分含量40%，115℃高压灭菌25min。
当植物乳杆菌HM-20的接菌量为1%时，培养温度37±1℃，培养时间28h，测得植物乳杆菌HM-20活菌数为2.3×108cfu/g。
当植物乳杆菌HM-20的接菌量为4%时，培养温度37±1℃，培养时间28h，测得植物乳杆菌HM-20活菌数为2.8×108cfu/g。
当植物乳杆菌HM-20的接菌量为6%时，培养温度37±1℃，培养时间28h，测得植物乳杆菌HM-20活菌数为1.4×108cfu/g。
结果：植物乳杆菌HM-20最适接种量分别为4%（参见图1）。
二、浸泡水对活菌数的影响
当浸泡水的pH为6.0，植物乳杆菌HM-20的接种量分别为4%时，培养温度37±1℃，培养时间32h，测得植物乳杆菌HM-20活菌数为5.6×108cfu/g。
当浸泡水的pH为6.5，植物乳杆菌HM-20的种量分别为4%时，培养温度37±1℃，培养时间32h，测得植物乳杆菌HM-20活菌数为6.9×108cfu/g。
当浸泡水的pH为7.0，植物乳杆菌HM-20的种量分别为4%时，培养温度37±1℃，培养时间32h，测得植物乳杆菌HM-20活菌数为3.6×108cfu/g。
结果：当浸泡水的pH为6.5时，植物乳杆菌HM-20的活菌数最高。
三、枯草芽孢杆菌HM-66接种量对活菌数的影响
当枯草芽孢杆菌HM-66的接种量为0.6%，植物乳杆菌HM-20为接种量4%时，浸泡水pH为6.5，培养温度37±1℃，培养时间32h，测得植物乳杆菌HM-20活菌数为5.1×108cfu/g。
当枯草芽孢杆菌HM-66的接种量为1.0%，植物乳杆菌HM-20的种量为4%时，浸泡水pH为6.5，培养温度37±1℃，培养时间32h，测得植物乳杆菌HM-20活菌数为6.3×109cfu/g。
当枯草芽孢杆菌HM-66的接种量为2.0%，植物乳杆菌HM-20的种量为4%时，浸泡水pH为6.5，培养温度37±1℃，培养时间32h，测得植物乳杆菌HM-20活菌数为9.5×108cfu/g。
结果：枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20混菌发酵时，其最适接种量为1%（参见图2）。
四、固态发酵时间对活菌数的影响
细菌生长分别经历了延滞期、对数生长期、平衡期和衰退期，在不同时期，生长情况不同，分别对其取样进行活菌计数。
固态发酵培养基为：58%豆粕，2%的糖，水分含量40%，115℃高压灭菌25min。
接种量与培养条件：枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20接种量分别为1.0%和4.0%，浸泡水pH6.5，培养温度37±1℃，培养时间28h，测得植物乳杆菌HM-20活菌数为4.2×108cfu/g。
枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20接种量分别为1.0%和4.0%，浸泡水pH6.5，培养温度37±1℃，培养时间36h，测得植物乳杆菌HM-20活菌数为1.9×1010cfu/g。
枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20接种量分别为1.0%和4.0%，浸泡水pH6.5，培养温度37±1℃，培养时间48h，植物乳杆菌HM-20活菌数为2.2×1010cfu/g。
结果：综合考虑到生产成本和生产周期时，当枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20混菌发酵时，最适发酵时间为36h。
结论
当枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20接种量分别为1.0%和4.0%，浸泡水的pH为6.5，培养温度37±1℃，培养时间36h后，其活菌数较高，测得植物乳杆菌HM-20的活菌数为1.9×1010cfu/g（参见图3、图4、图5、图6）。

Claims (6)

1.用于饲料添加剂益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HM-66和植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）HM-20均为益生菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.6733和CGMCC No.6744，保藏日期为2012年10月29日。
2.用于饲料添加剂益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HM-66和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HM-20进行混菌固态发酵豆粕，制备出营养丰富的并含有大量益生菌的豆粕发酵制品。
3.用于饲料添加剂益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的使用方法，其特征在于包括下列步骤：采用枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20进行混合固态发酵，所述枯草芽孢杆菌HM-66和植物乳杆菌HM-20种子培养基为：棉籽糖2%，豆粕1%，加水至100%，pH7.0-7.2。固态发酵培养基：58%豆粕，2%的糖，水分含量40%；
所述的枯草芽孢杆菌HM-66种子培养条件，放置于摇床上，转速为150r/min，温度为37℃，培养20h。所述的植物乳杆菌HM-20的种子培养条件，置于恒温培养箱静置培养，培养温度37℃，培养时间为20h；
所述固态发酵培养条件为：枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20的接种量分别为1.0%和4.0%。
4.根据权利要求3所述的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的使用方法，其特征在于：其中枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20混合发酵的益生菌活菌数在1010cfu/g以上。
5.根据权利要求3所述的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的使用方法，其特征在于：在枯草芽孢杆菌HM-66与植物乳杆菌HM-20混合发酵过程中，pH呈先下降后上升的趋势，pH变化范围为5.44-6.60。
6.根据权利要求3所述的用于饲料添加剂益生菌固体发酵的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的使用方法，其特征在于：枯草芽孢杆菌HM-66与干酪乳杆菌F-08混菌发酵，在发酵48h后，游离氨基态氮含量可达到529.1umol/g，小肽含量增加了81.3%，大肽减少了77.2%。
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