CN114410529A - 巨大芽胞杆菌固态高密度发酵的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域,公开了一种巨大芽孢杆菌的高密度固态发酵配方。本发明开发了一种适用于巨大芽孢杆菌高密度固态发酵培养基。该培养基组分易得、廉价,对于巨大芽孢杆菌的菌数有极大的提高,本发明所提供的培养基配方,能显著提高固态发酵中巨大芽孢杆菌的活菌数至363*108cfu/g,提高了785.4%,这是在发酵领域极难达到的提升高度。本发明探究出了巨大芽孢杆菌的高密度固态发酵的培养基配方,且确定了最适的发酵环境,适用于大规模推广。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域,具体为巨大芽胞杆菌固态高密度发酵的培养基及培养方法。
背景技术
巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)属于芽孢杆菌属,是一种好氧产芽孢的***,菌体直径大于1.0μm,俗称“大芽孢”菌,是一种有益的土壤细菌。具有对环境友好、对粮食作物安全、对人畜无害等优点而受到了人们的普遍关注和深入研究。1935年苏联学者蒙基娜从土壤中分离了一株具有解磷作用的巨大芽孢杆菌并投入生产开始(东秀珠和蔡妙英2001)。20世纪50至60年代,为解决土壤中有效磷含量较低的问题,我国开始对巨大芽孢杆菌进行研究,并将其作为解磷菌用于微生物肥料的生产(李阜棣等1995)。随着研究的深入,巨大芽孢杆菌的作用进一步被发掘,已经开始逐渐广泛地应用于解磷固氮、生物防治、畜牧养殖、水体净化、酶工程等方面(梁绍芬1994)。在巨大芽胞杆菌发酵工艺方面,主要有液体发酵和固体发酵两种。其中液体发酵菌数能够达到89.34*108cfu/mL(吉玉玉等2018),固态发酵目前研究较少,利用浅盘自然发酵,其营养成份和发酵条件纯在较大的不确定性,对发酵产物性能的稳定性也不高,存在一定的研究空白。
在发酵培养基的筛选中,影响比较显著的成分有碳源、氮源、无机盐以及一些微量元素。目前可以用于工业生产的碳源、氮源、无机盐等种类非常多,特别是碳源和氮源来源通常为天然的组分,这些组分对于产物产量的影响很大,比如常用的玉米豆粕类型的固态发酵培养基在培养地衣芽孢杆菌和酿酒酵母时,菌数存在数量级的差异,前者能达到100*108cfu/g而后者约只有10*108cfu/g。麸皮作为基质的糖蜜棉粕型和玉米豆粕型的固态发酵培养基发酵巨大芽孢杆菌时也存在巨大的差异,后者也达到了90*108cfu/g。
可本发明的方向首先将发酵方式由标准的液态发酵转为目前成分不明确条件不稳定的固态发酵,并逐步确定其最适合的发酵组分及发酵条件,找出一种特异性提高巨大芽孢杆菌菌数的固态发酵培养基配方。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于巨大芽胞杆菌固态高密度发酵的培养基。
本发明的另一个目的是提供该培养基在培养巨大芽孢杆菌中的应用。
为了达到上述目的,本发明采取以下技术措施:
一种适用于巨大芽孢杆菌的高密度固态发酵培养基,包括:麸皮12-18g、大米粉0.6-0.9g、玉米浆0.6-0.9g、碳酸钙0.4-0.7g、硫酸镁0.01-0.04g、磷酸氢二钾0.04-0.08g和氯化钠0.05-0.2g,pH 6.8-7.0,水12-18mL。
本发明的保护内容还包括,上述发酵培养基在培养巨大芽孢杆菌中的应用,其应用中的发酵参数包括:
温度34-39℃,初始pH调整为5.8-7.5,每隔9-15h搅拌一次,每隔18-26h补水3-6mL,接种量为2-7*107cfu/g。
以上所述的应用中,优选的,所述的巨大芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M2019660。与现有技术相比,本发明具有以下特点:
1.根据现有的发酵配方,通过现有的成分之间的比例调配,固态发酵之后的菌数最多到达41*108cfu/g。本发明所提供的培养基配方,能显著提高固态发酵中巨大芽孢杆菌的活菌数至363*108cfu/g,提高了785.4%,这是在发酵领域极难达到的提升高度。
2.高密度发酵时此方法采用了低成本原料,不仅可以提高其生长性能,同时简化发酵流程,降低生产成本,为巨大芽胞杆菌扩大生产应用提供了可能。
附图说明
图1为不同配方的固态发酵培养基发酵对比实验,其中发酵培养基D为本发明所得配方。
图2为不同发酵条件下的巨大芽孢杆菌FJW1的固态发酵对比实验。
图3为液态LB培养巨大芽孢杆菌、固态培养基培养巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌发酵对比实验。
具体实施方式
本发明所述技术方案,如未特别说明,均为本领域的常规方案;所述试剂或材料,如未特别说明,均来源于商业渠道。本发明实施例所用菌株是以该菌株为例进行的示例,用到的是该菌株的常规生理生化特性,并不构成对保护范围的限定。
实施例1:
不同配方的固态发酵培养基发酵对比实验
1.配制不同个固态发酵培养基
发酵培养基A:白酒糟15g,玉米粉0.8g,豆粕粉0.7g,氯化钠0.9g,水15mL,pH 6.8-7.0;
发酵培养基B:石英砂15g,糖蜜1g,棉粕0.75g,水15mL,自然pH;
发酵培养基C:蛭石15g,大米粉0.75g,菜籽粕0.8g,硫酸镁0.02g,氯化钠0.05g,硫酸亚铁0.001g,pH 6.8-7.0,水15mL;
发酵培养基D:麸皮15g、大米粉0.75g、玉米浆0.75g、碳酸钙0.6g、硫酸镁0.03g、磷酸氢二钾0.06g和氯化钠0.1g,pH 6.8-7.0,水15mL;
发酵培养基E:麸皮12g、大米粉0.6g、玉米浆0.6g、碳酸钙0.4g、硫酸镁0.01g、磷酸氢二钾0.04g和氯化钠0.05g,pH 6.8-7.0,水18mL;
发酵培养基F:麸皮18g、大米粉0.9g、玉米浆0.9g、碳酸钙0.7g、硫酸镁0.04g、磷酸氢二钾0.08g和氯化钠0.2g,pH 6.8-7.0,水12mL;
1.种子液的制备
将-80℃甘油管保藏的巨大芽孢杆菌FJW1(201911064132.X,CCTCC NO:M2019660)接种于三角瓶中(LB培养基),37℃,180rpm摇床培养12h,备用。
2.发酵培养
按5*107cfu/g的接种量将菌悬液接入到上述各发酵培养基中,37℃恒温,固态发酵每隔12h人工搅拌一次,每隔24h补水5mL,培养48h。
3.活菌计数
将所得发酵产物用水稀释后,按照稀释涂布平板法进行活菌计数。
利用发酵培养基D对巨大芽孢杆菌进行发酵,原材料便宜易于获取,生产成本低,发酵效果显著,活菌数最高可达363*108cfu/g,完全可以满足实际应用的需求。采用同样培养条件,接种于发酵培养基A中的菌株,其发酵产物中活菌的含量为41*108cfu/g,接种于发酵培养基B中的菌株,其发酵产物中活菌的含量为34*108cfu/g;采用同样培养条件,接种于发酵培养基C中的菌株,其发酵产物中活菌的含量为29*108cfu/g;采用同样培养条件,接种于发酵培养基E中的菌株,其发酵产物中活菌的含量为290*108cfu/g;采用同样培养条件,接种于发酵培养基F中的菌株,其发酵产物中活菌的含量为305*108cfu/g(图1)。
实施例2:
不同发酵条件下的巨大芽孢杆菌FJW1的固态发酵结果:
1.种子液的制备
将-80℃甘油管保藏的巨大芽孢杆菌FJW1(201911064132.X,CCTCC NO:M2019660)接种于三角瓶中(LB培养基),37℃,180rpm摇床培养12h,备用。
2.培养基的配置
麸皮15g、大米粉0.75g、玉米浆0.75g、碳酸钙0.6g、硫酸镁0.03g、磷酸氢二钾0.06g和氯化钠0.1g,pH调整至6.8-7.0,水15mL;
3.发酵培养
按5*107cfu/g的接种量将菌悬液接入到上述发酵培养基中,,分别按照下述发酵条件进行培养,其余条件同实施例1。
条件1:温度39℃,初始pH调整为5.8,每隔15h搅拌一次,每隔26h补水3mL,接种量为7*107cfu/g;
条件2:温度34℃,初始pH调整为7.5,每隔9h搅拌一次,每隔18h补水6mL,接种量为2*107cfu/g。
3.活菌计数
将所得发酵产物用水稀释后,按照稀释涂布平板法进行活菌计数。
采用同样培养基,条件1发酵培养的菌株,其发酵产物中活菌的含量为287*108cfu/g;采用同样培养基,条件2发酵培养的菌株,其发酵产物中活菌的含量为276*108cfu/g(图2)。
实施例3:
本发明提供的发酵培养基对巨大芽孢杆菌FJW1和枯草芽孢杆菌(保藏编号:CGMCC1.3358,CN108130304A)发酵对比实验:
1.配制培养基
LB液态培养基(A),胰蛋白胨10g/L,酵母3.0g/L,初始pH值为7.0,装液量50mL/250mL;
固态发酵培养基(B):麸皮15g、大米粉0.75g、玉米浆0.75g、碳酸钙0.6g、硫酸镁0.03g、磷酸氢二钾0.06g和氯化钠0.1g,水15mL;本实施例在图3中简称为优化。
2.种子液的制备
将-80℃甘油管保藏的巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌接种于三角瓶中(LB培养基),37℃,180rpm摇床培养12h,备用。
1.发酵培养
按5*107cfu/g的接种量将菌悬液接入到上述各发酵培养基中,37℃恒温,其中液体发酵A/B放置摇床180rpm振荡、固态发酵每隔12h人工搅拌一次,每隔24h补水5mL,培养48h。
2.活菌计数
将所得发酵产物用水稀释后,按照稀释涂布平板法进行活菌计数。
利用上述方法,测得接种于发酵培养基A或B中的巨大芽孢杆菌,其液态发酵液的活菌含量为11.2*108cfu/ml、固态发酵液中活菌的含量为363*108cfu/g;接种于发酵培养基A或B中的枯草芽孢杆菌,其液态发酵液的活菌含量为15*108cfu/ml、固态发酵液中活菌的含量为102*108cfu/g(图3)。
Claims (3)
1. 一种适用于巨大芽孢杆菌的高密度固态发酵培养基,包括:麸皮12-18g、大米粉0.6-0.9g、玉米浆0.6-0.9g、碳酸钙0.4-0.7g、硫酸镁0.01-0.04g、磷酸氢二钾0.04-0.08g和氯化钠0.05-0.2g,pH 6.8-7.0,水12-18mL。
2.权利要求1所述的发酵培养基在培养巨大芽孢杆菌中的应用,其应用中的发酵参数包括:
温度34-39℃,初始pH调整为5.8-7.5,每隔9-15h搅拌一次,每隔18-26h补水3-6mL,接种量为2-7*107cfu/g。
3.根据权利要求2所述的应用,所述的巨大芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M2019660。
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