CN114410526B - 一株地衣芽孢杆菌xnrb-3及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株地衣芽孢杆菌XNRB‑3及其应用，属于农业微生物技术领域。该菌株的生物保藏号为：CGMCC NO.15308。本发明提供的菌株具有降解根皮苷等酚酸类物质和拮抗病原菌的功能，其发酵代谢物中含有抗真菌活性物质和促进植物生长的物质，其中α‑红没药醇和2，4‑二叔丁基苯酚对许多病原真菌有显著的抑制作用，丁二酸，单甲酯和邻苯二甲酸二丁酯可促进拟南芥的根系伸长和侧根发育。该菌株还可生产蛋白酶、纤维素酶、壳聚糖酶和β‑1，3‑葡聚糖酶等；分泌铁载体和生长素，且具有一定的溶磷、解钾及固氮能力。在盆栽和田间试验中，菌株XNRB‑3的加入显著促进了苹果砧木平邑甜茶幼苗和两年生苹果幼树的生长。

Description

一株地衣芽孢杆菌XNRB-3及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株地衣芽孢杆菌XNRB-3及其应用。
背景技术
苹果再植病(ARD)是一种由生物和非生物因素引起的土壤病害。它发生在世界各地的主要苹果种植区，对苹果产业的发展构成重大威胁。越来越多的研究表明，生物因素是引起ARD的主要原因，主要包括：线虫、真菌(立枯丝核菌、土赤壳菌、镰孢菌、链格孢菌和柱孢菌)、卵菌(腐霉、疫霉菌)。非生物因素也可能在重茬障碍中发挥重要作用，如土壤理化性质、营养元素、病害根系中酚类化合物或植物毒素的积累。
以往的研究表明，镰孢菌是导致中国、南非和意大利ARD发生的主要病原体之一。目前，化学熏蒸剂和土壤消毒是控制ARD的有效手段。然而，由于环境污染和相关的健康威胁，溴甲烷现在正逐步被限制使用。生物防治剂的应用被认为是一种减少植物疾病影响的生态、友好的可持续方法。植物促生根际细菌(PGPR)是一类在植物根部定植并促进植物生长发育的细菌。许多不同的细菌属，如芽孢杆菌，克雷伯氏菌和假单胞菌，可以定殖在不同的植物器官。这些细菌可以刺激植物生长，增加产量，减少病原菌感染，并在广泛的环境条件下减少生物或非生物植物胁迫，使它们成为生物防治剂的最佳候选，因为它们能够有效地控制许多不同植物病害。芽孢杆菌属的细菌产生耐热和抗干燥的孢子，因此更适合用于生物杀菌剂。生物防治剂通过产生抗生素、抗真菌代谢产物以及不同细胞壁降解酶来控制植物病原体等有害微生物。除具有抗真菌活性外，还可通过固定N2促进植物生长，不溶性磷的溶解作用，生产铁载体、植物激素(如IAA)和挥发性有机化合物(VOCs)诱导***性抗病。从西瓜根际分离的解淀粉芽孢杆菌L3产生的2-nonanone和2-heptanone对尖孢镰孢菌(FON)有较强的抗真菌性能，由其产生的挥发性有机化合物丙酮和2，3-丁二醇还可促进植物生长。Marques等研究发现，所有分离的细菌在体外测试其植物促生长(PGP)能力时都能产生吲哚乙酸、氰化氢和氨。Azabou等从根组织中分离出一种对黄萎病有较强防治作用的B.velezensis OEE1，可显著降低最终平均病害严重指数(FMS)、死亡植株百分比(PDP)和病害进展曲线下面积(AUDPC)。
然而，可用于防治ARD的芽孢杆菌生物防治剂相对较少。因此，需要对生物防治剂进行更多的研究，以扩大ARD生物防治剂的范围。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株地衣芽孢杆菌XNRB-3及其在ARD生物防治中的应用。该菌株对尖孢镰孢菌、轮枝镰孢菌、层出镰孢菌和腐皮镰孢菌均具有显著的拮抗作用；对导致苹果重茬障碍的根皮苷等酚酸类物质具有降解效果；还能够促进重茬苹果幼树的生长；能有效防控和缓解苹果重茬障碍问题。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3，该菌株已于2018年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.15308。
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3，分离自重茬苹果园健康果树根系，具有如下特征：
在LB平板培养基上37℃培养24h，菌落表面呈白色，边缘不规则，表面由平到凸、光滑、不透明。菌落在液体培养基中生长形成生物膜。在荧光显微镜(100×/1.30油镜)下观察，单个细菌呈长杆状；形成卵形孢子(0.5-0.7×1.0-1.4μm)，中生或亚末端，革兰氏染色阳性。SU-8010扫描电镜观察，单个细菌呈杆状，两端钝端，无鞭毛；细菌单生，成对或链状生长；它们的大小为(0.1～0.8)μm×(1.5～3.5)μm。
含有上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的菌剂也属于本发明的保护范围。
所述菌剂中，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3可以被培养的活菌、发酵液、菌悬液、无细胞培养滤液或胞外代谢产物的形式存在。
作为优选，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的发酵液由如下方法制备而成：
将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3接种到液体发酵培养基中，在33℃，191rpm培养2-4天；
所述液体发酵培养基的组成为：蔗糖21.03g/L、牛肉膏8.54g/L、MgSO4 1.0g/L、K2HPO4 1.5g/L、KCl 1.0g/L；pH 7.5。
作为优选，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的菌悬液由如下方法制备而成：
将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的发酵液离心后，菌体沉淀用无菌水重悬，获得菌悬液。
作为优选，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的无细胞培养滤液由如下方法制备而成：
将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的发酵液离心后，取上清，过滤，获得无细胞培养滤液。
作为优选，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的胞外代谢产物由如下方法制备而成：
用乙酸乙酯提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的发酵上清液，然后浓缩得到粗提物；将粗提物加入甲醇溶解。
进一步的，所述菌剂中除包含地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3外，还可包含农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂中的一种或多种。本发明对于所述农药学上可接受的辅料的来源没有特殊限制，一般采用市售产品即可。
所述菌剂的剂型可以为可湿性粉剂、水分散剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。
本发明的第二方面，提供上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3或者含有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的菌剂在如下(1)-(6)至少一项中的应用：
(1)抑制植物病原菌的生长；
(2)制备用于抑制植物病原菌的产品；
(3)防治由植物病原菌所致病害；
(4)制备用于防治由植物病原菌所致病害的产品；
(5)降解酚酸类物质；
(6)制备用于降解酚酸类物质的产品。
优选的，所述植物病原菌为尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)、层出镰孢菌苹果专化型MR5(Fusarium proliferatumf.sp.malus domestica)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、疫霉菌(Phytophthora)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、链格孢病菌(Alternaria alternata)和苹果腐烂病菌(Valsamali)中的一种或多种。
优选的，所述酚酸类物质为根皮苷、苯甲酸、阿魏酸、香草酸、没食子酸、根皮素中的一种或多种。
本发明的第三方面，提供地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3在如下(1)-(7)至少一项中的应用：
(1)溶解磷酸盐和钾；
(2)固氮；
(3)生产IAA、GA和ABA；
(4)生产ACC脱氨酶、氨和淀粉酶；
(5)生产铁载体；
(6)生产纤维素酶、果胶酶、β-1，3-葡聚糖酶、壳聚糖酶和蛋白酶；
(7)生产抗真菌活性物质。
优选的，所述抗真菌活性物质为α-红没药醇和2，4-二叔丁基苯酚。
本发明的第四方面，提供上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3或者含有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的菌剂在如下(1)或(2)中的应用：
(1)减轻苹果重茬障碍；
(2)制备减轻苹果树重茬障碍的生防制剂或菌肥。
本发明的第五方面，提供上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3或者含有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的菌剂在如下(1)-(4)至少一项中的应用：
(1)促进重茬苹果幼苗/幼树地上部及地下部的生长；
(2)抑制土壤中引起苹果重茬障碍的病原菌的生长；
(3)提高重茬土壤中细菌/真菌的比值；
(4)提高苹果重茬土壤中土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶的活性。
本发明的第六方面，提供一种减轻苹果重茬障碍的方法，包括以下步骤：
将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3或者含有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3的菌剂施于苹果重茬土壤中。
本发明的有益效果：
本发明首次从重茬苹果园健康果树根系中分离得到一株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)XNRB-3，该菌株对多种病原菌有抑制作用，特别是对引起苹果重茬障碍的尖孢镰孢菌、轮枝镰孢菌、层出镰孢菌和腐皮镰孢菌具有极强的拮抗效果；该菌株对导致苹果重茬障碍的酚酸类物质具有降解效果。该菌株还能促进重茬苹果幼苗/幼树的生长；在减轻苹果重茬障碍方面具有优异的效果，可用于苹果重茬障碍的防治。
附图说明
图1：菌株XNRB-3在LB平板培养基上37℃培养24h(A)，采用尼康荧光显微镜BX-51(B-C)和SU-8010扫描电子显微镜D-I观察细胞形态学特征。注：A为单菌落形态；B-C为显微镜下细菌的形状和大小，bar＝100×/1.30油镜；D-I为电镜下细菌的形状和大小。
图2：菌株XNRB-3基于16S rDNA、gyrA、gyrB和rpoB序列的***发育树。树的右侧提供了分支编号和拉丁文名称，这些名称在处理物种时作为参考。组合序列数据集包括35个群内类群，其中多粘类芽孢杆菌BLB267为群外类群。
图3：XNRB-3菌株Biolog生理生化鉴定结果。
图4：XNRB-3菌株最佳液体发酵条件下的生长曲线。
图5：菌株XNRB-3对植物病原真菌的抑制率。列上的小写字母表示p<0.05时差异显著。V值为平均值±SD。
图6：菌株XNRB-3对尖孢镰孢菌的抑菌活性。A-D为尖孢镰孢菌的正常菌丝和孢子，E-L为经过菌株XNRB-3发酵液处理的尖孢镰孢菌菌丝。
图7：不同处理对四种镰孢菌孢子萌发的影响。
图8：不同处理对镰孢菌孢子萌发率的影响。列上的小写字母表示p<0.05时差异显著。V值为平均值±SD。
图9：菌株XNRB-3在不同浓度根皮苷无机盐培养基上的生长。A：对照，B-D：1mmol/L，E-G：2mmol/L，H-J：3mmol/L，K：4mmol/L，L：5mmol/L。
图10：根皮苷标准曲线。纵坐标是吸光度值，横坐标是根皮苷的浓度。
图11：不同处理下根皮苷的降解情况。纵坐标为根皮苷浓度，横坐标为接种时间。
图12：菌株XNRB-3具有多种植物促生长活性。A：磷酸盐溶解，B：钾溶解，C：固氮，D：几丁质酶分解活性，E：铁载体产生，F：氨生产，G：果胶酶活动，H：淀粉酶生产，I：纤维素活动，J：β1，3-葡聚糖酶活性，K：蛋白酶活性，L：壳聚糖酶活性。
图13：菌株XNRB-3生产IAA。
图14：细胞外代谢产物的GC-MS鉴定结果。
图15：不同浓度2,4-二叔丁基苯酚对植物真菌病原菌在PDA培养基上生长抑制作用。
图16：不同浓度α-红没药醇对植物真菌病原菌在PDA培养基上生长的抑制作用。
图17：纯化合物对拟南芥Col-0生长的促进作用。Wa:水，En:乙醇，A:2,3-丁二醇(100μg)，B:1,2-苯二甲酸，双(1-甲基乙基)酯(100μg)，C:2,4-二叔丁基苯酚(500μg),D:丁二酸单甲基酯(500μg)，E:α-红没药醇(500μg)，F:乙偶姻(500μg)，G:邻苯二甲酸二丁酯(500μg)，H:3-壬烯-2-酮(500μg)，I:苯甲酸，3，4-二甲基-甲酯(100μg)。
图18：不同处理对平邑甜茶幼苗生物量的影响，A：株高，B：地径，C：鲜重，D：干重。列上的小写字母表示p<0.05时差异显著。V值为平均值±SD。CK1：31年果园土壤，CK2：溴甲烷熏蒸，T1：肥料载体，T2：XNRB-3细菌肥料。
图19：不同处理的苹果幼树生物量，包括株高(C)、地径(D)、分枝数(E)和平均分枝长(F)。(A)2020年7月不同处理苹果幼树生长情况；(B)2021年10月不同处理苹果幼树生长情况。A1-A3:CK128年果园土壤，C1-C3:CK2溴甲烷熏蒸，B1-B3:T1肥料载体，D1-D3:T2XNRB-3细菌肥料。列上的小写字母表示p<0.05时差异显著。V值为平均值±SD
图20：A：2020年7月不同处理对土壤酚酸的影响；B：2021年10月不同处理对土壤酚酸的影响；C-F：菌株XNRB-3对苹果幼树根际微生物数量的影响；G-J：不同处理对土壤酶活性的影响；K-N：实时qPCR分析不同处理对四种镰孢菌基因拷贝数的影响。CK1：28年果园土壤，CK2：溴甲烷熏蒸，T1：肥料载体，T2：XNRB-3细菌肥料。列上的小写字母表示p<0.05时差异显著。V值为平均值±SD。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，可用于防治ARD的芽孢杆菌生物防治剂相对较少。基于此，本发明从健康果树根系中分离到一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3。本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3与现有报道的地衣芽孢杆菌相比，具有如下突出的优势：
(1)本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3为根内生菌株，应用于果树防重茬具有天然的定殖优势。
(2)本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)XNRB-3集多种功能于一体，其具有降解根皮苷等酚酸类物质和拮抗病原菌的功能；其发酵代谢物中含有抗真菌活性物质和促进植物生长的物质，其中α-红没药醇和2，4-二叔丁基苯酚对许多病原真菌有显著的抑制作用，丁二酸，单甲酯和邻苯二甲酸二丁酯可促进拟南芥的根系伸长和侧根发育。该菌株还可生产蛋白酶、纤维素酶、壳聚糖酶和β-1，3-葡聚糖酶等；分泌铁载体和生长素，且具有一定的溶磷、解钾及固氮能力。在盆栽和田间试验中，菌株XNRB-3的加入显著促进了苹果砧木平邑甜茶幼苗和两年生苹果幼树的生长。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：
发酵培养基：蔗糖20.0g，酵母膏15.0g，MnSO4 1.0g，NaH2PO4.2H2O 2.0g，Na2HPO4.2H2O 4.0g，蒸馏水1000mL。
需氧性测定培养基、葡萄糖氧化发酵培养基、淀粉水解培养基、硝酸盐还原培养基、V-P培养基、M.R.培养基，均按《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英编著)的方法配制。
ARD专化型层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)MR5，其分类命名也称为“层生镰刀菌”，MR5菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.22426，保藏时间为2021年5月17日，记载在专利CN113817613A和专利CN113881573A中。菌株MR5仅对苹果砧木具有致病性，属于苹果专化型。
根皮苷、肉桂酸(CA)、阿魏酸(FA)、苯甲酸(BA)和对羟基苯甲酸(PHBA)的化合物购自Sigma公司。
实施例1：菌株的分离和鉴定
1.菌株的分离纯化：
采用改良的贴根段法从山西省晋城市再植果园中选取健康旺盛苹果的根系立刻进行内生拮抗细菌的分离和筛选。先用自来水冲洗根部5min去除粘附的土壤颗粒，然后在75％乙醇中浸渍2min进行表面灭菌，后用无菌水冲洗3次，然后在5％的次氯酸钠溶液浸泡5min，最后用无菌水冲洗5次。适当干燥后，将表面灭菌的根切成1cm的根段，转移到LB培养基中分离内生细菌，每个培养皿中放置四根，培养皿在37℃下保持一周。此外，将最后一次冲洗根系的无菌水涂布到相同的培养基上放置到相同环境下培养，确认根部是否已经完全消毒。结果显示涂布的平板上没有杂菌产生，待平板内长出单菌落后，挑取不同形态的单菌落于新的LB平板上划线纯化。同时，将纯化的菌株接种于液体LB培养基中，在37℃下以180rpm恒定振荡12h，4℃下以10000r离心10min后倒掉上清液加入15％的甘油，-80℃储存。
2.菌株的筛选：
采用平板对峙法测定分离出的菌株对四种镰孢菌(尖孢镰孢菌、轮枝镰孢菌、ARD专化型层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)MR5和腐皮镰孢菌)的拮抗作用，即先将细菌划线接种于LB平板上，挑取单菌落接种于发酵培养基中(250mL锥形瓶中装100mL)，在28℃下以180rpm恒定振荡培养48h，然后以10000r离心20min获得细菌菌体，将细菌重新悬浮于PBS缓冲液(pH 7.0，1/25体积，10mmol/L))中，调节浓度至1×109CFU/mL。在PDA平板中央接种一块直径5mm的镰孢菌菌饼，然后将4个无菌滤纸片(直径6mm)等距离置于菌饼四周，每个滤纸片滴10μL细菌悬浮液，用无菌蒸馏水(SDW)作为对照，试验重复三次。所有平板在28℃下孵育7天，测量抑菌带的宽度并计算抑菌率。计算公式为：抑制率＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100％。
最终从山西省晋城市再植果园的健康果树根系中分离到一株抑菌作用最强的菌株，将其命名为菌株XNRB-3。
3.菌株XNRB-3的分类鉴定：
3.1形态学及生理生化鉴定：
XNRB-3菌株在LB平板培养基上37℃培养24h，菌落表面呈白色，边缘不规则，表面由平到凸、光滑、不透明(图1A)。菌落在液体培养基中生长形成生物膜。在荧光显微镜(100×/1.30油镜)下观察，单个细菌呈长杆状；形成卵形孢子(0.5-0.7×1.0-1.4μm)，中生或亚末端，革兰氏染色阳性(图1B-C)。SU-8010扫描电镜观察，单个细菌呈杆状，两端钝端，无鞭毛；细菌单生，成对或链状生长；它们的大小为(0.1～0.8)μm×(1.5～3.5)μm(图1D-I)。
对XNRB-3菌株进行14项生理生化指标检测，结果如表1所示。
表1：XNRB-3菌株的生理生化特征
测试指标 结果 测试指标 结果
过氧化氢反应 + 精氨酸双水解反应 _
接触酶反应 + 蔗糖发酵反应 +
淀粉水解酶 + 葡萄糖发酵反应 _
硝酸盐还原酶 + 甲基红反应 +
吲哚实验 _ Voges-Proskauer反应 +
柠檬酸盐 _ 尿素酶反应 +
硫化氢反应 + 明胶水解酶 +
注：“+”代表阳性反应或可利用；“－”代表阴性反应.
生理生化实验表明，菌株XNRB-3能产生过氧化氢和硫化氢，水解淀粉，还原硝酸盐，利用蔗糖。接触酶、Voges-Proskauer反应、甲基红反应均为阳性，而吲哚酶、精氨酸双水解反应、柠檬酸酶、葡萄糖发酵反应均为阴性。根据Bergey的《***细菌学手册》(第二版)和《普通细菌鉴定手册》，菌株XNRB-3符合地衣芽孢杆菌的生理生化特性(表1)。
3.2 16S rDNA、gyrA、gyrB和rpoB片段的序列分析及***发育分析：
将XNRB-3菌株接种于液体LB培养基中，在30℃下以200r/min的速度振荡培养12h，采用细菌基因组提取试剂盒抽提菌株全基因组DNA。然后以细菌XNRB-3总DNA为模版，采用16S rDNA基因、gyrA基因、gyrB基因和rpoB基因进行PCR扩增，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，送往上海生工生物工程技术有限公司进行测序。
16S rDNA基因扩增选用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反应体系(50μL)：总DNA模板3μL，引物各1μL，d NTP 1μL，10xPCR buffer 5μL，Taq DNA聚合酶0.6μL，ddH2O 38.4μL。PCR扩增反应程序：94℃预变性4min；94℃变性1.5min；55℃退火1min；72℃延伸1.5min；共30个循环，总延伸72℃，10min，4℃保温。
gyrA基因扩增选用引物42f:5’-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3’和1066r:5’-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3’。PCR反应体系(30μL)：Taq PCR Master Mix 15μL，ddH2O12μL，引物各1μL，DNA模板1μL。PCR反应体系：95℃预变性5min；94℃变性1min；62℃退火1min；72℃延伸2min；共30个循环，总延伸72℃，10min，4℃保温。
gyrB基因扩增选用引物up1f:GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA和up2r:AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT。PCR反应体系(30μL)：Taq PCRMaster Mix 15μL，ddH2O 12μL，引物各1μL，DNA模板1μL。PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min；共30个循环，总延伸72℃，10min，4℃保温。
rpoB基因扩增选用引物2292F:AGGTCAACTAGTTCAGTATGGAC和3354R:AAGAACCGTAACCGGCAACTT。PCR反应体系(50μL)：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)10μL，dNTPMixture(2.5mM each)4μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，ddH2O 31.5μL，引物各1μL，DNA模板2μL。PCR扩增反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s；56℃退火30s；72℃延伸30s；共30个循环，总延伸72℃，10min，4℃保温。
将测序结果提交美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GenBank，使用最大似然(ML)方法对16S rDNA、gyrA、gyrB和rpoB的序列进行比对，使用RAxML-HPC2在CIPRES网站(http://www.phylo.org)进行建树分析。树形图在FigureTree v1.4.3和AdobeIllustrator CS6中进行修改和完善。
rpoB和gyrA共测序555-938个碱基，16S rDNA共测序1455个碱基，gyrB共测序1136个碱基。一致性分析表明16S rDNA、gyrA、gyrB和rpoB序列之间没有冲突；因此，这些序列被组合起来。基于四种基因序列比对的最大似然分析显示，菌株XNRB-3与地衣芽孢杆菌的同源性最高(图2)。经鉴定，菌株XNRB-3为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
3.3 Biolog微生物自动分析***：
Biolog GEN III***是一种通过检测细菌利用微孔板上95种碳源进行有氧代谢活动产生的氧化还原产物与显色物质结合而导致吸光度变化以及由于微生物自身生长造成的浊度差异，生成特征指纹图谱，与标准菌株图谱数据库进行比对鉴定菌株。当细菌培养16～24h时，SIM值≥0.50，***自动给出鉴定结果，SIM值越接近1.00，鉴定结果越准确。
通过Biolog GEN III微板TM对碳源利用和化学敏感性的测试表明，菌株XNRB-3可以利用糊精、d-麦芽糖和五二糖等32个碳源，对pH值6，1％NaCl，4％NaCl和8％NaCl条件敏感。菌株XNRB-3属于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，根据碳利用情况鉴定(图3)。PROB值为0.689，SIM值为0.689，DIST值为4.698，说明匹配结果可靠。
综上，将分离得到的菌株XNRB-3鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。并于2018年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.15308。
实施例2：菌株XNRB-3发酵工艺优化及发酵相关产物制备
1.液体发酵条件优化：
菌体发酵液的测定采用比浊法，即发酵液10～15mL在2000r/min下离心2min，测定菌液的OD600值(溶液在600nm波长处的吸光值)，并结合单因素实验、正交实验的结果，Plackett Burman和Box Behnken在响应面分析(RSM)中优化地衣芽孢杆菌XNRB-3液体发酵培养基的组成和发酵条件。
经优化，菌株XNRB-3的最佳液体发酵条件为：
液体发酵培养基的组成：蔗糖21.03g/L、牛肉膏8.54g/L、MgSO4 1.0g/L、K2HPO41.5g/L、KCl 1.0g/L；pH 7.5。
发酵工艺参数为：温度32.73℃，转速191.46、接种量5％、灌装量40％。
在最佳液体发酵条件下，以CK为对照，测定不同培养时间细菌溶液的OD600吸光度值(稀释后)；以OD600吸光度值为纵轴，以培养时间为横轴，绘制生长曲线(图4)。
2.菌株XNRB-3发酵液的制备：
将菌株XNRB-3接种到上述优化后的液体发酵培养基(蔗糖21.03g/L、牛肉膏8.54g/L、MgSO4 1.0g/L、K2HPO4 1.5g/L、KCl 1.0g/L；pH 7.5)中，在33℃，191rpm培养3天，制备得到菌株XNRB-3发酵液。
3.菌株XNRB-3的无细胞培养液的制备：
取菌株XNRB-3发酵液经13400g下离心10分钟，取上清液用0.22μm的膜过滤，得到无细胞培养滤液。
4.菌株XNRB-3的粗提物的制备：
取菌株XNRB-3发酵液经13400g下离心10分钟，分离上清液；上清液用乙酸乙酯进行萃取浓缩，得到粗提物。
实施例3：菌株XNRB-3及发酵相关产物的功能鉴定
1.菌株XNRB-3的广谱抑菌效果：
为了进一步验证XNRB-3菌株是否对植物源性疾病具有广谱抑菌作用，选择另外4种常见病原真菌进一步进行抗菌试验。结果如图5所示。
对峙试验结果表明，XNRB-3菌株对4种病原镰孢菌菌丝的生长有极强的抑制作用。对疫霉菌、立枯丝核菌、链格孢病菌和苹果树腐烂病菌也均有很强的抑制作用。因此，菌株XNRB-3在体外培养皿试验条件下对植物病原菌具有广谱抑菌作用。
2.菌株XNRB-3发酵相关产物对尖孢镰孢菌孢子萌发的影响：
菌株XNRB-3发酵相关产物对尖孢镰孢菌孢子萌发的影响参照于等人(2011)的方法，稍加修改。设置如下不同处理：
CK：将尖孢镰孢菌孢子悬液与无菌水按体积比1:1混合；
FB：将尖孢镰孢菌孢子悬液与实施例2中制备的菌株XNRB-3发酵液按体积比1:1混合；
CFCF：将尖孢镰孢菌孢子悬液与实施例2中制备菌株XNRB-3的无细胞培养液按体积比1:1混合；
Crude extract(CE)：将尖孢镰孢菌孢子悬液与实施例2中制备菌株XNRB-3的粗提物按体积比1:1混合。
每个处理的混合液(约50μL)置于显微镜载玻片上，置于培养皿中湿润消毒滤纸上，20℃保存24h。采用尼康BX-51荧光显微镜测定孢子萌发率(每个处理200个孢子)。当芽管长度至少等于分生孢子直径时，认为分生孢子已萌发。实验重复三次。
菌丝和孢子的显微形态观察表明，对照镰孢菌菌丝粗细均匀，分枝较少，孢子饱满，结构完整，生长强劲(图6A-D)。菌株XNRB-3发酵液处理后菌丝呈不规则网状，厚度不均，皱缩(图6G-L)，变薄(图6I，K)，断裂(图6I，G，H)；孢子细胞壁破裂变形(图6E，I，K，H)；菌丝溶解，细胞已经破裂。菌株XNRB-3的发酵液、无细胞培养滤液和粗提物均显著抑制了镰孢菌孢子的萌发(图7)。
进一步的，采用上述的方法，考察菌株XNRB-3的发酵液、无细胞培养滤液和粗提物对轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)、层出镰孢菌苹果专化型MR5(Fusariumproliferatum f.sp.malus domestica)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)和腐皮镰孢菌(Fusarium solani)孢子萌发率的影响，结果表明：孢子萌发率下降了60％以上(图8)。
3.菌株XNRB-3降解酚酸类物质：
MSM溶液中的微生物生长和酚酸降解试验参考王等人(2021)的方法，并进行了一些修改。含根皮苷(0～10mmol/L)作为唯一碳源的矿物盐培养基(MSM)(K2HPO4 5.8g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，KH2PO4 4.5g/L，CaCl2 0.02g/L，MgCl2 0.16g/L，FeCl3 0.0018g/L，Na2MoO4·2H2O 0.0024g/L，MnCl2·2H2O 0.0015g/L；pH 7.0)用来验证菌株XNRB-3降解根皮苷的能力。将菌株XNRB-3接种到含有0～10mmol/L根皮苷的MSM中，并在33℃的黑暗中培养，以确定根皮苷的最大耐受性。结果表明：根皮苷的浓度到4mmol/L时，菌株XNRB-3已经生长受到限制，含量为5mmol/L时停止生长，因此其最大耐受浓度到4mmol/L(图9)。
用根皮苷(10mmol/L)在每个波长测量MSM溶液的吸光度值，以确定最大吸光度波长为280nm(表2)，制备总共11种浓度为0-10mmol/L的MSM溶液。使用含有0mmol/L根皮素的MSM溶液作为空白校准的参考溶液。测定280nm处的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，根皮苷浓度为横坐标，绘制标准曲线(图10)。
表2：10mmol/L液体根皮苷培养基在不同波长下的吸光度值
Figure BDA0003484727130000111
将菌株XNRB-3接种于6mL液体发酵培养基，然后在33℃下过夜培养。在2500g离心5min后，丢弃上清液，并使用ddH2O将菌体沉淀稀释至OD600值1.0，得到再悬浮分离物；分别将0.1mL和0.2mL的再悬浮分离物转移至10mL含有根皮苷(3mmol/L)的MSM溶液中，并在33℃的黑暗条件下摇动(191转/min)培养60h。从每次处理中提取1mL的细菌悬浮液，在13000g下离心5min，并将上清液在OD280检测，根据标准曲线转换为根皮苷浓度。
根皮苷降解率＝[(未接种细菌的培养液中根皮苷浓度-接种细菌的培养液中的根皮苷浓度)/未接种细菌的培养液中的根皮苷浓度]×100％。
结果表明：菌株XNRB-3在MSM溶液中对根皮苷的利用效率较高(图11)，培养60h后，接种量为1％(即再悬浮分离物的转入量为0.1mL)时降解率为60.75％，接种量为2％时降解率为68.83％。随着接种量的增加，菌株XNRB-3对根皮苷的降解能力增强。
为测试菌株XNRB-3利用其他酚酸的能力，将菌株XNRB-3接种到含有0.5g/L CA、FA、BA或PHBA的MSM溶液中，并根据前述方法测试其生长，将0.2mL再悬浮分离物转移至10mLMSM溶液中，溶液中加入0.5g L-1个CA、FA、BA或PHBA。在33℃下培养12、24、36、48和60小时后，摇动(190转/分钟)，从每次处理中提取1mL细菌悬浮液，并在13 000g下离心5min。用1mLddH2O重新悬浮颗粒以检测OD600，并将上清液与等体积的甲醇混合。将0.1mL混合溶液加入1.9mL 50％甲醇溶液中，经0.22μm孔径滤膜过滤灭菌后进行高效液相色谱分析。对照采用酚酸MSM溶液，但不含细菌，所有测定均进行3个重复。
酚酸的浓度根据峰面积使用外部标准检测，使用UltiMate 3000HPLC***(Dionex，USA)。所有分离均使用
Figure BDA0003484727130000112
C18柱(4.6mm×150mm，5.0μm；Waters，美国马萨诸塞州米尔福德)进行。流动相溶液为0.1％甲酸+2％甲醇(A)和乙腈(B)。采用的梯度洗脱组成为：0分钟，96％A加4％B 10分钟；10％A加90％B 16分钟；96％A加4％B 30分钟；流速为1.0mL/min，注射量为10μL，柱温为20℃，紫外线检测波长为280nm。
结果表明：菌株XNRB-3能有效降解CA、BA、FA和PHBA(表3)，降解率为45.65％～69.20％。
表3：培养60小时后菌株对肉桂酸(CA)、阿魏酸(FA)、苯甲酸(BA)和对羟基苯甲酸(PHBA)的降解。
Figure BDA0003484727130000121
注：列上方的小写字母表示p<0.05处的显着差异。V值是平均值±SD。
菌株XNRB-3还能有效地降解土壤中的根皮苷、CA、BA、FA和PHBA(表4)。在接种9d后，根皮苷的含量下降到2.9292μg/g。接种9d后，土壤中BA和PHBA含量分别下降为18.4953和5.2882μg/g。处理后9d，土壤FA和CA浓度分别下降为13.3669和0.3785μg/g，仅为对照的13.31％和3.63％。
表4：菌株XNRB-3对土壤中酚酸降解效果；土壤样品中添加了根皮苷、肉桂酸(CA)、阿魏酸(FA)、苯甲酸(BA)和对羟基苯甲酸(PHBA)(μg/g)。
Figure BDA0003484727130000122
注：列上方的小写字母表示p<0.05处的显着差异。值是平均值±SD。
4.其他功能：
地衣芽孢杆菌XNRB-3的发酵液在13400g下离心10分钟。去除上清液(细胞外培养基)，在4℃冷冻，用于氨基酸分析。用PITC对氨基酸进行柱前衍生，并在最佳条件下(在pH7.0下运行30mM磷酸盐和3mMβ-CD缓冲液；电压为20kV)通过连接至PA800高效毛细管电泳***(HPCE)配备柱上紫外线检测***的Biochrom 30+氨基酸分析仪分离和定量氨基酸。毛细管为裸熔融石英毛细管，内径50μm，外径375μm，直径67cm(每包3根)。通过将特定氨基酸峰面积与该氨基酸的标准曲线进行比较，计算单个氨基酸浓度。
采用HPCE方法鉴定20种PITC衍生的氨基酸，共分离出17种氨基酸，包括天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)。
通过气相色谱-质谱/选择离子监测(GC-MS/SIM)提取和定量植物激素。对地衣芽孢杆菌XNRB-3在优化的液体发酵培养基中培养7d。七天后，用[D5]-IAA、[2H2]GA、[(±)-3，5，5，7，7，7-d6]-ABA]作为内标物添加地衣芽孢杆菌XNRB-3生长的纯培养滤液，提取，并进行GC-MS/SIM测定和定量。此外，用于定量的GC/MS配备HP-5毛细管柱HP-5(30m长，内径0.25mm，0.25μm膜，最高温度325℃)，并使用He(99.999％)作为载气，压头压力为30kPa，进样温度为200℃，电离电压为70eV。根据样品峰面积与相应内标物的比值计算植物激素浓度。
结果表明：内生细菌XNRB-3具有多种PGP特性，如溶解磷酸盐和钾，固氮，ACC脱氨酶、氨和淀粉酶的生产；铁载体、细胞壁降解酶(纤维素酶、果胶酶、β1，3-葡聚糖酶、壳聚糖酶和蛋白酶)(图12A-L)。IAA、GA和ABA的生产(图13，表5)。
表5:菌株XNRB-3的IAA,GA和ABA的生产水平
Figure BDA0003484727130000131
实施例4：菌株XNRB-3细胞外代谢物的分离鉴定
1.GC-MS鉴定细胞外代谢物
用乙酸乙酯提取菌株XNRB-3的发酵上清液，然后用旋转蒸发器减压浓缩得到粗提物。加入少量甲醇溶解萃取物，过0.22μm滤膜，置于4℃冰箱冷藏。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)和NIST17数据库检索对活性提取物中的化合物进行鉴定。采用GCMSQP2010 Plus仪器进行气相色谱-质谱分析。采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量。色谱和质谱条件参照段等人(2021)的方法。
经GC-MS色谱检测分析，筛选出面积％>0.62、保留指数RI>700的主要抗菌物质(表6)。从组分中鉴定出的物质主要是有机酸和酯类、醇类、酮类、烷烃和酚类(图14)。
表6：细胞外代谢物的GC-MS鉴定结果
Figure BDA0003484727130000141
/>
Figure BDA0003484727130000151
在鉴定的42种化合物中，购买了16种纯化合物进行单独的抗真菌性能测试，结果表明9种纯化合物均表现出对病原真菌的抗真菌活性(表7)。其中2，4-二叔丁基酚和α-红没药醇对植物病原真菌的抑制作用最强，尤其是镰孢菌。在1000μg/L浓度下，抑制率高于50％(图15，图16)。
表7：从地衣芽孢杆菌XNRB3中鉴定出的纯化合物对植物真菌病原体菌丝体生长的抑制作用
Figure BDA0003484727130000161
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Figure BDA0003484727130000171
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Figure BDA0003484727130000181
注：根据Duncan检验，在P<0.05时，后跟相同字母的列中的值没有显着差异。V值是平均值±SD。-,对真菌无抑制作用。*，无法测量真菌的直径。
将上述9种纯化合物分别用酒精稀释，然后将20μL不同浓度的悬浮液涂在9cm直径的二分培养平板另一侧的无菌滤纸盘上。10天后测定拟南芥Col-0幼苗的鲜重。
在这9种纯化合物中，与对照(水和乙醇)相比，丁二酸，单甲酯(500μg)和邻苯二甲酸二丁酯(500μg)显著增强了拟南芥植物的鲜重和根系生长，其次是2,4-二叔丁基苯酚(500μg)、α-红没药醇(500μg)、3-壬烯-2-酮(500μg)、苯甲酸、3,4-二甲基-甲酯(100μg)、2,3-丁二醇(100μg)和乙偶姻(500μg)(图17)。
上述结果表明：菌株XNRB-3细胞外代谢物对多种病原菌具有显著的抑制作用；并且对植物生长具有促进活性，可促进拟南芥的根系伸长和侧根发育。
实施例6：盆栽试验与大田试验
1.盆栽试验设计：
在山东农业大学园艺科学与工程学院国家苹果工程实验中心和农作物生物学国家重点实验室进行盆栽试验。盆栽试验供试植株为平邑甜茶(Malus hupeheusis Rehd.)幼苗。
2017年3月，将幼苗移栽到苗圃中，当幼苗长到第三真叶时，选取具有相同生长势的幼苗移栽到上口径38cm，下口径28cm，高26cm的泥瓦盆中进行盆栽试验。每盆装约7.543kg土壤，每盆3株平邑甜茶幼苗，每个处理设置20盆重复。当幼苗长到20-30cm时，每盆留两株长势相似的幼苗。盆栽土壤分为以下处理：31年生的老果园土壤(CK1)，31年生的老果园土壤溴甲烷熏蒸(CK2)，菌肥载体处理(T1)，地衣芽孢杆菌XNRB-3菌肥处理(T2)；各处理组统一正常水肥管理，地衣芽孢杆菌XNRB-3菌肥和菌肥载体按照土壤质量的1％进行施用。
盆栽试验所用地衣芽孢杆菌XNRB-3菌肥，由中国德州创迪微生物资源有限公司负责制作，制作方法为：先将地衣芽孢杆菌XNRB-3菌株进行液体发酵(发酵培养基：蔗糖20.0g，酵母膏15.0g，MnSO4 1.0g，NaH2PO4.2H2O 2.0g，Na2HPO4.2H2O 4.0g，蒸馏水1000mL)得到液体菌剂；然后将液体菌剂与灭菌的菌肥载体按1ml：10g混合均匀，使液体菌剂与载体的混合物充分潮湿(45％的湿度最好)，以手握不留水印为宜；搅拌均匀后放在遮阳处盖上塑料布静置24小时，温度保持在35-38℃最佳；24小时后，再把液体菌剂与载体的混合物装入密封容器内，发酵15天后即可使用。
所制备的地衣芽孢杆菌XNRB-3菌肥中，活菌数为5.0×109cfu/g。所有操作均在优化的发酵条件下进行。其中OM为46.21％，TN为2.36％，P2O5为1.49％，K2O为3.03％。
菌肥载体具体为牛粪和麦草秸秆的混合物(牛粪：秸秆＝1：2，重量比)，由中国德州创迪微生物资源有限公司提供。
2.田间试验设计：
为了测试XNRB-3菌肥在田间条件下防治ARD的潜力。在山东省莱州市湾头村进行了田间试验。苹果园重建后发生严重的ARD，果树生长缓慢，成活率低于50％。2020年3月，28年生的果树从果园中移走，并同时建立了重新种植的果园。实验用的苹果苗为2年生嫁接苗。砧木和穗组合为烟富3/T337。嫁接苗茎粗约10mm，固定茎长1.4m。购自莱州自然园艺科技有限公司。植株行距1.5m×4m，树形修剪成纺锤形。XNRB-3细菌肥料的生产如上所述。
试验分为4个处理：28年生的老果园土(CK1)、28年生的老果园土溴甲烷熏蒸处理(CK2)、细菌肥料载体处理(T1)和XNRB-3细菌肥料处理(T2)。按行距挖80cm3种植孔，将菌肥载体和XNRB-3菌肥与土壤混合回填。每棵幼树施用量控制在1kg，每个处理20棵。所有处理在第二个春季开始时进行。所有指标均于2020年7月15日和2021年10月20日测量。去除表层土壤，在不同处理的苹果树周围0.5m范围内采集多个样品。每组重复3次。去除根系、杂草、土壤动物、石头等杂质，将样品分成3份：1份保存于4℃冰箱中，用于测定土壤微生物结构；其中一部分自然干燥进行土壤酶活性、土壤养分、土壤酚酸检测；其中一部分保存在80℃冰箱中提取DNA并进行实时荧光定量分析(盛等人，2020)。
3测定结果
3.1盆栽试验下XNRB-3菌肥对平邑甜茶幼苗的影响
2017年9月份，XNRB-3(T2)处理的平邑甜茶幼苗明显高于对照的生物量，株高，地径，鲜重，干重分别增加了88.07％，61.28％，181.35％和140.44％，仅次于溴甲烷熏蒸处理(图18)。
3.2菌株XNRB-3对苹果树幼苗生物量的影响
XNRB-3菌肥处理(T2)显著促进了苹果树幼树的生长，且这种差异在2021年10月变得显著(图19A-B)。2020年7月和2021年10月，CK1和T1的生物量指标显著低于CK2和T2。2021年10月，T2相对于对照CK1，株高、地径，数量的分支，分支长度平均增加了38.10％、62.79％、49.17％、176.00％，T2的株高、地面直径、数量的分支和平均分支长度是分别是T1的1.27、1.25、1.37、1.77、2.45和2.21倍(图19C-F)。
3.3菌株XNRB-3对土壤环境的影响
2020年7月和2021年10月，土壤酚酸含量CK1和T1最高，CK2和T2最低(图20A-B)。T2组土壤总酚酸含量显著低于CK1组。2020年7月T2土壤中肉桂酸、根皮苷、苯甲酸、阿魏酸和对羟基苯甲酸含量分别比CK1低54.38％、74.02％、77.29％、54.70％和71.83％。2021年10月T2土壤中肉桂酸、根皮苷、苯甲酸、阿魏酸和对羟基苯甲酸含量分别比CK1低87.23％、91.95％、89.80％、84.11％和91.98％。
2020年7月和2021年10月T1和T2中脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性相对于CK1稳定升高。熏蒸处理第一年土壤酶活性降低，然后继续增加，以T2处理增加最显著(图20G-J)。2020～2021年10月T2组脲酶活性分别比CK1组高1.65倍和1.64倍，磷酸酶活性分别高1.56倍和1.93倍，蔗糖酶活性分别高2.03倍和2.34倍，过氧化氢酶活性分别高1.69倍和1.87倍。
2020年7月和2021年10月，XNRB-3菌肥处理(T2)土壤细菌数量显著增加，与CK1相比，T2土壤细菌数量分别增加了107.21％、45.13％、100.79％和113.08％(图20C)。不同处理土壤真菌数量差异显著。与CK1相比，CK2、T1和T2的土壤真菌数量显著减少，T1的土壤真菌数量显著高于T2，T2的效果与熏蒸处理相似。2020年7月和2021年10月，与对照CK1相比，CK2和T2的土壤真菌数量分别降低了58.55％、50.26％、62.74％和52.83％(图20D)。放线菌的数量和土壤中的细菌/真菌的比率明显高于在T2比对照(图20E-F)。qPCR结果显示，2020年7月和2021年10月，与CK1和T1相比，CK2和T2中镰孢菌的丰度显著降低(图20K-N)。2020年7月、2021年10月，F.proliferatum，F.solani，F.verticillioides和F.oxysporum分别增加了50.43％、40.74％、25.96％和22.20％。T2相对于T1分别下降了60.43％、57.97％、28.69％和40.31％。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一株地衣芽孢杆菌 XNRB-3及其应用
<130> 2022
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 通用引物27F
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 通用引物1492R
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物42f
<400> 3
cagtcaggaa atgcgtacgt cctt 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物1066r
<400> 4
caaggtaatg ctccaggcat tgct 24
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 引物up1f
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
gaagtcatca tgaccgttct gcaygcnggn ggnaarttyg a 41
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 引物up2r
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
agcagggtac ggatgtgcga gccrtcnacr tcngcrtcng tcat 44
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物2292F
<400> 7
aggtcaacta gttcagtatg gac 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物3354R
<400> 8
aagaaccgta accggcaact t 21

Claims (9)

1.一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3，其生物保藏号为：CGMCC No.15308。
2. 含有权利要求1所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3的菌剂。
3. 根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3以被培养的活菌、发酵液或菌悬液的形式存在。
4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。
5. 权利要求1所述的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3或者权利要求2-4任一项所述的含有地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3的菌剂在如下（1）-（6）至少一项中的应用：
（1）抑制植物病原菌的生长；
（2）制备用于抑制植物病原菌的产品；
（3）防治由植物病原菌所致病害；
（4）制备用于防治由植物病原菌所致病害的产品；
（5）降解酚酸类物质；
（6）制备用于降解酚酸类物质的产品；
所述植物病原菌为尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum、轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides、保藏编号CGMCC NO.22426的层出镰孢菌苹果专化型Fusarium proliferatum f.sp.malus domestica MR5、腐皮镰孢菌Fusarium solani、疫霉菌Phytophthora、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、链格孢病菌Alternaria alternata和苹果腐烂病菌Valsa mali中的一种或多种；
所述酚酸类物质为根皮苷、肉桂酸、阿魏酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸中的一种或多种。
6. 权利要求1所述的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3在如下（1）-（7）至少一项中的应用：
（1）溶解磷酸盐和钾；
（2）固氮；
（3）生产Indol-3-ylacetic acid、Gibberellin和Abscisic acid；
（4）生产ACC脱氨酶、氨和淀粉酶；
（5）生产铁载体；
（6）生产纤维素酶、果胶酶、β-1，3-葡聚糖酶、壳聚糖酶和蛋白酶；
（7）生产抗真菌活性物质；
所述抗真菌活性物质为α-红没药醇和2，4-二叔丁基苯酚。
7. 权利要求1所述的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3或者权利要求2-4任一项所述的含有地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3的菌剂在如下（1）或（2）中的应用：
（1）减轻苹果重茬障碍；
（2）制备减轻苹果树重茬障碍的生防制剂或菌肥。
8. 权利要求1所述的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3或者权利要求2-4任一项所述的含有地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3的菌剂在如下（1）-（3）至少一项中的应用：
（1）促进重茬苹果幼树地上部及地下部的生长；
（2）抑制土壤中引起苹果重茬障碍的病原菌的生长；所述病原菌为尖孢镰孢菌、轮枝镰孢菌、层出镰孢菌和腐皮镰孢菌；
（3）提高苹果重茬土壤中土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶的活性。
9.一种减轻苹果重茬障碍的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3或者权利要求2-4任一项所述的含有地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XNRB-3的菌剂施于苹果重茬土壤中。
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