CN114410509B - 产气肠杆菌联用产气克雷伯氏菌的菌剂、组合物及应用 - Google Patents

产气肠杆菌联用产气克雷伯氏菌的菌剂、组合物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种产气肠杆菌联用产气克雷伯氏菌的菌剂，所述菌剂用于治理铅镉污染土壤，所述菌剂包括产气肠杆菌和产气克雷伯氏菌；所述产气肠杆菌为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6，拉丁文分类命名为Enterobacter aerogenes，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22888；所述产气克雷伯氏菌为产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn，拉丁文分类命名为Klebsiella aerogenes，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22889。

Description

产气肠杆菌联用产气克雷伯氏菌的菌剂、组合物及应用
技术领域
本发明涉及微生物及其应用，尤其涉及一种产气肠杆菌联用产气克雷伯氏菌的菌剂、组合物及应用。
背景技术
经过几十年的工业发展，大量的采矿冶炼造成了土壤的重金属含量超标，给人类的生存带来威胁。据统计，全世界平均每年排放铅(Pb)约500万吨、镉(Cd)约3万吨。土壤中铅镉污染具有迁移能力，当受到雨水淋溶、垂直下渗、地表径流等作用后可导致地表水和地下水铅镉含量超标。饮用受重金属铅镉污染的地下水或食用受铅镉污染的食物链产品后都可能引发致癌、致疾、致突变的健康疾病。因此以低成本、无污染、高效、可长久修复土壤的重金属污染技术成为当前首要考虑的问题。
目前，土壤重金属修复技术主要有物理修复法、化学修复法、生物修复法等。其中，生物-化学复合修复技术相对于其他修复技术是一种适用范围广、成本低廉、修复周期短的重金属原位修复技术用较为广泛的治理土壤重金属的方法。生物-化学复合修复技术的实质就是在重金属污染土壤中投入生物和化学底物，在生物的特异性作用下化学试剂与重金属发生一系列复杂反应，从而达到固化稳定化土壤重金属的目的，例如：采用解磷微生物搭配难溶性磷源对重金属污染的土壤进行治理，此法不仅解决了化学修复法易二次污染的难点，也解决了生物修复法修复周期太长的问题。
虽然现有的生物-化学复合修复技术一定程度上可以用于治理铅镉污染土壤，但是，现有技术中所采用的微生物和治理方法在实际应用性上并不是特别突出，且易出现反溶现象。截止到目前，土壤污染修复的有效性和长效稳定性依然是难以解决的技术难题。
鉴于此，有必要提供一种产气肠杆菌联用产气克雷伯氏菌的菌剂、组合物及应用，以解决或至少缓解上述土壤治理的有效性和长效稳定性差的技术缺陷。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种产气肠杆菌联用产气克雷伯氏菌的菌剂、组合物及应用，旨在解决现有技术中土壤治理的有效性和长效稳定性差的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供一种产气肠杆菌联用产气克雷伯氏菌的菌剂，所述菌剂用于治理铅镉污染土壤，所述菌剂包括产气肠杆菌和产气克雷伯氏菌；
其中，所述产气肠杆菌为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6，拉丁文分类命名为Enterobacter aerogenes，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22888；
所述产气克雷伯氏菌为产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn，拉丁文分类命名为Klebsiella aerogenes，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22889。
本发明还提供一种如上述任意一项所述的微生物菌剂在治理铅镉污染土壤中的应用。
本发明还提供一种治理铅镉污染土壤的组合物，其特征在于，包括组分A、组分B、组分C和组分D；
其中，所述组分A包括磷源；
所述组分B包括如上述任意一项所述的微生物菌剂；
所述组分C包括含葡萄糖、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵和氯化钾的水溶液；
所述组分D包括含胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的水溶液。
进一步地，所述磷源为磷酸三钙。
本发明还提供一种铅镉污染土壤的治理方法，采用如上述任意一项所述的组合物对铅镉污染土壤进行治理。
进一步地，包括：在第一时间段向待治理的土壤中施加所述组分A、以及含所述组分B和所述组分C的第一混合液；
在第二时间段向所述待治理的土壤中施加含所述组分B和所述组分D的第二混合液；
其中，所述第二时间段晚于所述第一时间段。
进一步地，还包括：在所述第一时间段和所述第二时间段之间，向所述待治理的土壤中施加所述第一混合液。
进一步地，在所述第一时间段和所述第二时间段之间，向所述待处理土壤中多次施加所述第一混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量一致；
在所述第二时间段，向所述待处理土壤中多次施加所述第二混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量一致。
进一步地，所述第一时间段和所述第二时间段的间隔时长为14-16天。
本发明中所用的所述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6的拉丁文分类命名为Enterobacter aerogenes，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22888。
本发明中所涉及的所述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6是从湖南省长沙市湖南先导洋湖再生水有限公司生活污水沉淀发酵池的底泥中分离出的革兰氏阴性菌，其在培养时形成有圆形、凸起、灰白色的菌落，所述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6的适宜生长温度为30℃～35℃，适宜生长PH为6.9-7.2，需氧或兼性厌氧。
本发明中所用的所述产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn的拉丁文分类命名为Klebsiella aerogenes，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22889。
本发明中所涉及的所述产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn是从湖南省长沙市湖南先导洋湖再生水有限公司生活污水沉淀发酵池的底泥中分离出的革兰氏阴性菌；菌落呈明显凸起的圆形、琼脂培养基上形成较大的白色粘液菌落，正中带较少黄色粘液。所述产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn的适宜生长温度为30℃～35℃，适宜生长PH＝6.9-7.2，需氧或兼性厌氧。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种用于治理铅镉污染土壤的微生物菌剂，其不仅利于了产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6和产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn的容磷特性，并且，将原始来源相同的两个菌种共同使用，还可以使菌种之间产生协同作用，提高了土壤中解磷菌的多样性；此外，本发明还利用了微生物在不同培养基中产酸产碱的特性，不仅能够促进微生物溶磷，还能避免钝化产物的反溶。
具体地，所述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6联合磷酸三钙可在15天内99.7％钝化铅镉；在土壤试验中，第7天时，所述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6复合磷酸三钙的处理使土壤Pb、Cd有效态含量的最高去除率分别为45.5％和40.9％；第15天时，有效态含量的最高去除率分别降至30.1％和23.5％，第30天时，Pb、Cd的有效态含量的去除率再次分别达到45％和42％，有效抑制了反溶现象。
所述产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn联合磷酸三钙可在1天内100％钝化铅镉；在土壤试验中，第7天时，所述产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn复合磷酸三钙的处理使土壤Pb、Cd有效态含量的最高去除率分别为49％和49.3％；第15天时，有效态含量的最高去除率分别降至45.1％和46.4％，第30天时，Pb、Cd的有效态含量的去除率再次分别达到51％和51.3％，有效抑制了反溶现象。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为实施例1中产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6和产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn在固体培养基2上培养7天的溶磷圈特征；
图2为实施例1中产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6的容磷量效果图；
图3为实施例1中产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn的容磷量效果图；
图4为实施例1中产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6的***发育树的构建图；
图5为实施例1中产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn的***发育树的构建图；
图6为实施例2中产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6和产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn解磷钝化铅镉反应生成物的XRD图；
图7为实施例3中产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6在不同培养基中的溶磷效果及PH相关性；
图8为实施例3中产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn在不同培养基中的溶磷效果及PH相关性。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施方式中所有方向性指示(诸如上、下……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
为了完成对铅镉污染土壤的治理，本发明提供了一种产气肠杆菌联用产气克雷伯氏菌的菌剂，所述菌剂用于治理铅镉污染土壤，所述菌剂包括产气肠杆菌和产气克雷伯氏菌；
其中，所述产气肠杆菌为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6，拉丁文分类命名为Enterobacter aerogenes，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22888；
所述产气克雷伯氏菌为产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn，拉丁文分类命名为Klebsiella aerogenes，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22889。
所述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6和所述产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn均具有较优的解磷作用，属于解磷菌的范畴。其中，在7天内，所述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6的溶磷量可达到622.2mg/L，所述产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn的溶磷量可达到683.1mg/L。上述两个菌种均能将土壤中难溶性化合态磷转化为可溶性磷，从而用于钝化铅镉，避免直接加入可溶性磷酸盐化合物而引起水体富营养化、土壤酸化、植物营养失衡等问题。因此，使用所述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6和所述产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn可以对铅镉污染土壤进行有效地治理。
具体的钝化过程可以包括：所述菌剂中的微生物和磷酸三钙等难溶性磷源进入受污染的土壤，可以固定重金属(如Pb、Cd、Cu和Zn)，并使其形成高度不溶的金属磷酸盐沉淀物，显著降低了Pb和Cd的迁移率和可用性，其中，镉的钝化产物为Ca7.7Cd0.8(PO4)8(H2O)2.4；铅的钝化产物为Pb5(PO4)3Cl。
需了解的是，本发明还对目前现有解磷菌中的一些具有解磷能力的菌株进行了比较研究。例如：在现有研究中，根据《一株高效解磷菌的筛选以及解磷效果验证》中公开的内容，唐岷宸(2020)等人从农田筛选出了一株高效解磷菌：经16S r DNA分析鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，溶磷量达到495.4mg/L，经条件优化后溶磷量达582.4mg/L。然而，其溶磷效果仍然低于本发明本实施方式中所列的W6和Wn。
在此基础上，所述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6和所述产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn同时作为治理铅隔污染土壤的菌剂，不仅可以提高解磷菌的多样性；而且，由于本发明的两个菌种的原始来源相同，功效类似，因此，可以产生协同作用，例如：两者都能产酸，在共同作用下，环境中的PH下降速度会增大，从而可以进一步提高溶磷效率；此外，需说明的是，所述所述产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6和所述产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn可以产生有机酸和二氧化碳，用于促进重金属矿物的稳定。
鉴于此，本发明还提供了一种如上述任意实施方式所述的菌剂在治理铅镉污染土壤中的应用。
为了便于治理工作的开展，以及进一步提高治理效率，本发明还提供了一种治理铅镉污染土壤的组合物，包括组分A、组分B、组分C和组分D；
其中，所述组分A包括磷源，所述磷源指代的是难溶性磷源，优选可以为磷酸三钙。
所述组分B包括如上述任意实施方式所述的菌剂。
所述组分C包括含葡萄糖、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵和氯化钾的水溶液。
所述组分C为液状，所述组分C的制备过程可以为：将占第一预设质量的48.7％葡萄糖、24.3％氯化镁、1.2％硫酸镁、0.97％硫酸铵、0.49％氯化钾、24.34％磷酸三钙按质量百分比计算后称取葡萄糖、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵和氯化钾(因土壤中会撒施磷酸三钙，因此，可以不加入磷酸三钙)，然后向盛装上述称取组分的容器中加水定容；其中，所述第一预设质量为上述葡萄糖、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵、氯化钾、及磷酸三钙的质量之和，所述第一预设质量与所述组分C的质量体积比可以为2.055g：100ml。
例如：在配制100ml组分C时，按计算需在100ml水中加入1g葡萄糖、0.5g氯化镁、0.025g硫酸镁、0.02g硫酸铵、0.01g氯化钾、及0.5g磷酸三钙；但是，由于实际治理过程中预先向土壤中施加了磷酸三钙，因此，所述组分C中可以不加入磷酸三钙，可以仅在100ml水中加入1g葡萄糖、0.5g氯化镁、0.025g硫酸镁、0.02g硫酸铵、及0.01g氯化钾；当然，也可以先称取固体物，再定容至100ml。
所述组分D包括含胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的水溶液。
所述组分D为液状，所述组分D的制备过程可以为：将占第二预设质量40％胰蛋白胨、20％酵母粉、40％氯化钠按质量百分比计算后称取，然后向盛装上述组分的容器中加水定容；其中，所述第二预设质量为向土壤中预计施加的胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的总质量，所述第二预设质量与所述组分D的质量体积比可以为2.5g：100ml。
例如：配制100ml组分D时，可以向100ml水中加入1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物和1g氯化钠；当然，也可以先称取固体物，再定容至100ml。
值得注意的是，虽然铅镉等可以在微生物和难溶性磷源的双重作用下被钝化，但是，虽然随着反应时间的增长，会出现反溶现象，例如：高度不溶的金属磷酸盐沉淀物会生成CdCO3、CdPO4等物质。
需知道的是，经试验研究，所述菌剂中的微生物在所述组分C中培养时会出现产酸现象和溶磷现象；而在所述组分D中培养时会出现产碱现象，并抑制反溶现象的出现。
所以，本技术从反应产物的角度出发，利用微生物在不同组分中培养时的特性，调控pH强度从酸(组分C中培养)到碱(组分D中培养)，对铅镉进行自然固定稳定化，避免出现反溶，创造性地找到了一种通过pH调控微生物产磷并应用于重金属污染治理的长效机制。
基于所述组合物，本发明还提供了一种铅镉污染土壤的治理方法，其采用如上述任意实施方式所述的组合物对铅镉污染土壤进行治理。
具体地，所述铅镉污染土壤的治理方法包括：在第一时间段向待治理的土壤中施加所述组分A、以及含所述组分B和所述组分C的第一混合液。
需知道的是，所述第一混合液可以类比为菌剂中的微生物在所述组分C中繁殖后的培养液，菌剂中的两种微生物可以分开在所述组分C中繁殖后施加于土壤中，也可共同培养后施加于土壤中。因具体试验过程中，通常直接在微生物的培养液中取液，而在前期菌种培养时，培养液中会带有部分磷酸三钙，因此，所述第一混合液中也可带有磷酸三钙，并不会影响实际的效果。在具体应用时，本领域技术人员可以根据实际情况选择性地决定是否在所述组分C中加入部分磷酸三钙。
在第二时间段向所述待治理的土壤中施加含所述组分B和所述组分D的第二混合液；所述第二混合液可以类比为微生物在所述组分D中繁殖后的培养液，菌剂中的两种微生物可以分开在所述组分D培养后施加于土壤中，也可共同培养后施加于土壤中。
其中，所述第二时间段晚于所述第一时间段。
另外，在所述第一时间段和所述第二时间段之间，也可以向所述待治理的土壤中施加所述第一混合液，以维持土壤含水率和菌的活性。
作为对上述实施方式的一种说明：所述第一时间段为起始时间，即在最开始就向所述待治理的土壤中施加所述组分A(包括难溶性磷源)和所述第一混合液(即带有菌剂中微生物的所述组分C)，以使土壤中的铅镉出现钝化现象。
所述第一时间段和所述第二时间段的间隔时长可以为14-16天，具体地，所述第二时间段和所述第一时间段的间隔可以为15天，即所述第一时间段的15天后，便可以向所述待治理土壤中施加所述第二混合液，以抑制反溶现象的出现，从而强化钝化效果。
此外，在所述第一时间段和所述第二时间段之间施加所述第一混合液，是为了增强溶磷效率，在促进微生物生长的同时，确保前期产生溶磷效果，以保证铅镉在前期的钝化。
进一步地，在所述第一时间段和所述第二时间段之间，向所述待处理土壤中多次施加所述第一混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量一致。在所述第二时间段，向所述待处理土壤中多次施加所述第二混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量一致。
为了便于对本发明做进一步的理解，现举例说明：
实施例1
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6的筛选与鉴定
1、培养条件：好氧，温度30℃，初始PH＝7(即培养基的初始pH为7)；其中，在液体条件下培养时采用150rpm/min摇床培养。
2、培养基配制：液体培养基1、液体培养基2、固体培养基2。
其中，液体培养基1的配制过程为：按需配制的容量和固液浓度(25g/L)计算固体成分的质量，然后按占固体成分质量百分比的40％胰蛋白胨、20％酵母粉、40％氯化钠进行称取，并在称取后定容；
液体培养基2的配制过程为：按需配制的容量和固液浓度(20.55g/L)计算固体成分的质量，然后按占固体成分质量百分比的48.7％葡萄糖、24.3％氯化镁、1.2％硫酸镁、0.97％硫酸铵、0.49％氯化钾、24.34％磷酸三钙进行称取，并在称取后定容；
固体培养基2相比于液体培养基2，需额外添加1.5％的琼脂(质量体积比，即100ml液体培养基2中加入1.5g琼脂)。
3、称取1g取自湖南省长沙市湖南先导洋湖再生水有限公司生活污水沉淀发酵池的底泥放入灭菌离心管中，加入9ml 0.9％的生理盐水制成10-1的菌悬液，放入150rpm/min的摇床培养箱中震荡20min，取出后静置2h。
4、悬液静置后取上清液接种2％至液体培养基2进行专一性的培养；置于摇床上，恒温30℃，150rpm/min，震荡培养2～3d。培养一段时间后另取0.4ml的菌悬液以及4.5ml的超纯水进行梯度稀释，稀释倍数为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的样品菌悬液，10-2、10-4、10-6倍浓度梯度的菌悬液各取200μl，依次均匀的涂布在固体培养基2上，将涂布好的培养皿倒置放入恒温培养箱中，在30℃条件下恒温培养24h后，观察并记录菌落及溶磷圈的大小，做好菌种标记，筛选出5株解磷菌。
5、将筛选出的5株解磷菌分别在固体培养基2上进行平板划线纯化(在无菌操作台里面从5株解磷菌中分别挑选出有明显溶磷圈的解磷菌规范平板划线至不同的固体培养基2，放置30℃培养箱中培养一周)，然后进一步挑选出两株有明显溶磷效果的解磷菌，并记为W6和Wn；其中，W6和Wn的溶磷圈特征如图1所示。
6、解磷菌溶磷后定性分析发酵液中的有效磷含量：钼锑抗比色法。
将W6和Wn的单菌株分别置于不同的液体培养基2中培养7天后进行检测，具体检测过程为：取1％的菌悬液于灭菌的离心管中，在10000rpm的条件下离心后取100μL上清液加入50ml比色管，加入至刻度线三分之二的超纯水，然后加入1ml上述配制A液以及2ml上述配制B液，混合均匀并定容至刻度线，静置显色15min后在紫外可见分光光度计上测定吸光度值，波长设定为700nm，根据标准曲线计算出对应的有效磷含量。另外，本实施例还在同等条件下进行无菌的空白对照试验。
7、在测定后得出结论：参考图2和图3所示，空白对照试验中的有效磷浓度远低于W6和Wn培养液中有效磷的浓度，且W6和Wn以培养基2为营养源时解磷效果极好。在7天内，W6的溶磷量可达到622.2mg/L，Wn的溶磷量可达到683.1mg/L。
8、解磷菌W6和Wn的鉴定：利用引物和对菌株进行扩增和正向测序，通过将序列与NCBI数据库中序列进行对比。
(1)W6与产气肠杆菌相似性达到99％，如图4所示，构建发育树可知鉴定其为Enterobacter aerogenes。
该产气肠杆菌W6菌株的16s DNA基因序列拼接测定结果如下：
Tgcaagtcgagcggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcgaggaggaaggcgttaaggttaataaccttagcgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaacttagcagagatgctttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgattcggtcgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttacc
(2)Wn与产气克雷伯氏菌相似性达到99％，如图5所示，构建发育树可知鉴定其为Klebsiella aerogenes。
该产气克雷伯氏菌Wn菌株的16s DNA基因序列拼接测定结果如下：
Gccctcccgaaggttaagctacctacttcttttgcaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtagcattctgatctacgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgacatactttatgaggtccgcttgctctcgcgaggtcgcttctctttgtatatgccattgtagcacgtgtgtagccctactcgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccagtttatcactggcagtctcctttgagttcccgaccgaatcgctggcaacaaaggataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatttcacaacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtctcagagttcccgaaggcaccaaagcatctctgctaagttctctggatgtcaagagtaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcgacttaacgcgttagctccggaagccacgcctcaagggcacaacctccaagtcgacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctgagcgtcagtctttgtccagggggccgccttcgccaccggtattcctccagatctctacgcatttcaccgctacacctggaattctacccccctctacaagactctagcctgccagtttcgaatgcagttcccaggttgagcccggggatttcacatccgacttgacagaccgcctgcgtgcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctccgtattaccgcggctgctggcacggagttagccggtgcttcttctgcgagtaacgtcaatcgctaaggttattaaccttaacgccttcctcctcgctgaaagtactttacaacccgaaggccttcttcatacacgcggcatggctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttccagtgtggctggtcatcctctcagaccagctagggatcgtcgcctaggtgagccattaccccacctactagctaatcccatctgggcacatctgatggcatgaggcccgaaggtcccccactttggtcttgcgacattatgcggtattagctaccgtttccagtagttatccccctccatcaggcagtttcccagacattactcacccgtccgccgctcgtcacccgagagcaagctctctgtgttaccgctcgacttgca
实施例2
配置铅、镉母液：称取1.5985g硝酸铅、20.317g氯化镉分别溶于盛有500ml超纯水的烧杯，同时用玻璃棒不断搅拌直至溶解，后分别转入1L的容量瓶定容到刻度线，贴上标签备用。
一、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6在钝化铅镉中的作用
1、从W6菌株的平板上挑取单菌落到20mL的液体培养基1(同实施例1)中过夜培养，然后转接到100mL的液体培养基1中扩大培养。
2、观察W6菌株的生长密度，用紫外分光光度计在600nm的波长下测定它的生长曲线，以确定W6菌株的对数生长期和稳定期OD600＝1的时刻用于后续实验；在培养5.5h时，W6达到OD600＝1的稳定期。
4、设置铅镉溶液实验，在灭菌的液体培养基2(同实施例1)里面通过无菌滤头分别加入1ml铅母液和1ml镉母液(100ml液体培养基2中加入1ml铅母液和1ml镉母液)，同时将扩大培养到OD600在1左右的菌液按1％的接菌量加入，然后在30℃，初始PH＝7，150rpm/min的条件下水浴震荡培养，用ICP定时测定溶液中含有的Pb2+、Cd2+的浓度变化。
此外，本实施例还在同等条件下进行了无菌的空白对照试验。
结果显示：在好氧、常压、30℃、初始PH＝7、150rpm/min恒温摇床培养的条件下，在第15天时，实验组基本无法检测到Pb2+、Cd2+的存在。此时铅镉的钝化率为99.7％。
二、产气克雷伯氏菌Wn(Klebsiella aerogenes)在钝化铅镉中的应用
1、从Wn菌株的平板上挑取单菌落到20mL的液体培养基1(同实施例1)中过夜培养，然后转接到100mL的液体培养基1中扩大培养。
2、观察Wn菌株的生长密度，用紫外分光光度计在600nm的波长下测定它的生长曲线，以确定Wn菌株的对数生长期和稳定期OD600＝1的时刻用于后续实验；在培养5h时，Wn达到OD600＝1的稳定期。
4、设置铅镉溶液实验，在灭菌的液体培养基2(同实施例1)里面通过无菌滤头分别加入1ml铅母液和1ml镉母液(100ml液体培养基2中加入1ml铅母液和1ml镉母液)，同时将扩大培养到OD600在1左右的菌液按1％的接菌量加入，然后在30℃，初始PH＝7，150rpm/min的条件下水浴震荡培养，用ICP定时测定溶液中含有的Pb2+、Cd2+的浓度变化。
此外，本实施例还在同等条件下进行了无菌的空白对照试验。
结果显示：在好氧、常压、30℃、初始PH＝7、150rpm/min恒温摇床培养的条件下，在第1天时，ICP已无法测量到Pb2+、Cd2+的存在，此时钝化铅镉为100％。
三、对钝化产物的鉴定
对W6和Wn作用后的钝化反应产物分别进行离心(离心条件:10000rpm离心10min)，留下反应沉淀物(通过3次超纯水洗涤并离心)放入30度烘箱中干燥一星期，等干燥完全即可研磨成粉进行XRD测试。
结果显示：参照图6理解，在W6和Wn的两组试验中，镉的反应产物均包括Ca7.7Cd0.8(PO4)8(H2O)2.4；铅的反应产物均包括Pb5(PO4)3Cl。
实施例3
本实施例所用液体培养基1与实施例1中的等同，并额外加入了与液体培养基2等量的葡萄糖和磷酸三钙；本实施例所用液体培养基2与实施例1中的等同；本实施例所用培养基的初始pH均为7。
一、不同培养基对产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6的作用
吸取1％的W6的培养菌液分别放入培养基1和培养基2中作为不同营养源培养，置于摇床上恒温30℃，150rpm/min，震荡培养一周，每天在相同时间点于无菌操作台上取3ml样品于5ml离心管中，8000rpm的条件下离心5分钟取上清液，且用钼锑抗比色法测定有效磷的含量变化，并且记录下对应的PH值。
测定后结果显示：参照图7理解，以培养基2为营养源时，解磷效果显著，且培养基溶液体系中PH值由中性急剧下降至4左右。
作为对照试验的培养基1本无溶磷现象，PH值稳定上升至9左右，由此可推断W6的解磷效率均与PH值有一定的相关性。
需说明的是，图7中的实线对应的是溶磷量，虚线对应的是PH。
二、不同培养基对产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn的作用
吸取1％的Wn的培养菌液分别放入培养基1和培养基2中作为不同营养源培养，置于摇床上恒温30℃，150rpm/min，震荡培养一周，每天在相同时间点于无菌操作台上取3ml样品于5ml离心管中，8000rpm的条件下离心5分钟取上清液，且用钼锑抗比色法测定有效磷的含量变化，并且记录下对应的PH值。
测定后结果显示：参照图8理解，以培养基2为营养源时，解磷效果显著，且培养基溶液体系中PH值由中性急剧下降至4左右。
作为对照试验的培养基1本无溶磷现象，PH值稳定上升至9左右，由此可推断Wn的解磷效率均与PH值有一定的相关性。
需说明的是，图8中的实线对应的是溶磷量，虚线对应的是PH。
综上：培养基1和培养基2对W6和Wn的作用相同，使得两个菌种均能在培养基2中产酸，在培养基1中产碱。
实施例4
本实施例所用液体培养基1与实施例1中的液体培养基1一致；本实施例中初次喷洒的菌液中所含的液体培养基2与实施例1中的等同；在后续间隔喷洒的含微生物的培养基2中，液体培养基2中未加入磷酸三钙，以避免磷酸三钙的持续性加入对土壤造成影响，该液体培养基2的其余成分的量与实施例1中的保持一致。
一、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6在铅镉污染土壤中的应用
1、称量风干土壤10g(40目)置于50ml离心管中，并通过直接投放的方式加入磷源(难溶性磷源：磷酸三钙)，然后利用干净塑料棒搅拌，使磷酸三钙在土壤样品中均匀分布；
2、向锥形瓶中喷洒提前配置好的产气肠杆菌W6的菌液(菌剂在培养基2里面生长至OD600＝1的稳定期或者对数生长期)并搅拌均匀，最终使土壤含水率(菌液)为30％；
3、前15天每隔3天添加含W6的培养基2(OD＝1)，使土壤保持30％的含水率，后15天每隔3天添加含W6的培养基1(OD＝1)，使土壤保持30％的含水率。投加的磷酸根含量与土壤中Pb、Cd两种重金属元素含量保持一定的比例关系，具体地，磷酸三钙的投加量与土壤中所含Pb(P：HMs＝1：1)、Cd(P：HMs＝5：1)的摩尔质量比相关，最终确定投加量为4mg/g。
另外，本实施例还在同等条件下进行了无菌的空白对照试验。
实验结果显示：上述处理过程与空白对照试验相比，在7天时，微生物W6菌剂复合磷酸三钙的处理使土壤Pb、Cd有效态含量的最高去除率分别为45.5％和40.9％；而在15天时，有效态含量的最高去除率分别降至30.1％和23.5％，说明仅靠解磷作用会出现反溶的情况。在30天时，Pb、Cd的有效态含量的去除率再次分别达到45％和42％，说明培养基的搭配使用可以抑制反溶的现象。
二、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn在铅镉污染土壤中的应用
1、称量风干土壤10g(40目)置于50ml离心管中，并通过直接投放的方式加入磷源(难溶性磷源：磷酸三钙)，然后利用干净塑料棒搅拌，使磷酸三钙在土壤样品中均匀分布；
2、向锥形瓶中喷洒提前配置好的产气克雷伯氏菌Wn的菌液(菌剂在培养基2里面生长至OD600＝1的稳定期或者对数生长期)并搅拌均匀，最终使土壤含水率(菌液)为30％；
3、前15天每隔3天添加含Wn的培养基2(OD＝1)，使土壤保持30％的含水率，后15天每隔3天添加含Wn的培养基1(OD＝1)，使土壤保持30％的含水率。投加的磷酸根含量与土壤中Pb、Cd两种重金属元素含量保持一定的比例关系，具体地，磷酸三钙的投加量与土壤中所含Pb(P：HMs＝1：1)、Cd(P：HMs＝5：1)的摩尔质量比相关，最终确定投加量为4mg/g。
另外，本实施例还在同等条件下进行了无菌的空白对照试验。
实验结果显示：上述处理过程与空白对照试验相比，在7天时，微生物Wn菌剂复合磷酸三钙的处理使土壤Pb、Cd有效态含量的最高去除率分别为49％和49.3％；而在15天时，有效态含量的最高去除率分别降至45.1％和46.4％，说明仅靠解磷作用会出现反溶的情况。在30天时，Pb、Cd的有效态含量的去除率再次分别达到51％和51.3％，说明培养基的搭配使用可以抑制反溶的现象。
本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。
序列表
<110> 中南大学
<120> 产气肠杆菌联用产气克雷伯氏菌的菌剂、组合物及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)
<400> 1
tgcaagtcga gcggtagcac agagagcttg ctctcgggtg acgagcggcg gacgggtgag 60
taatgtctgg gaaactgcct gatggagggg gataactact ggaaacggta gctaataccg 120
cataacgtcg caagaccaaa gtgggggacc ttcgggcctc atgccatcag atgtgcccag 180
atgggattag ctagtaggtg gggtaatggc tcacctaggc gacgatccct agctggtctg 240
agaggatgac cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg 360
ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgagg aggaaggcgt taaggttaat aaccttagcg 420
attgacgtta ctcgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtctgtcaag 540
tcggatgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatt cgaaactggc aggctagagt 600
cttgtagagg ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat 660
accggtggcg aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga 720
gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt 780
gcccttgagg cgtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc 840
gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900
aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat ccagagaact tagcagagat 960
gctttggtgc cttcgggaac tctgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg 1020
tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg ccagcgattc 1080
ggtcgggaac tcaaaggaga ctgccagtga taaactggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1140
gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca cacgtgctac aatggcatat acaaagagaa 1200
gcgacctcgc gagagcaagc ggacctcata aagtatgtcg tagtccggat tggagtctgc 1260
aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag taatcgtaga tcagaatgct acggtgaata 1320
cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta 1380
ggtagcttaa ccttcgggag ggcgcttacc 1410
<210> 2
<211> 1403
<212> DNA
<213> 产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)
<400> 2
gccctcccga aggttaagct acctacttct tttgcaaccc actcccatgg tgtgacgggc 60
ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgtagcattc tgatctacga ttactagcga 120
ttccgacttc atggagtcga gttgcagact ccaatccgga ctacgacata ctttatgagg 180
tccgcttgct ctcgcgaggt cgcttctctt tgtatatgcc attgtagcac gtgtgtagcc 240
ctactcgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccagt ttatcactgg 300
cagtctcctt tgagttcccg accgaatcgc tggcaacaaa ggataagggt tgcgctcgtt 360
gcgggactta acccaacatt tcacaacacg agctgacgac agccatgcag cacctgtctc 420
agagttcccg aaggcaccaa agcatctctg ctaagttctc tggatgtcaa gagtaggtaa 480
ggttcttcgc gttgcatcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540
attcatttga gttttaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtcgactta acgcgttagc 600
tccggaagcc acgcctcaag ggcacaacct ccaagtcgac atcgtttacg gcgtggacta 660
ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcac ctgagcgtca gtctttgtcc 720
agggggccgc cttcgccacc ggtattcctc cagatctcta cgcatttcac cgctacacct 780
ggaattctac ccccctctac aagactctag cctgccagtt tcgaatgcag ttcccaggtt 840
gagcccgggg atttcacatc cgacttgaca gaccgcctgc gtgcgcttta cgcccagtaa 900
ttccgattaa cgcttgcacc ctccgtatta ccgcggctgc tggcacggag ttagccggtg 960
cttcttctgc gagtaacgtc aatcgctaag gttattaacc ttaacgcctt cctcctcgct 1020
gaaagtactt tacaacccga aggccttctt catacacgcg gcatggctgc atcaggcttg 1080
cgcccattgt gcaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctggacc gtgtctcagt 1140
tccagtgtgg ctggtcatcc tctcagacca gctagggatc gtcgcctagg tgagccatta 1200
ccccacctac tagctaatcc catctgggca catctgatgg catgaggccc gaaggtcccc 1260
cactttggtc ttgcgacatt atgcggtatt agctaccgtt tccagtagtt atccccctcc 1320
atcaggcagt ttcccagaca ttactcaccc gtccgccgct cgtcacccga gagcaagctc 1380
tctgtgttac cgctcgactt gca 1403

Claims (9)

1.一种产气肠杆菌联用产气克雷伯氏菌的菌剂，其特征在于，所述菌剂用于治理铅镉污染土壤，所述菌剂包括产气肠杆菌和产气克雷伯氏菌；
其中，所述产气肠杆菌为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)W6，拉丁文分类命名为Enterobacter aerogenes，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22888；
所述产气克雷伯氏菌为产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)Wn，拉丁文分类命名为Klebsiella aerogenes，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22889。
2.一种如权利要求1所述的菌剂在治理铅镉污染土壤中的应用。
3.一种治理铅镉污染土壤的组合物，其特征在于，包括组分A、组分B、组分C和组分D；
其中，所述组分A包括磷源；
所述组分B包括如权利要求1所述的菌剂；
所述组分C包括含葡萄糖、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵和氯化钾的水溶液；
所述组分D包括含胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的水溶液。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述磷源为磷酸三钙。
5.一种铅镉污染土壤的治理方法，其特征在于，采用如权利要求3或4所述的组合物对铅镉污染土壤进行治理。
6.根据权利要求5所述的铅镉污染土壤的治理方法，其特征在于，包括：在第一时间段向待治理的土壤中施加所述组分A、以及含所述组分B和所述组分C的第一混合液；
在第二时间段向所述待治理的土壤中施加含所述组分B和所述组分D的第二混合液；
其中，所述第二时间段晚于所述第一时间段。
7.根据权利要求6所述的铅镉污染土壤的治理方法，其特征在于，还包括：在所述第一时间段和所述第二时间段之间，向所述待治理的土壤中施加所述第一混合液。
8.根据权利要求7所述的铅镉污染土壤的治理方法，其特征在于，
在所述第一时间段和所述第二时间段之间，向所述待处理土壤中多次施加所述第一混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量一致；
在所述第二时间段，向所述待处理土壤中多次施加所述第二混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量一致。
9.根据权利要求6-8任意一项所述的铅镉污染土壤的治理方法，其特征在于，所述第一时间段和所述第二时间段的间隔时长为14-16天。
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